文摘
精子发生是持续增殖和分化的精原干细胞(精原细胞)。然而,分子控制这些过程在很大程度上仍未知。这里,我们开发了一个简化的高浓度血清系统文化的小鼠精原细胞。精原细胞标记和移植的结果分析表明,培养spermatogonia保留长期后干细胞特性在体外传播。使用这个文化系统,表达和功能的骨形态发生蛋白4 (BMP4)进行了探讨。疣状显示,BMP4主要表现在生殖细胞,其水平增加精子形成过程。BMP4受体BMPR1A spermatogonia BMPRII在场,精母细胞和精子。此外,尽管这两个基因的mrna在鼠标支持细胞,只有BMPRII检测采用免疫印迹分析。虽然外生BMP4本身没有诱导的表达Stra8和c - kit,两种区分spermatogonia标记基因,一个重要的合作BMP4和维甲酸(RA)被观察到。此外,预处理的培养spermatogonia BMP4拮抗剂的大脑可以抑制RA-induced这两个标记基因的表达。总之,BMP4可能起到自分泌作用和行为态度与RA诱导spermatogonia的分化体内。
1。介绍
哺乳动物精子发生是一个高效和有组织的细胞增殖和分化的过程,导致的生产几乎无限数量的精子在男性的生活(1]。这个系统在精原细胞,能够自我更新和分化依赖于外在和内在的线索2]。利用发现GDNF刺激SSC生存和增殖在活的有机体内(3),两组小鼠精原细胞[首先建立了长期文化4,5]。在大多数研究中,精原细胞培养的启动需要低浓度的胎牛血清(FCS)除了几个关键生长因子(6]。尽管最近建立了血清和feeder-free文化系统,包含血清产品如BSA和胎球蛋白,这可能包含其他污染物质,不仅导致变量通过时间和菌落形态也提出了质疑真正的化学定义系统可行的文化精原细胞(7,8]。值得注意的是,一些研究已经表明,精原细胞也可以重组精原多能干细胞,为三个胚胎胚芽层与种系传递一定的文化条件下高浓度的FCS没有引入外源基因(9- - - - - -11]。然而,重组效率和重现性很低,底层机制是未知的。在目前的研究中,我们报告,精原细胞可以培养胚胎干细胞(ESC)中补充GDNF和bFGF只要33个段落(6个月)没有ESC-like克隆的观察。
骨形成蛋白(bmp),这属于TGF -β总科,广泛表达在老鼠胚胎发生中起重要作用在成人和男性生殖生物学(12]。TGF -β总科成员函数被绑定为或形成异种的受体复合物含有I型和II型serine-threonine激酶受体(13),这两个是必不可少的信号转导13- - - - - -18]。骨形态发生蛋白4 (BMP4)是重要的生殖细胞分化和生存19- - - - - -21]。在目标BMP4基因的敲除小鼠原始生殖细胞的生成导致失败(包括)22,23]。BMP4也是必要的包括本地化的生殖嵴和生殖嵴的生存24]。产后睾丸,一份报告显示,BMP4表达支持细胞和刺激的c - kit表达培养spermatogonia [25),而另一项研究表明,BMP4是类风湿性关节炎主要表现在spermatogonia和启动恢复通过BMP4表达式的抑制精子发生维生素缺乏的小鼠(VAD) (19]。胡锦涛等人发现,BMP4信使rna是本地化主要在精母细胞和其他细胞,包括塞尔托利氏细胞,在较少的程度上26,27]。这些差异需要进一步澄清的本地化BMP4产后小鼠睾丸和精子发生的功能。
生殖细胞在胚胎双电位的一开始,和他们的最终命运是由RA中肾管生产的(28,29日]。Retinoic-degrading酶CYP26B1阻止生殖细胞启动减数分裂在雄性小鼠性腺在胚胎发生(28,30.]。在通过鼠标,只有在早期阶段存在生殖细胞(19)和对齐的分化类型()spermatogonia抑制(31日- - - - - -33]。重要的是能力在RA管理spermatogonia区分恢复。
鉴于RA和BMP4各种生物过程中扮演很重要的角色,他们之间的互动也就不足为奇了在体外和在活的有机体内在几个系统。例如,BMP2和BMP4已被证明与RA信号诱导细胞凋亡的P19胚胎细胞癌(34,35]。在脊椎动物中发现胎儿四肢,BMP信号也是调解RA-induced interdigital细胞凋亡(36]。而很明显,RA和BMP4男性生殖能力是必要的,这些信号通路相互作用是否在生殖细胞尚未确定。在这项研究中,我们检查了BMP4及其受体的表达在产后生殖细胞和支持细胞。此外,我们的目的是调查是否BMP4和RA可以合作规范Stra8的表达,基因启动刺激的RA的减数分裂(37)和c - kit的表达式是激活区分spermatogonia [38利用培养老鼠spermatogonia]。
