文摘

我们评估的有效性富含血小板血浆(PRP)结合同种异体骨髓间充质干细胞(bmsc)治疗骨质疏松性骨切除卵巢的老鼠模型中存在的缺陷。白天42受伤后,在活的有机体内microcomputed断层扫描(ct机)成像显示,骨缺陷控制的老鼠和切除卵巢的老鼠接受PRP和bmsc完全修复,而大鼠去卵巢后的骨骼状况处理PRP单独或综合治疗上比较慢。组织学与这些结果数据是一致的。我们也评估改变骨骨小梁在近端胫骨生长板。在切除卵巢的老鼠用PRP治疗或与PRP和bmsc,连接密度(Conn.D),小梁骨体积比率(BV /电视)和数字(Tb.N)缺陷区域显著增加从42天7天。这些结果表明,PRP治疗提高骨质疏松症骨微体系结构。此外,osteogenesis-specific标记基因的表达水平,包括RUNX2 OSX, OPN的小鼠有显著调节与PRP bmsc相比其他组。因此,我们得出这样的结论:PRP治疗结合bmsc显著促进骨质疏松性骨缺损的愈合。这项研究提供了一种替代方法治疗骨质疏松性骨质流失的策略。

1。介绍

骨缺损的治疗,特别是在骨质疏松症的情况下,仍然是有争议的。“黄金标准”的自体骨移植是骨缺损的治疗,但这种方法是受制于有限的骨量和额外的问题造成的创伤手术部位(1]。同种异体骨移植可以解决问题相关的骨移植物的来源。然而,尽管移植骨可以提供一个支架osteoconduction和残余骨形态形成蛋白能促进骨愈合,强烈的免疫反应限制异体骨移植的临床应用(2]。先前的研究表明,女性在绝经后骨质疏松性骨折愈合和雌激素depletion-induced骨质疏松性动物非常延迟或受损3]。骨质疏松性骨折或骨缺损患者的数量随年龄逐渐增加的人口。因此需要找到一个更有效的治疗骨质疏松和骨缺损的愈合。

有人建议,老年性骨质疏松症是增加倾向向脂肪细胞分化伴随着减少骨骨髓间充质干细胞(bmsc) [4]。另外一个策略治疗骨质疏松症的可能因此涉及提高bmsc的增殖和成骨分化潜能(5,6]。激活富含血小板血浆(PRP)发布一些生长因子与伤口愈合和骨再生,包括转化生长因子-β1 (TGF -β1)、胰岛素样生长因子、血小板源生长因子,基本成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子(7]。最近的研究证实,PRP治疗可以改善整体在骨质疏松性小鼠骨质量,促进骨生成在骨髓抑制脂肪生成(8]。此外,PRP能刺激胚胎成纤维细胞的分化成osteoblast-like细胞;这些PRP-treated的移植细胞显著提高骨骼架构在小鼠骨质疏松性9]。它也证明了PRP治疗结合bmsc可提高新骨的形成(10,11]。然而,这种治疗是否有效的骨质疏松症仍然是未知的。

许多分子调节骨形成中扮演很重要的角色。的磷酸化runt-related转录因子2 (RUNX2)和诱导osterix (OSX)基因表达和碱性磷酸酶活性与骨形成相关(12]。骨桥蛋白(OPN)是一个著名的骨基质的成分。这些分子通常用作标记在成骨分化的评价在体外和在活的有机体内(13]。过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARγ2γ2)被描述为一个adipocyte-specific标记(14]。因此,这些标记可以用于监测bmsc的骨和脂肪生成之间的平衡在活的有机体内。

总的来说,这些观察让我们假设bmsc结合PRP治疗可以提高骨再生在骨质疏松性骨损伤。为了验证这个假设,我们使用bmsc和PRP源自雄性SD (SD)大鼠中治疗骨缺损大鼠去卵巢后的骨骼状况。愈伤组织形成和矿化不断监控用microcomputed断层扫描(ct机)分析。定量实时PCR用于确定骨愈合相关基因的表达水平。脱钙组织学是用来描述愈伤组织层面的组织病理学特征。

