文摘
青少年特发性关节炎(JIA),称为幼年型类风湿性关节炎,关节炎是最常见的类型的17岁以下儿童。它可能会引起后遗症由于缺乏有效的治疗方法。本研究的目的是探讨脐带间充质干细胞的疗效为佳(UC-MSCs)。十JIA病人接受UC-MSCs和收到第二个三个月后注入。一些键值如28-joint疾病活动得分(DAS28)、肿瘤坏死因子-α、il - 6和调节性T细胞亚群)进行评估。数据被收集在第一次治疗后3个月和6个月。DAS28得分2.6和3.2之间的10个病人是在三个月后注入。白细胞、ESR、CRP显著降低而显著增加,il - 6和TNF -亚群α被拒绝了。类似上面的变化值被发现后6个月。同时,非甾体抗炎药和类固醇使用病人的数量减少。然而,没有发现显著变化比较3和6个月的数据。这些结果表明,UC-MSCs可以减少炎性细胞因子,改善免疫网络效应,调节免疫耐受,并有效缓解症状,他们可能会提供一个安全的和贾治疗的新途径。
1。介绍
青少年特发性关节炎(JIA)是一种常见的风湿性疾病和残疾和失明的主要原因是在童年1]。贾的主要特征是慢性关节炎伴有系统性multiorgan参与。这种疾病可以分为三种类型:系统性,polyarticular, oligoarticular [2]。贾通常发生在2-16-year-old儿童特点的长期发热、皮疹、关节痛、白细胞增多。它可以影响受害者的成长和发展,是一个可怕的疾病治疗3]。迫切需要新的治疗方法。间充质干细胞(msc)可以从各种各样的组织如骨髓、脂肪组织、脐带、胎盘、肌肉(4,5]。msc显示对多个细胞谱系分化的能力包括成骨细胞和软骨细胞(6,7]。另一方面,msc是免疫抑制和immunoprivileged,显示高迁移和能动性,并可能秘密细胞因子来改善受损组织的修复;因此msc被用来治疗各种疾病在临床试验8,9]。之前我们报道的数据是从成人患者积极治疗类风湿性关节炎UC-MSC [10]。在这里我们报告第一次尝试使用我们的知识脐带间充质干细胞治疗贾(UC-MSC)。在这项研究中,10岁男童JIA病人病例治疗UC-MSC在两个时间点。
2。材料和方法
2.1。病人
贾十住院病人选择从我们部门可以追溯到2011年10月到2012年11月,根据美国风湿病学院标准,ARA [11]。患者由6个男性和4女性,男童岁。疾病的范围从1到12年。6例系统性类型贾,polyarticular型3例,1例oligoarticular类型。表中列出的详细信息1。病人被28-joint评估疾病活动得分(DAS28)。所有病人都高于3.2。DSA28 3.2和5.1点之间在8例,高于5.1分两种情况。红细胞沉降率(ESR) 8例患者是40到100毫米/小时和100毫米/小时以上的两个例子。c反应蛋白(CRP)在50到100 mg / L 5例和其他五个超过100 mg / L。白细胞计数(WBC) 10.0×10之间的所有患者9/ L和26.0×109/ L。所有的病人已多次与类固醇治疗,非甾体类抗炎药(非甾体抗炎药),疾病修饰治疗风湿病的药物(DMAIDS)和生物制剂,但治疗没有明显有利影响。
2.2。预试
外周血细胞因子水平测试之前和之后的治疗。外周血收集促凝血的管和离心5分钟3500转/分钟。然后将血清转移到EP管。每个管包含200毫升的血清和保存在冰箱−80°C进行进一步的测试。BD Multitest_IMK工具被用来检测肿瘤坏死因子的水平α血清中il - 6、多功能流LUMINEX 200是用于分析和检测。
