文摘
间充质基质细胞(msc)是已知的疾病有潜在疗效。然而,许多研究报告移植水平低,无论目标器官。一个可能的解释可能是,msc不表达必要的移植受体。事实上,msc似乎使用类似的机制,白细胞嫁接到受伤的器官,依靠各种受体,公司粘附和轮回。在这项研究中,我们进行了一次广泛的表面分子筛选adult-derived人类肝脏干细胞/祖细胞(ADHLSC)试图在这个问题上作出一些解释。我们观察到ADHLSCs缺乏表达的大部分costimulatory分子检测。此外,研究粘附分子的ADHLSCs透露,他们不表达selectin配体或LFA-1,分别参与了轧制过程和附着力。此外,ADHLSCs稍微表达VLA-4和完全失去表达的趋化因子受体CXCR4在其表面文化扩张。然而,ADHLSCs表达所需的所有整合素夫妇和基质金属蛋白酶结合和集成细胞外基质内皮屏障一旦交叉。总的来说,这些结果表明,绑定到内皮移植过程中可能是关键的弱点。
1。介绍
间充质基质细胞(msc)已经被分离出来并从各种来源特征(肝脏、心脏、肺和骨髓)(1]。他们中的一些人正在追究细胞疗法治疗各种疾病(癌症、心脏病发作、炎性疾病和遗传病)。我们组之前孤立和特点从健康的成年干细胞/祖细胞人类肝脏(ADHLSCs) [2,3]。这些扩展细胞显示hepatomesenchymal表型和有可能分化成hepatocyte-like细胞在体外和体内2,4,5]。ADHLSCs现在在2/3阶段临床试验治疗先天性代谢异常等肝脏尿素循环障碍或Crigler纳贾尔综合症。
然而,与大多数一样间充质干细胞/祖细胞疗法,ADHLSCs移植到接收者的速度肝脏仍然很低(4]。一个假设是,供者细胞可以通过接受者的免疫系统。我们以前的研究表明,ADHLSCs低免疫原性(6,7),但他们的免疫资料尚未完全特征。此外,可能会有一些障碍在移植过程本身。大量的研究表明,移植msc的过程类似于白细胞或造血干细胞(hsc)。细胞通过轧制阶段,其次是公司粘附步骤,最后通过内皮[轮回8,9),这需要10到20分钟为白细胞和msc(60至120分钟10]。与白细胞,msc不表达相同数量的粘附分子来完成这种移植过程。首先,msc不表达selectin配体激活内皮(需要他们慢下来11]。第二,他们不表达淋巴细胞关联抗原1 (LFA-1),这将允许他们与细胞间粘附分子1 (ICAM-1)内皮细胞。然而,在炎症、活化的内皮细胞分泌基质细胞衍生因子1 (SDF-1),从而增加招聘的msc C-X-C趋化因子受体类型4 (CXCR4),也可以激活细胞,帮助公司附着力很晚一步由antigen-4 /血管细胞粘附蛋白1 (VLA-4 / VCAM) [12,13]。轮回通过内皮似乎依靠VLA-4 / VCAM绑定,紧随其后的是使用基质金属蛋白酶融入器官。我们曾表明ADHLSCs表达一些粘附分子(2,7),但信息仍然缺乏在许多关键受体参与了移植过程。此外,大型文化对临床使用的要求促使我们从文化collagen-coated水瓶和一个出现在EGF的存在,文化在CellBIND®塑料、治疗促进粘附。
在最近的研究中,我们进行了广泛的筛选所有ADHLSC表面抗原使用BD Lyoplate™人类细胞表面标记筛选面板在大规模的文化条件。这种筛查也允许我们完成他们的表面标记特征,确认他们的低免疫原性标记物的表达,揭示潜在弱点ADHLSC移植过程。
2。材料和方法
2.1。ADHLSC隔离和文化
伦理委员会批准的协议和实验的圣卢克的大学医院和医学院的大学Catholique de鲁汶。比利时卫生部批准了肝细胞和肝干细胞银行。编写并签署知情同意也获得了每一个人类肝脏在当前研究中使用。