2。材料和方法

所有程序涉及动物实验动物保健和委员会批准广东医科大学和遵守的指导的护理和使用由美国国立卫生研究院的实验动物。

2.1。准备和Thrombin-Activated PRP治疗

老鼠PRP releasate准备如前所述[11)做了一些调整。短暂,五个女性健康SD大鼠(210 - 290 g)与水合氯醛麻醉(400毫克/公斤i.p),和一个池的血液从心脏收集管和肝素冲洗。血液离心两次:第一次在215 g×10分钟20°C去除红细胞在863 g×10分钟,然后获得PRP 20°C。PRP被激活与一个单位每毫升大鼠凝血酶(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。激活后,PRP releasate被离心分离细胞碎片在3000 g×20分钟在4°C,其次是通过0.2过滤μm过滤器。PRP releasate整除,储存在−80°C到使用。确保一致性在PRP利用率,TGF -β1浓度在PRP releasate是由一只老鼠TGF -β1酶联免疫试剂盒根据制造商的协议(美国圣地亚哥BD生物科学)和用作指标量化PRP所描述的其他地方(9,15]。TGF -的浓度β1在PRP releasate 102.12 ng / mL,评估了ELISA检测。最后一个750 pg / mL的TGF -的浓度β1在PRP-treated细胞或老鼠(即。,the PRP-containing medium was calibrated on the basis of a TGF-β1的浓度750 pg / mL)受雇在整个研究中,因为它已被证明,老鼠bmsc增殖在这样的条件下(16]。

2.2。隔离和老鼠bmsc的文化

老鼠bmsc孤立和扩大使用之前报道的方法有少量修改(17]。总之,骨髓是来自30-day-old SD大鼠的股骨和胫骨。骨髓细胞被刷新和离心机1.073 g / mL Percoll(法玛西亚,乌普萨拉,瑞典)密度梯度。从界面和收集的丰富细胞转移到培养瓶与杜尔贝科的修改鹰的中低葡萄糖(DMEM Gibco,大岛,纽约,美国)补充10%胎牛血清(Gibco) 37°C和5%的公司₂。在播种72 h,不依从细胞被丢弃,贴壁细胞与磷酸盐(PBS)洗两次。新鲜的完全培养基添加和替换每3 d。识别multilineage分化潜力,细胞向脂肪细胞分化诱导成骨细胞,和分化能力是衡量与油红O或茜素红染色使用Oricell分化工具包(美国Cyagen生物科学,圣克拉拉,CA)后,制造商的指示。表型特征,收获细胞孵化与藻红蛋白(PE)标记抗体(美国BD生物科学,圣何塞,CA)对CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD90和化验FACSCanto二世流式细胞分析仪(BD生物科学)。老鼠bmsc从段落2 - 6被用于后续的实验。

2.3。核扩散和克隆形成化验

细胞增殖是评估使用MTS细胞生存能力分析工具(WI Promega,麦迪逊,美国)根据供应商的指令。简单地说,5000个细胞被每一个96孔板和孵化与PRP完全培养基补充48 h。细胞生长在完全培养基没有任何治疗被用作控制。克隆形成试验是在[如前所述16]。

2.4。动物和外科手术

雌性老鼠从广东购买中国医学实验动物中心的初始重量g。所有的动物被随机分配到5组每组大鼠(20):虚假的操作组的老鼠收到PBS;Ovx组,老鼠切除卵巢的,然后收到了PBS;老鼠的Ovx-BMSCs集团切除卵巢的然后bmsc处理;Ovx-PRP组,老鼠切除卵巢的,然后与PRP治疗;和Ovx-PRP / BMSC集团,老鼠切除卵巢的,然后收到PRP和综合。骨矿物质密度(BMD)使用力量极限测试执行在活的有机体内成像系统(美国力量,Billerica的)在卵巢切除术。卵巢切除术和虚假的操作协议进行了如前所述[4]。老鼠被允许饲料常规卵巢切除术后三个月。BMD再次评估确认骨质疏松动物模型。1.5毫米直径在所有SD大鼠胫骨缺损是大约5毫米的近端胫骨生长板中空(图1(一))。相同的腿被用于每个组。洞被注入生理盐水冲洗去除腔的骨头碎片。随后,满心PBS缺陷区域,PRP (20μL),和/或bmsc (根据实验组细胞)。5从每组术后大鼠被牺牲在全身麻醉下腹腔内注射1%戊巴比妥钠(0.1毫升/ 100 g)在7天,14日,28日,42,胫骨收获。样本评估使用ct机、组织学染色和实时rt - pcr在每个时间点(见下文)。