调节性T细胞亚群)沾anti-CD4异硫氰酸荧光素(BD,编号为340133),anti-CD25-Allophycocyanin (BD,号码340939),和anti-Foxp3-PE (eBioscience,编号12-4776-42)。同形像统计图控制抗体或者使用。样本在黑暗中孵化15分钟和分析流式细胞分析仪(BD,流式细胞仪石中剑,美国)。图像和数据获取和保存。
2.3。准备UC-MSCs
UC-MSCs Alliancells研究所获得的干细胞和再生医学转化。UC-MSC收获是根据我们之前的研究(12]。简单地说,新生儿脐带收集,切约1毫米×1毫米×1毫米尺寸然后与0.1%胶原酶和0.125%胰蛋白酶消化为30分钟37°C。未消化的组织与过滤器被移除。过滤后,由1×10细胞被播种6/厘米2在塑料培养瓶含DMEM-LG / F12(美国σ),5% FCS(美国Gibco BRL)中,然后被放置到孵化器。中了5天后,不依从细胞被丢弃。每3天中被改变的一半。细胞能够坚持塑料和显示呈形态。收获细胞特征根据我们之前的研究12),由ISCT[建议13]。描述过程是按照我们之前的程序执行。细胞表面标记物如CD29、CD31, CD34, CD73, CD90、HLA-DR分析流式细胞术(BD,流式细胞仪石中剑,美国)。Isotype-matched正常小鼠免疫球蛋白被用作控制。图像和数据获取和保存。
2.4。msc的细胞质量控制
所有使用msc将首先分析肿瘤形成与琼脂克隆试验在体外。海拉细胞被用作积极控制。在注射之前,msc将调查几个测试细胞生存能力,细菌,真菌,支原体,endoxin。细胞生存能力分析是由2%台盼蓝染色法;活细胞的百分比必须超过95%。细菌检测、细菌自动报告系统BacT / ALERT-3D (Merieux)使用。当检测结果是负的(−)和其他检测指标合格,细胞培养过程将持续;当结果是阳性(+),细胞将被抛弃。对真菌的检测,吖啶橙染色法是使用MSC数字1 - 3×106。荧光测试500海里激发光。支原体检测,赫斯特33258年染色和图片被用于340毫米紫外线。内毒素检测样本所有文化传媒将检测鲎变形细胞溶解产物凝胶;欧盟标准不超过50 /代理。msc将进入临床应用只有以上测试结果是合格的。最后,msc与通道数小于6被用于所有的病人。
2.5。治疗
所有的10位病人接受了静脉输液治疗UC-MSC并细胞的数量是4×10交付7/ 40毫升。同时注入,病人有2 - 5毫克(按重量)的antiallergy地塞米松。注入之前,病人单独服用非甾体消炎药,DMAIDS,强的松的剂量后10 - 20毫克每天ACR的指导方针。所有的病人被给予三个月后第二次细胞注入。具体过程如图1。
2.6。疗效评价
DAS28用于评估临床疗效。DAS28低于2.6的分数表明疾病缓解,在2.6和3.2之间分表明疾病是在低活动,在3.2和5.1之间分表明疾病是适度活动,和一个分数高于5.1分表明疾病是在高的活动。CRP、ESR、炎症相关因子(TNF -α和il - 6)和Treg实验室的有效性进行评估。之前和之后进行后续3个月或6个月后细胞治疗。
2.7。安全评估
副作用事件记录在每个后续。肝、肾功能,心电图、x射线、血压等指标是定期检查以发现副作用,观察的结果情况。不适反应是分级如下:0没有不适,1是轻微的不适感对日常生活没有影响,2是温和的不适与负面影响日常生活和学习,3是中度不适明显影响日常生活和固定化,4 =严重不适和危及生命的事件。
2.8。统计分析
执行统计分析与微软Office程序Excel和SPSS(17.0)软件。测量每个捐赠者至少重复三次。概率()值的计算使用以及评估两组之间的差异。显著性水平是标记如下:和。意义给予了适当数量的星号或数字。
2.9。道德的声明