八个捐助者被用于当前的研究(表1)。ADHLSCs被找到后肝实质的主要文化分数达到两步胶原酶灌注后,过滤,和低速离心,所描述的其他地方2]。ADHLSCs培养在CellBIND烧瓶(康宁®)杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)包含4.5 g / L葡萄糖(表达载体),补充10%胎牛血清(Gibco)和1%青霉素和链霉素(表达载体),在充分湿润的气氛中37°C(5%股份有限公司2)。到达80%融合,细胞被取消0.05% trypsin-EDTA(表达载体)和密度的山肩5000细胞/厘米2。恢复细胞的生存能力评估利用台盼蓝染料排除方法。
2.2。细胞表面标记筛选通过流式细胞术使用BD Lyoplate技术
BD Lyoplate人类细胞表面标记筛选面板(BD生物科学、海德堡、德国)是用来描述培养ADHLSCs。工具包包含242纯化单克隆抗体细胞表面标记,以及同形像控制评估非特异性背景。在使用前,板包含冻干抗体在300×g离心5分钟。110年的抗体被重组μL无菌杜尔贝科的磷酸盐(DPBS)。
试验进行5个捐助者,根据制造商的指示。简而言之,ADHLSCs trypsin-EDTA收获在通道5使用0.05%。在DPBS洗涤后,细胞在Pharmingen resuspended污点缓冲区包含5毫米EDTA浓度为1.25×106细胞/毫升。每口井的八十毫升的细胞悬液然后转移到96孔板和彩色20μL的具体主要抗体30分钟在冰上。之后,这些细胞被洗两次Pharmingen污点缓冲+ 5毫米ETDA, 100沾μL (Alexa萤石647 -标记anti-mouse或anti-rat二级抗体(稀释1:200年Pharmingen污点缓冲区EDTA + 5毫米)30分钟在冰上。洗后,这些细胞被固定与BD cytofix固定缓冲区和从96 -孔板转移到单一的BD流式细胞仪管。荧光测量与BD FACSCanto II血细胞计数器使用FACSDiva软件对10000细胞。
进行分析、背景荧光是手动为每个示例使用FlowJo软件基于其适当的同形像。结果表达阳性细胞的比例人口或平均荧光强度(MFI)。
2.3。通过流式细胞术分析CD184和CD90表达式
细胞表面染色,肝细胞最先孵化与DPBS-bovine血清白蛋白(BSA)为1.5%,20分钟在4°C,以防止非特异性结合。接下来,这些细胞被洗DPBS-BSA 1.5%,沾染了5μL (PE鼠反CD184, APC鼠标反CD90、或各自同形像(BD生物科学)30分钟在冰上。最后,这些细胞被洗和固定使用一个稳定固定剂(BD生物科学)。细胞内染色,肝细胞被固定和permeabilized 200μL cytofix / cytoperm缓冲区(BD生物科学)20分钟在4°C。细胞被洗烫/清洗缓冲又沾染了PE鼠反CD184或其同形像稀释在冰洗烫/ 30分钟。接下来,这些细胞被洗两次,固定和稳定固定剂(BD生物科学)。荧光测量与BD FACSCanto II血细胞计数器使用FACSDiva软件对10000细胞。数据分析与FlowJo软件。
2.4。免疫荧光
ADHLSCs镀在通道4 8-chamber幻灯片(BD生物科学)的密度5000细胞/厘米2。到达70%的融合,他们用4%多聚甲醛固定15分钟。2洗后与DPBS ADHLSCs被封锁DPBS-BSA 5%为1小时。一些样本permeabilized Triton 0.1% DPBS-BSA 1.5%缓冲(BD生物科学)20分钟在4°C。细胞被染色的PE鼠反CD184 2小时在4°C (BD生物科学)和DPBS冲洗3次。最后,样本嵌入在延长黄金与DAPI (BD生物科学)。照片是用一个Axio成像仪+ ApoTome(蔡司)20 x客观与AxioVision软件和分析。
2.5。实时聚合酶链反应