2.5。在活的有机体内微ct成像和分析

使用在活的有机体内微ct成像(vivaCT 40、Scanco医疗、瑞士),骨小梁形态和BMD的变化在缺陷区域和控制区域跟踪动物随着时间的推移,在过去的六个星期。ct机分析70 keV的电压源,电流为114μ一个和10.5μ各向同性的决议。参数包括小梁连接密度(Conn.D),骨小梁体积比(BV /电视),小梁数目(Tb.N)和小梁的空间(Tb.Sp)计算生成的二进制图像使用微ct评估程序(6.1版本2)。

2.6。定量实时聚合酶链反应

愈伤组织样本与缺陷的实验老鼠。样品在液氮冷冻,粉碎,彻底的均质QIAzol裂解试剂(试剂盒,杜塞尔多夫,德国)。总RNA分离使用试剂盒试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。核糖核酸的浓度决定使用分光光度计。从0.5互补DNA合成μ使用上标3 g的总RNA合成第一链系统(表达载体)。成骨细胞的标记RUNX2的信使rna表达水平,OPN和OSX的PPAR adipogenesis-specific标志γ2被实时rt - pcr量化使用SYBR预混料交货Taq工具包(豆类生物、志贺、日本)和LightCycler 480 II仪器(罗氏诊断、巴塞尔、瑞士)。glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)看家基因mRNA水平正常化提供了参考依据。所有PCR反应进行了一式三份。引物用于实时rt - pcr表中列出1。

2.7。组织学分析

孤立的胫骨在neutral-buffered 10%福尔马林固定,调到70%的乙醇和9%甲酸脱钙。组织处理后,嵌入在石蜡标本。部分(5μm)沿胫骨切矢状轴轴和收集玻璃幻灯片之前deparaffinized被苏木精和伊红染色使用标准协议())。与盖玻片安装后,标本光学显微镜下查看和分析。

2.8。统计分析

数据表示为±SD方法。学生的显著差异进行了分析以及或单向方差分析紧随其后事后Newman-Keuls多重比较检验使用GraphPad Prism 6.0软件。值小于0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。BMD测定在SD大鼠骨质疏松症

弹道导弹防御系统的大鼠去卵巢后的骨骼状况确定在活的有机体内。没有显著差异在BMD实验群体治疗。此外,没有虚假的弹道导弹防御系统组治疗前后的差异。然而,虚假和切除卵巢的老鼠之间的显著差异在弹道导弹防御()。此外,术前BMD值相比,切除卵巢的组织表现出了弹道导弹防御系统手术后12周(),这表明我们成功地诱导骨质疏松模型(图1 (b))。手术后,没有死亡或股骨骨折观察整个研究。所有大鼠手术后能够正常行走20 h。

3.2。老鼠bmsc表征和PRP对细胞的影响

经过骨髓细胞被镀成烧瓶和培养大约两个星期。典型的纺锤状细胞出现并开始生长和分裂72 h后播种。殖民地出现6 - 9天后,成为融合性的2 - 3周后(数据没有显示)。老鼠bmsc孤立在章节2和4进行分析的能力区分脂肪形成的和成骨诱导后。脂滴被与油红O染色(图可视化2(一个)),钙沉积是由与茜素红染色(图2 (b))。表面标记表达式使用流式细胞术分析的基础上,细胞为阴性CD31、CD34、CD45和阳性CD29、CD44, CD90(图2 (c))。接下来,检查PRP对细胞生长的影响(扩散和集落形成)和分化能力在体外,综合治疗有或没有PRP, MTS化验,克隆形成化验,脂肪形成的/成骨分化进行了分析。我们观察到细胞的数量和殖民地形成PRP-containing媒体不仅仅是控制媒体(数字2 (d)和2 (e))。同时,仅当PRP未能诱导骨生成,茜素红染色,增加PRP成骨的介质急剧增加的数量茜素red-positive细胞(图2 (f)上)。此外,油红O染色显示,PRP无法触发脂肪生成单独使用时,没有明显的影响去当添加到adipocyte-inducing媒体(图2 (f)低)。