2。材料和方法
2.1。试剂和实验动物
重组鼠GDNF和bFGF,重组人类BMP4因素,和鼠标anti-BMP4主要抗体来自研发系统(明尼阿波利斯,美国)。RA是购自σ(Sigma-Aldrich)。兔子反RET (sc - 167)和GFRa-1 (h - 70),山羊反BMPRII (G-17)和β肌动蛋白多克隆抗体,FITC - TRITC-conjugated anti-rabbit,和山羊二级抗体来自圣克鲁兹(圣克鲁斯、钙、美国)。鼠标对PLZF马伯,DNase我和IV型胶原酶来自Calbiochem(默克公司,达姆施塔特,德国)。山羊对人类波形蛋白多克隆抗体和FCS (ES cell-qualified)和ESGRO生活来自Chemicon(美国Billerica的)。兔子和BMPR1A DAZL抗体来自Abcam,和兔子p-Smad1/5/8抗体从细胞信号技术(美国贝弗利,MA)。高糖DMEM是从Hyclone, Trypsin-EDTA DPBS和0.25%来自Gibco(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。DBA / F1 C57小鼠从北京获得Weitong河实验动物Inc .)中国。Ub-eGFP-lentivirus买了从上海GeneChem公司(GeneChem、上海、CN)。所有协议都是动物保健和使用委员会批准的动物学研究所中国科学院。
2.2。细胞培养条件
ESC介质由DMEM(4.5克/升的葡萄糖)补充15% FCS, 1 x NEAA, 50μM 2-mercaptoethanol 1 x丙酮酸钠,2毫米谷酰胺,青霉素100单位/毫升、100单位/毫升链霉素,103单位/毫升的生活,储存在4°C和可用于3周。40 ng / mL GDNF和10 ng / mL bFGF前不久被添加到ESC媒介使用SSC介质。小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)细胞被隔绝在DMEM培养基培养CD1小鼠胚胎,13.5天的时间补充10% FCS, 50μM 2-mercaptoethanol, 2毫米谷酰胺,抗生素。支线层的制备,MEF细胞治疗与丝裂霉素C (10μg / mL,罗氏)2.5小时,然后镀的密度5×104细胞/毫升井预镀0.2%明胶(Sigma-Aldrich)。所有细胞都维持在37°C和5%公司的氛围2。可以使用MEF细胞24小时后的电镀和可行的一周。
2.3。隔离和鼠标Spermatogonia的集合
从4-5-day-old Spermatogonia小狗老鼠由两步酶消化后协议(39)做了一些调整。简而言之,无荚膜的睾丸组织处理1毫克/毫升胶原酶IV型和1毫克/毫升DNase我在DPBS与温和搅拌5分钟,然后在50×g离心2分钟紧随其后3洗DPBS去除间质细胞。收集标本处理0.25% Trypsin-EDTA和1毫克/毫升DNase我另一个5分钟37°C和温和的风潮。随后,FCS添加15%的最终浓度终止消化。细胞被洗两次通过离心600×g DPBS 5分钟。颗粒在精原细胞生长介质resuspended,镀0.2% (w / v) gelatin-coated组织培养皿的密度2×105细胞每厘米2和培养36-48小时。中被和细胞与DPBS洗一次,轻轻用移液器吸取分离精原生殖细胞的体细胞,并在600×g离心5分钟。生殖细胞在精原细胞培养基和镀resuspended MEF支线层。
2.4。培养Spermatogonia BMP4和RA治疗
大约2000 laminin-coated板上培养的细胞为15%或1% FCS-containing中GDNF和bFGF 24小时和6小时BMP4治疗前血清饥饿。Spermatogonia刺激了100 ng / mL BMP4 1小时和固定4% PFA进行进一步分析。关于2×105MEF和治疗上培养的细胞和蛋白质一样收集进行免疫印迹分析。BMP4的检测和/或RA-induced精原细胞分化,2×104spermatogonia镀在MEF馈线BMP4处理24小时然后RA BMP4的存在继续文化添加了显示时间。收集细胞RNA制备和实时PCR分析。