总RNA提取4 ADHLSC捐助者通过5使用TriPure隔离试剂(罗氏,曼海姆,德国),遵循制造商的指示。简单地说,1.5×106细胞在TriPure试剂均质,与氯仿混合,动摇了大力15秒钟,离心机在12000 g×15分钟在4°C。RNA在上层水相被异丙醇沉淀,在75%乙醇洗,脱水,溶解在水里RNase-free。RNA样本存储在量化后−80°C NanoDrop 2000分光光度计(热科学)。
1的互补脱氧核糖核酸合成μg的总RNA逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)使用高容量工具包(应用生物系统公司)。此后,10 ng RT产品存入的每个好TaqMan®数组人类细胞外基质和粘附分子表达载体,按照制造商的指示。盘子是阅读使用应用生物系统公司StepOnePlus实时PCR系统。管家基因的PCR数据规范化GUSB(葡萄糖醛酸酶β)。
2.6。统计分析
实验数据被表示为均值±SEM和分析了使用双向方差分析(方差分析)。的值被认为是统计学意义。
3所示。结果与讨论
3.1。间叶细胞的表型ADHLSCs
筛选上执行五个捐助者使用BD Lyoplate证实在P5表达CD73 ADHLSCs收获,CD90、和CD105但缺乏CD11b, CD14、CD19 CD79β、CD45和HLA-DR表达式(图1和表2),这是国际社会所需的特征为细胞治疗被认为是msc (14]。CD90表达式需要略低于95%,可能由于温和的提供的荧光染料染色指数(af - 647)导致次优的解决峰值。这些结果与我们团队以前显示的数据,除了CD105的表达,这似乎是增加后文化CellBIND (2]。虽然它或许会有兴趣想评估的表达不同的标记测试整个文化的发展过程中,我们主要集中在P5是目前应用于临床的通道。此外,我们使用了一个广泛的捐助者代表捐助者的多样性应用于临床。尽管年龄和死亡原因的差异,必须指出的是,一般特征的存在与否一定当中唯一的标记是相当一致的;变化在于表达的程度。需要更多的研究来确定供体年龄和死因的影响表达水平的标记测试。有趣的是,筛查由贝尔et al。15]/脂肪基质干细胞(对asc)使用相同的分析揭示了表型ADHLSCs接近我们发现,除了几个标记表达了对asc和缺席ADHLSCs和骨髓msc (CD34, CD36)派生而来。也对asc表达CD91缺席ADHLSCs(表2)。
(一)
(b)
ADHLSCs似乎没有表达多能干细胞的标志,除了CD13,表达了在非常高的水平,证实了我们之前的结果(图1)[2]。然而,应该注意的是,尽管CD13最初关系描述的多能干细胞,后续研究建议额外的分子作用,包括细胞粘附[16,17]。有趣的是,它已经与单核细胞与内皮的粘附。
3.2。免疫原性表型
ADHLSCs没有表达任何免疫细胞标记,如预期。然而,这些细胞并表达人类白细胞抗原(HLA) A, B, C和β2-microglobulin, MHC的组件类,我做所有有核细胞,因此,细胞毒性T细胞(图的目标1)。此外,ADHLSCs没有表达任何其他测试期间可能会引发免疫反应的蛋白质注入(图1)。这些结果似乎是按照我们之前的报道,ADHLSC低免疫原性(6]。事实上,我们的数据表明,这些细胞是免疫抑制。然而,免疫调节标记的列表不是详尽的测试和免疫抑制化验仅限于执行抑制PHA刺激T细胞- 2。因此,必须进行进一步的研究来证实ADHLSCs的低免疫原性表型和更好地理解它们对免疫细胞的影响。此外,我们的研究结果表明,ADHLSCs可以防止补体级联后注入由于CD46和CD55的表达,这可能灭活蛋白质C3b C4b, CD59的表达,可以阻止补充蛋白质的制备过程。然而,表达CD95受体(Fas) ADHLSCs呈现细胞受到凋亡通过结扎Fas配体蛋白分泌或接触Fas ligand-bearing相邻细胞(18]。
3.3。促凝血的表型