3.3。在活的有机体内ct机新骨形成缺陷分析网站

骨愈合过程中缺陷被监视周围的地区在活的有机体内ct机扫描7、14、28和42 d后受伤。中点冠状平面2 d(图3(一个))和三维(图3 (b))图像获取和重建。血肿是可见的在虚假的骨缺损区域,Ovx-BMSC, Ovx-PRP,和Ovx-PRP / BMSC老鼠7 d后受伤,虽然没有明显的Ovx组的血肿。伤后第14天,骨缺陷骗局和Ovx-PRP / BMSC老鼠大多关闭由于新成立的老茧。相比之下,只有薄老茧了Ovx-BMSC Ovx-PRP老鼠,也没有明显的老茧在Ovx大鼠。在损伤后28天,骨缺陷假象和Ovx-PRP / BMSC老鼠被老茧完全封闭的高密度和矿化。骨缺损区域在其他三组主要是由老茧,愈伤组织密度相对较低。42天后损伤,骨缺损完全愈合的虚假和Ovx-PRP / BMSC老鼠,和老茧主要是根据2 d冠状矿化图像。之间没有明显的区别愈伤组织和周围的骨组织。Ovx-BMSC Ovx-PRP老鼠,老茧增厚和矿化程度增加。相比之下,在Ovx大鼠骨缺损并没有完全封闭的。

为了确定改变骨骨小梁除了这些缺陷部位,ct机扫描拍摄的近端胫骨生长板。没有明显改变骨骨小梁Ovx或Ovx-BMSC老鼠从手术后7天42天。然而,骨卷Ovx-PRP和Ovx-PRP / BMSC老鼠在这期间显著增加(图3 (c))。BV /电视,结核病。N, Conn.D值在近端胫骨假组高于其他组。Ovx-PRP和Ovx-PRP / bmsc组,BV /电视,结核病。N, Conn.D缺陷区域的值显著增加从42天7天,而结核病。N和Conn.D值Ovx大鼠骨繁殖过程中(表下降2)。

3.4。定量实时PCR分析基因的表达在骨愈合

的信使rna表达水平RUNX2 OPN, OSX, PPARγ2老茧的骗局,Ovx-BMSC Ovx-PRP和Ovx-PRP / bmsc老鼠决定作为叠化值相对于那些Ovx组。RUNX2水平和OPN的表达从第七天稳步上升,达到14天之前减少从每天14 - 42(数字4(一)和4 (b))。而表达OSX水平稳步从第七天增加到28天,减少在所有组之后,水平明显下降Ovx-BMSC老鼠比Ovx-PRP / BMSC老鼠在14天、28天的评分(图4 (c))。表达水平的PPARγ2在虚假的表达下调,Ovx-BMSC Ovx-PRP,老鼠和Ovx-PRP / BMSC与Ovx大鼠相比,Ovx-PRP / BMSC的老鼠表现出更低的表达水平比Ovx-BMSC和Ovx-PRP老鼠(图4 (d))。

3.5。组织学分析骨愈合

7 d后诱导骨缺陷,有优势的混合物组成的软组织血肿和肉芽组织Ovx-BMSCs Ovx-PRP老鼠。骨缺损区充满了虚假的不规则纤维骨痂组织。新编织骨被确认在髓内地区和皮质差距Ovx-PRP / bmsc老鼠。然而,这些骨结构较低的密度和体积Ovx-PRP / bmsc组比虚假的组。白天42,骨缺损网站在所有组完全注满老茧。每个愈伤组织的厚度等于相邻的皮质骨和板层骨完全形成平行于虚假的骨干和Ovx-PRP / bmsc老鼠,而编织骨留在Ovx Ovx-PRP, Ovx-BMSCs老鼠。皮质的差距可以确定在所有组(图5)。