2.5。移植和分析
DBA / ICR F1杂种雄鼠被用作接受者。首先,4-6-week-old小鼠治疗40毫克/公斤白消安耗尽内生睾丸的生殖细胞(40,41]。慢病毒感染,慢病毒被添加到介质在20莫伊(感染复数)5μ克/毫升聚凝胺。媒介在转染后8 - 10小时,细胞被维护在体外扩散。睾丸移植,大约40岁μL的病毒转染供体细胞悬架(6×105细胞)注入受体小鼠的睾丸细精管通过传出管(39),约70%的小管。六个月后移植,睾丸收集进行分析。
2.6。精母细胞的制备、圆形精子细胞细胞和支持细胞
高纯度小鼠精母细胞,精子细胞细胞被孤立使用单元格大小从成年小鼠睾丸细胞悬浊液分馏通过沉积单元的牛血清白蛋白梯度重力美女协议(参见图S4A-C后在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/9536192)[42]。塞尔托利氏细胞培养的过程后发表之前(43]。
2.7。疣状
IFA染色,细胞被固定为4% PFA其次是治疗0.1%与BSA Triton x - 100和阻塞。样品被孵化一夜之间在4°C表示主要抗体。非特异性免疫球蛋白作为消极的控制。然后,样本清洗三次PBST孵化和FITC -或者TRITC-conjugated二级抗体。细胞核的细胞与DAPI染色。与石蜡疣状部分,deparaffinization和抗原检索后,后协议如上所述。荧光图像捕获71年第九奥林巴斯显微镜下,和图片相结合,在Adobe Photoshop 7.0处理。
2.8。RNA提取,rt - pcr和实时rt - pcr
总RNA提取使用TIANGEN RNA Pre微设备根据制造商的指示。逆转录执行使用益生元(dT)启动和M-MLV逆转录酶(Promega)后,制造商的指示。PCR引物被列在表中1。PCR产品被在1.5%琼脂糖凝胶电泳分离。实时rt - pcr进行ABI 7500序列检测系统,分析了ABI 7500软件。
2.9。免疫印迹分析
在4°C细胞收获和单一化裂解缓冲含有的蛋白酶抑制剂混合物(P8340σ)。总蛋白质被转移到聚乙二烯二氟化物膜后sds - page,阻止了5%的无脂牛奶然后杂化的主要抗体。杂交后HRP-conjugated二级抗体,免疫复合物被发现使用西方Supersignal Pico检测试剂(皮尔斯)。
2.10。统计分析
所有实验至少重复三次,除非另有说明。微的西方墨点法与GAPDH是使用一个软件的数量进行内部控制。值提出了均值±标准差(SD)的三个独立的实验。统计上显著差异(或)组间方差分析和测定图基期末测验使用SPSS统计软件(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。
3所示。结果
3.1。建立一个简化的鼠标Spermatogonia长期文化系统
建立SSC文化在体外,睾丸细胞被孤立使用修改后的两步酶消化法(39]。24-36小时后孵化ESC中补充了40 ng / mL GDNF,体细胞坚持严格gelatin-coated菜和生殖细胞,杰出的大尺寸,连接松散的体细胞。生殖细胞在这个阶段被认为是通过0 (P0) spermatogonia文化(图1(一))。生殖细胞被转移到小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)馈线第二个培养皿的细胞温和吸量;在ESC培养基培养生殖细胞在这个阶段是补充GDNF, FGF2,制药业和被认为是通道1 (P1)。细胞后的段落被保持在同一介质。尽管大多数体细胞可以删除在这一步中,其中一些仍然。因此,精原团被机械地收集和镀到新鲜馈线第一2 - 3层的通道(图S1A)。在这个阶段,剩下的体细胞坚持严格的支线层和生殖细胞形成小块(图1 (b))。从第三段,生殖细胞是通过使用0.25% Trypsin-EDTA 1: 3稀释到MEF喂食器每隔5 - 7天。2 - 3周,文化达到一个相对稳定状态并继续生成块相似的形态。两株spermatogonia已经通过了6个月(P33)在体外(图1 (c))。这种方法可以用来建立文化4-5-day-old动物的DBA / C57 F1或DBA / F1 ICR小鼠。与先前的报道一致,GDNF是必不可少的长期鼠标spermatogonia和它的文化,在浓度10 ng / mL的媒介,就足以支持的长期扩散spermatogonia(图1 (d))。