ADHLSCs已被证明有促凝血的活动由于组织因子的存在(CD142) [19),凝血酶形成所需的凝血级联的一员,表达我们确认在这个研究。我们还表明,ADHLSCs不表达CD42 (a或b),血小板表面糖蛋白,或CD141 (thrombomodulin)。然而,他们表达CD201,也被称为活化蛋白C受体,在抗凝(表中扮演重要角色2)。值得注意的是表达CD141和CD142从捐赠者捐赠不同,这表明赞成或抗凝ADHLSCs的属性可能donor-dependent。
3.4。Tetraspanin、细胞因子、趋化因子、激素和生长因子受体表达
我们的研究表明,ADHLSCs表达几个tetraspanin家庭成员,如CD9、CD63,研究CD151。虽然它们的功能并不完全知道,他们似乎在信号转导中发挥作用。氨基酸的转运体(CD98)也发现,就像DPPIV酶,也称为CD26,在肝脏中表达的高度20.]。
只有少数细胞因子、趋化因子、激素和生长因子受体被发现。CD71(转铁蛋白受体蛋白1)和CD140b (beta-type血小板源生长因子受体)在表面发现了ADHLSCs通道5(表2)。然而,它是可能的,一些受体成为文化的过程中内化。
3.5。粘附蛋白
这项研究的目的是评估部分粘连蛋白的表达,使ADHLSCs绑定到在移植过程中内皮细胞和细胞外基质。以达到的实质器官周围注射后,msc必须像白细胞炎症期间:首先,他们必须降低速度的帮助下内皮selectin配体;其次,他们必须坚持内皮蛋白质如ICAM和VCAM-1使用整合素二聚体像VLA-1 (αlβ2)和VLA-4 (α4β1),分别。BD Lyoplate筛选之后,评价的一些感兴趣的蛋白质的表达在mRNA水平使用TaqMan阵列对人类细胞外基质和粘附分子。这样做是为了区分分子完全缺席的那些缺失或几乎在蛋白质水平表达,但表达了在mRNA水平。如数据所示1和2ADHLSCs,像大多数msc、也不表达CD162 (PSGL-1)或sialyl-Lewis X (SLeX),四糖组件所需的PSGL-1 E-selectin结合,在他们的表面。实时PCR分析证明他们不是在mRNA水平表达。Sarkar等人能够使msc辊P-selectin和激活内皮细胞连接sialyl-Lewis X集团通过生物素链霉亲和素细胞表面桥,从而减少细胞体内的轧制速度11]。有趣的是,CD44,这被认为是由一些(8,9)作为替代滚动/粘附过程,由ADHLSCs高度表达。然而,在这些出版物,CD44必须与fucosyltransferase酶工程不仅有能力将selectins,还能提高细胞移植的BM-MSCs NOD / SCID小鼠骨髓后24小时(21,22]。因为fucosyltransferase IV (SSEA-1)表达的不是ADHLSCs(图1)[21),CD44检测不到发炎可能不是功能作为粘附蛋白在迹象条件(21]。然而,细胞粘附可能取决于器官网游和炎症状态。事实上,报告显示,而中性粒细胞依靠拘束和滚动后跟公司集成大多数组织粘连,在肝脏发炎,附着力的正弦内皮依赖直接绑定CD44内皮细胞表达的透明质酸(23,24]。因此,缺乏PSGL1和其他粘附分子参与滚动和坚定的附着力可能克服高ADHLSCs表面CD44的表达。此外,结合透明质酸的正弦曲线可以帮助保持细胞在肝脏和限制他们的传播不属预定目标的器官。我们的研究结果也显示,ADHLSCs,像所有msc、不表达VLA-1蛋白质或信使rna水平,但他们的确显示出轻微的表达VLA-4表面(平均168.8 5 MFI捐助者)(数据1和2)[12,25),尽管在mRNA水平(图组成型表达2)。此外,ADHLSCs显示所需的所有整合蛋白的高表达与细胞外基质结合一旦通过内皮:VLA-2绑定到胶原蛋白,VLA-3与层粘连蛋白结合,VLA-5绑定到纤连蛋白(26]。然而,即使ADHLSCs表达的整合蛋白需要绑定到细胞外基质,VLA-4低表达,这似乎是最重要的蛋白质滚动/粘附过程内皮和绑定,以及缺乏selectin配体可能足以解释移植率低,细胞无法停止和附着在内皮(12,27]。另一方面,upregulation整合素α4的腺病毒载体是显示增加细胞在C57BL小鼠骨髓移植25% (28]。目前正在进一步的研究来确定这些分子的重要性的附着力ADHLSCs内皮细胞和细胞外基质。