4所示。讨论

骨质疏松症是一种全身性骨骼疾病,其特征是减少骨量和骨结构的恶化导致骨折的风险增加(18,19]。降低绝经后妇女的雌激素水平下降BMSC数量和成骨分化能力是重要的贡献者老年性骨质疏松(20.]。PRP已广泛应用于各种临床过程由于其高浓度的生长因子和生物活性蛋白,影响骨愈合的伤害(7,21]。尽管没有确凿,似乎大多数研究支持PRP在骨再生的积极作用在活的有机体内(22,23]。然而,几乎所有以前的研究都是在正常的动物,这是不清楚PRP会受到骨质疏松症的影响。在目前的研究中,通过使用一个完善的骨质疏松性骨缺损动物模型,我们表明,PRP治疗结合bmsc可用于增强骨愈合。据我们所知,这是第一个研究的检验的功效相结合的PRP和综合治疗骨质疏松性骨缺损动物模型。

为了探索PRP的潜在机制和bmsc加速骨再生,我们分析了RUNX2 osteogenesis-related基因的表达水平,OPN和OSX的主要脂肪形成监管机构PPARγ2在骨愈合。我们发现RUNX2 OPN,通常和OSX调节后PRP和/或综合治疗。值得注意的是,这些基因的表达水平最高Ovx-PRP / bmsc组观察,表明积极的bmsc对骨形成的影响可能会增强PRP的存在。自从PRP显著提升bmsc的增长和成骨分化能力在体外,因此可能PRP会加速骨修复的bmsc移植增殖和成骨。相比之下,PPARγ2表达抑制,尤其是Ovx-PRP / bmsc老鼠。这些结果表明,PRP参与调停骨之间的平衡和脂肪生成在活的有机体内,这在某种程度上也可能导致PRP的积极作用在骨质疏松大鼠骨形成。

ct机已被证明是一个有用的工具,精确测量骨体视学的变化,体积,和微体系结构24]。在骨愈合的后期阶段,新形成的骨缺损区完全改造成cortical-like结构在虚假的和Ovx-PRP / bmsc老鼠,而重塑在Ovx-PRP不完整,Ovx-BMSCs, Ovx大鼠,观察2 d和3 d图像。缺陷的板层骨网站Ovx-PRP和Ovx-BMSCs老鼠比较薄,和愈合的程度与Ovx大鼠。这些结果表明,重构能力从编织骨板层骨可以影响各种治疗。这一发现与先前的研究一致涉及estrogen-deficient小鼠模型处理小鼠胚胎干细胞成骨细胞(25]。此外,近端胫骨生长板的三维重建显示,骨体积明显增加Ovx-PRP / bmsc和Ovx-PRP老鼠与Ovx大鼠。这些数据强化了这一观念:PRP可能是有用的在提高骨体积和治疗骨质疏松的病理条件。

5。结论

虽然ct机和组织学分析证实,PRP和综合治疗有利于骨愈合,这些分析不能确定到什么程度,多久外源性细胞作用于骨损伤。因此,应该使用替代进行进一步的实验在活的有机体内细胞跟踪技术,如与超顺磁性氧化铁标记或细胞追踪染料。这些分析将有利于引进外源性细胞的监测和识别。

总之,我们的研究结果表明,PRP和bmsc促进新骨形成。更好的结果通过结合这两种成一个单一治疗骨质疏松性骨缺损。PRP能促进bmsc的增殖和成骨分化,这可能发挥重要作用在骨修复的启动。我们的发现可能为小说的发展提供洞察力在骨质疏松性骨折愈合的治疗策略。

信息披露

博,Chengshuo黄,明艳赵应当被视为co-first作者。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Bo, Chengshuo黄,和赵明艳了同样的工作。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(81300368和81300368号),湛江地方政府竞争的具体财政资金分配(没有科学和技术项目。2014 a06005),医生科研基金广东医科大学的附属医院。BJ201508)。