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3.2。表征Spermatogonia培养老鼠
疣是培养spermatogonia用来描述。团形成的早期(P3)(数据2(一个)和2 (b))文化和长期(6个月在体外P33)(数据2 (c),2 (d)印地,C)阳性DAZL,生殖细胞标记(44),并且仓促,一个精原细胞标记45]。进一步确认这些spermatogonia培养的干细胞活性,6×105GFP-expressing精原细胞被注入busulfan-treated成人受体小鼠的睾丸。移植后6个月,接收者的老鼠牺牲进行分析。绿色spermatogonia可能在细精管和恢复精子形成(图2 (e))。重要的是,绿色spermatogonia细精管可以分化为生殖细胞在不同阶段(数字2 (f),2 (g)和S2)。这些结果证实在精原细胞的存在文化用鼠标ESC培养基GDNF和FGF2提供。
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3.3。BMP4的表达及其在生殖细胞受体亚基
使用简化的精原文化系统,我们决定研究BMP4的SSC分化的功能在体外。rt - pcr分析首先显示mrnaBMP4及其受体BMPR1A,BMPRII,ActRII,和ActRIIB中培养spermatogonia、支持细胞和孤立的成人精母细胞以及圆形精子(图3(一个))。免疫印迹结果进一步表明,蛋白质BMP4的过早和成熟形式主要是表现在精子发生的细胞,尤其是在成人精母细胞和精子(数字3 (b)和3 (c))。有趣的是,蛋白质BMPRII但不是BMPR1A出现在塞尔托利氏细胞,这意味着没有一个完整的BMP4在这些细胞信号通路。此外,免疫印迹分析也显示增加BMP4蛋白质表达小鼠睾丸开发进展通过出生后1到56天(数字3 (d)和3 (e))。
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测试是否培养spermatogonia BMP4因子分泌到培养基,MEF的媒体,滋养细胞,spermatogonia,葡京赌场preleptotene精母细胞细胞系GC-2 [46(图)收集免疫印迹分析3 (f))。结果表明,培养spermatogonia GC-2但不是MEF和支持细胞可以分泌蛋白质BMP4介质。
BMP4的表达在小鼠睾丸,睾丸细胞培养,spermatogonia随后通过免疫荧光染色检查。蛋白质BMP4 7-day-old老鼠睾丸部分,主要是局部DAZL-positive生殖细胞(图4(一)箭头),同时,在成年小鼠睾丸部分,BMP4主要表现在精母细胞(图4 (b)箭头)和精子(图4 (b)箭头)。令人惊讶的是,在孤立4-5-day老鼠的睾丸细胞,BMP4主要coexpressed DAZL-positive细胞(数字4 (c)和4 (d)箭头)和较少的程度在支持细胞(图4 (d)箭头)。BMP4蛋白质也表达了P3(图4 (e))和P33(图4 (f))培养spermatogonia。这些结果表明,BMP4主要是由在小鼠睾丸生殖细胞。
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3.4。培养Spermatogonia回应与Smad1/5/8 BMP4刺激激活
以前的研究报道,bmp诱导的磷酸化R-Smads (Smad1、Smad5 Smad8)发挥其功能(47]。评估培养spermatogonia BMP4刺激的反应在当前的文化系统,细胞治疗100 ng / mL BMP4因素1小时。Immunofluorescent化验(IFA)透露,BMP4可以激活,诱导血清(核磷酸化Smad1/5/8积累数据5(一个)和5 (b)血清)和15%(数据5 (c)和5 (d))中。免疫印迹分析进一步证实了IFA结果而p-Smad1/5/8水平BMP4治疗后显著增加;总蛋白水平没有明显改变内部GAPDH控制(数据规范化5 (e)- - - - - -5 (g))。这些结果显示一个完整的BMP4的存在在培养spermatogonia信号通路。