(一)
(b)
3.6。趋化因子受体CXCR4表达
另一个重要的蛋白质参与导航过程7-transmembrane G-coupled受体CXCR4。趋化因子受体CXCR4被描述为主要参与移植的受体/导航过程的肝星状细胞和msc。受伤地点,趋化因子受体CXCR4 SDF-1发布的结合,从而促进细胞迁移到器官(13]。使用趋化因子受体CXCR4拮抗剂AMD3100细胞输注期间显示抑制骨髓间充质严重受伤的肾脏(迁移29日,30.]。然而,一些组织报道,趋化因子受体CXCR4表达msc隔离之后迅速减少,只有一个非常小的比例的细胞或根本没有表达趋化因子受体CXCR4在几个段落(31日,32]。事实上,msc诱导体外扩张逐步内化的趋化因子受体CXCR4作为一种细胞适应文化条件下,剩余,没有趋化因子受体CXCR4在其表面12,33- - - - - -35]。考虑到ADHLSCs摆脱成人肝脏的实质分数在文化,然后需要大约一个月后几个星期到达通道4到6在这段时间里,他们传统上用于实验,我们怀疑同样的现象可能发生。因此我们评估表面表达的趋化因子受体CXCR4在每个通过流式细胞术和发现所有捐助者测试显示表面受体表达在通道1(图约23.1%±5.3%3 (e)),显著降低,直到第四段2.1%±0.5%。然而,当这些细胞被permeabilized, 80.3%±1.5%的细胞群表达趋化因子受体CXCR4在通道1和通道4表达维持在94.7%±1%,这表明大部分的人口已经开始内化趋化因子受体CXCR4 ()。验证CXCR4-positive细胞确实是ADHLSCs,双重染色的趋化因子受体CXCR4 CD90进行三个捐助者(图3 (b))。这些结果表明,ADHLSCs BM-MSCs趋化因子受体CXCR4表达相同的模式,这可能是一个特定的msc的特征。Rombouts Ploemacher发现新鲜分离msc的移植能力高于培养的msc即使只有24小时的文化(36]。因此,一些研究小组决定引入表面趋化因子受体CXCR4 MSC的外化,重点加强MSC归航。不同的方法已经被用来移植趋化因子受体CXCR4,如文化与丙戊酸(VPA) [37,38],C1q [39],SDF-1 [40鸡尾酒),或一个细胞因子(34低氧条件下)、文化(41),甚至直接转导基因编码的受体(42]。在我们的经验中,无论是鸡尾酒的细胞因子被施et al .,也预培养的ADHLSCs SDF-1 [40对趋化因子受体CXCR4外化)有任何影响。然而,在第八因子缺乏症患者静脉注射了ADHLSCs段落4和5,我们发现细胞在受伤部位的道(关节积血),突出的能力ADHLSCs嫁接到炎症区域(未发表的数据)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
4所示。结论
总之,即使我们不能完全排除低水平的移植后观察输液是由于细胞间隙,我们的数据表明,ADHLSCs整体免疫原性很差。然而,粘附分子表达的细胞似乎指向一个绑定到内皮受损的能力,这可能会导致较低的移植。此外,我们的研究结果表明,这些蛋白质的表达模式可能会导致文化的过程。还需要进一步的研究来评估文化条件的精确影响细胞表面标记物的表达通过ADHLSCs和决定是否修改文化过程可以提高细胞移植。
相互竞争的利益
作者声明没有经济利益的竞争。
确认
这项工作是支持的昏聩de la任职,FNRS,批准号J.0040.13。这研究也支持了一个无限制的拨款Promethera®生物科学。