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3.5。BMP4合作与RA诱导培养Spermatogonia Stra8和c - kit表达
我们下一个探索培养spermatogonia differentiation-inducing BMP4的函数。实时PCR分析第一次被用来评估Stra8的表达,在这些细胞接受BMP4 c - kit。出乎意料,BMP4治疗24或48小时没有增加Stra8的表达和c - kit培养spermatogonia(图S3A-D)。因为RA是必要的在产后睾丸精原成熟和进入减数分裂前期(48,49),然后分析RA治疗的影响这些分化标记的表达。正如预期的那样,RA治疗可以显著提高Stra8和c - kit表达的价格相比对照组(数字6(一)- - - - - -6 (d))。有趣的是,预处理的spermatogonia BMP4 24小时,然后用RA刺激,Stra8的表达显著增加8点,只与RA组(24小时数字6(一)- - - - - -6 (b))。同样,c - kit BMP4 + RA组的表达也显著高于在RA只有RA组8小时后刺激(图6 (c))。重要的是,预处理spermatogonia‘诺金’,BMP4拮抗剂(50,51),可以明显减少RA-induced Stra8(图6(一))和c - kit(图6 (c)只)表达与RA组8小时后刺激。最后,实时PCR法评估RA治疗是否可以改变在培养spermatogonia BMP4(图的表达6 (e))。结果表明,BMP4表达显著提升了RA的刺激。这一发现与西方印迹结果在图是一致的3 (d),这表明BMP4更高更差异化的生殖细胞。这些结果表明,BMP4可以合作与RA诱导精原细胞分化标记的表达Stra8和c - kit。
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4所示。讨论
研究者一直梦想制造精子,在培养皿中不仅纠正某些类型的男性不育也更方便地研究精子发生的机制(52]。有两个主要障碍的成就目标增殖和诱导分化的精原细胞在体外。当前的标准协议中描述的中精原文化包含许多组件,尚未完全阐明的角色4,5]。一些研究声称,一些代理的质量,如血清、BSA,脂质,是至关重要的成功的SSC文化(5- - - - - -7,53]。不幸的是,没有保证得到正确的批次的这些代理商业;因此文化的质量控制系统是麻烦的。血清和feeder-free文化系统近日报道仍然使用serum-derived产品,如BSA和胎球蛋白,保持的可能的污染物作为机械的研究和应用前景的担忧8]。自产品从血清是不可避免的,我们决定建立一个简化的系统,包括高血清浓度而不是其他组件,如BSA和脂质。我们使用DMEM补充15% FCS,三个生长因子(生活、GDNF和bFGF),和一些常见的nongrowth因素组件,如非必要的氨基酸,谷氨酰胺。这相当于鼠标ESC培养基补充GDNF和bFGF。长期精原文化可能会经常建立,与最大文化时期的33个段落超过6个月。长期培养spermatogonia含有干细胞的移植化验。大多数研究使用低浓度血清(0.04 - -1%)精原文化4,6,53,54),一些人甚至报告一个有害的血清对细胞的影响(5,55)而另一些人声称的外观在ESC ESC-like克隆中含有高浓度血清。因为我们文化精原细胞高血清浓度,我们认为它可能是质量而不是血清的浓度决定精原细胞文化的成功。此外,我们从来没有观察到任何ESC-like殖民地在整个实验期间,表明这种重组过程确实是一个罕见的事件。总之,我们的系统是一个简化的一与其他系统相比,它与其他类似的GDNF依赖性,长期文化时期,和干细胞的维护活动。
虽然几个蛋白质分泌因素增强细胞的增殖(已报告4,5,56- - - - - -59),spermatogonia differentiation-inducing因素定义糟糕的。BMP4的表达在睾丸仍缺乏定义。而一项研究表明,BMP4 mrna在支持细胞中发现的4 - 7民进党老鼠而不是spermatogonia在同一阶段,另一个显示,在成年小鼠睾丸生殖细胞是主要表现在早期阶段,包括spermatogonia和精母细胞早期,但缺席支持细胞(19,25]。胡锦涛等人发现,BMP4 mRNA在粗线期局部精母细胞,一个较少的程度,在其他生殖细胞(26]。在目前的研究中,我们证实BMP4 mrna存在于生殖细胞包括spermatogonia、精母细胞,和圆形精子以及体细胞塞尔托利氏细胞,表达的蛋白质主要在成人生殖细胞和支持细胞略。因此,Bmp4的表达在睾丸细胞发育调控和主要细胞来源的变化从塞尔托利氏细胞生殖细胞,和它的低水平表达在特定的细胞类型可以由先前的研究忽视了由于使用不敏感的检测方法。
TGF -β总科成员函数被绑定为或形成heteromeric受体复合物含有I型和II型serine-threonine激酶受体(26]。佩莱格里尼等人的研究表明,mrna的BMP4受体BMPR1A和BMPRII只检测到4 -和7-day-old鼠标spermatogonia [25]。在目前的研究中,我们检测到的表达BMPR1A和BMPRII信使rna和蛋白质含量在新生小鼠精原细胞,成人精母细胞和精子。而BMPR1A,BMPRII,ActRII,和ActRIIBmrna表达也在4-5-day-old鼠标支持细胞,发现BMPRII但不是BMPR1A蛋白质免疫印迹检测。佩莱格里尼等人显示mrna的BMPRIA无法检测到Northern 4民进党支持细胞的小鼠(25]。很可能BMPRIA mRNA水平很低,只能检测到rt - pcr但不是Northern,因此其蛋白质不能被西方墨点法容易。综上所述,看来,在成年小鼠,BMP4,多半以生殖细胞产生,执行绑定的自分泌功能对生殖细胞的受体复杂。
BMP4证据确凿的是包括生成和生存所必需的,因此可能参与精子发生的调控22,24,25,60]。而独自BMP4无法诱导热解色谱的形成,需要BMP8b BMP4-induced包括形成在养殖上胚层61年]。在人类子宫内膜基质细胞,TGF -β合作与RA诱导VEGF的表达(62年]。VAD鼠标、视黄醇可能被转换为其活性代谢物RA,启动恢复通过BMP4表达式的抑制精子发生spermatogonia [19]。在免疫系统中,RA和TGF -之间的协同作用β诱导Foxp3+T细胞诱导的至少3倍TGF -β独自一人(63年]。之前的研究也表明,RA和BMP4协同诱导的细胞凋亡P19胚胎细胞癌(64年,65年]。这些研究表明,RA和TGF -的合作互动β家庭成员参与多样化的发展过程。
本研究的一个重要的观察是,BMP4和合作的RA诱导的mRNA表达Stra8和c - kit,两个基因参与精原细胞分化和减数分裂启动(66年,67年]。之前的一项研究报告说,BMP4治疗生殖富含文化从第四天小鼠睾丸诱导增加c - kit的激酶活性,表明c - kit(蛋白质含量增加25]。我们无法检测的mRNA水平增加c - kit BMP4治疗后培养的小鼠精原细胞,BMP4似乎调节转录翻译相反的c - kit。我们观察到的mRNA水平c - kit和Stra8调节RA与周等人的研究是相一致的。(68年]。更重要的是,预处理BMP4的细胞可以增加Stra8和c - kit的mRNA表达水平明显高于只与RA组。BMP4本身可能是无法诱导精原细胞分化只是准备适应其他环境信号(s)如类风湿性关节炎、生产管制相当复杂的方式在活的有机体内(69年,70年]。否则,精原细胞池可能会耗尽出生后不久,因为differentiation-inducing BMP4自分泌的信号。目前的研究提供了新的视角理解自分泌的角色和环境因素,在哺乳动物精子发生调控细胞的分化。
信息披露
Yongguang杨目前的地址是美国癌症生物学,Vontz分子研究中心,辛辛那提大学医学院,辛辛那提,哦,45267,美国。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Yongguang杨和Yanmin冯了同样的工作。
确认
作者感谢羌王博士(中科院动物研究所)提供对磷酸化Smad1/5/8抗体。本研究支持中国国家基础研究计划(2013年2015 cb943002 2012 cb966702, cb945001)和中国国家自然科学基金(31271379和31271379)。
补充材料
补充数据补充数据包括4本文数据可以发现在线。