人类脐带的使用材料隔离,分化,描述人类脐带间充质干细胞衍生的道德委员会批准在Alliancells研究所干细胞和再生医学转化。细胞疗法是伦理委员会批准323年人民解放军医院和病人的父母签署同意UC-MSC的治疗。
3所示。结果
3.1。表征UC-MSCs
孤立的UC-MSCs进行评估是否满足最小条件建议国际社会的细胞治疗(13),塑料的依从性,多功能分化潜力转化为各自的间叶细胞谱系(骨的-和脂肪形成的),和间充质细胞标记物的表达。为此,孤立的纤维母细胞形态学和细胞显示进一步向脂肪细胞和成骨细胞的分化我们的先前的研究[12]。成骨分化是利用茜素红S染色确定钙沉积和去验证使用油红O染色(图2(一个))。此外,流式细胞仪分析了MSC特定的标记。数据显示,孤立的细胞表达间充质细胞标记CD29 (99.9%)、CD73(99.7%),和CD90(99.7%),如预期的那样,这些细胞为阴性CD31 (0.8%)、CD34(6.6%),和HLA-DR(1.3%)(图2 (b))。
(一)
(b)
3.2。msc的细胞质量控制
所有MSC样品的可行性是98%以上。msc在琼脂培养没有克隆形成与海拉相比,这表明msc从肿瘤的能力很低在体外(如图3(一个))。与赫斯特和吖啶橙染色法,只有msc沾着绿色和蓝色,分别(如图3 (b)和3 (c))。其他信号检测表明细胞不被真菌污染的和支原体。
(一)
(b)
(c)
3.3。DAS在第一次治疗后3个月的值
未发现副作用在UC-MSC后10位病人治疗。尿常规检测数据、肝功能和肾功能测试显示无显著差异。第一次UC-MSC治疗后,症状如发烧、皮疹并未在所有病人中观察到,在关节疼痛明显缓解。四个六个系统类型的患者,两三个multijoint类型的患者,oligoarticular类型病人达到缓解。10个病人的DAS28价值在2.6和3.2之间。白细胞的所有病人拒绝4.0 - -11.0×109/ L。在七个病人,它大幅下降,显示与正常孩子没有区别。ESR、CRP也显著下降。ESR值20到50毫米/小时和CRP值是20到60 mg / L。平均而言,亚群显示显著增加10个病人。在八的10个病人,Treg增加非常显著(),而在其他两个情况下,它不会增加通过比较预处理和后处理。水平的il - 6和TNF -α减少与整体比较治疗前后(如图4与橙色的列)。
3.4。DAS值在第一次治疗后6个月
所有患者接受第二注入UC-MSC在三个月后第一次输液。后续观测进行了三个月后第二次输液。DAS28值在2.6和3.2之间。白细胞、ESR、CRP显示持续下降趋势显著较前值注入。然而,它并不重要比第一次治疗后三个月。亚继续增加,但没有统计学意义相比,三个月后第一次治疗。水平的il - 6和TNF -α减少第一次治疗后三个月相比,没有统计学意义(如图4与绿色列)。风湿病药物的剂量,如非甾体抗炎药和强的松,第二个细胞治疗后逐渐减少。
3.5。在DIA后续研究数据
1年随访研究所有患者在第二次治疗;四是进一步跟踪2年。ESR、CRP值控制在较低水平,后1年。T细胞亚群比例在整个家庭显示无显著变化,哈克和DAS28值下降,关节症状明显改善,和il - 6和TNF的表达α保持在低水平。
四个病人保持跟踪2年;哈克和DAS28值下降。他们两个都无法独立行走但现在可以走路去学校。十个病人显示增强的速度在增长和发展平均5 - 10厘米高度的增加。两个在股骨头坏死患者没有聚合。
4所示。讨论
贾是结缔组织的恶性肿瘤之一,影响约1 1000名儿童在任何一年,大约在10000年拥有一个更严重的形式(14]。贾已被报道与环境、感染、免疫学、新陈代谢、内分泌、和其他因素;然而,详细的病因仍不清楚。有两个反应可能为发病机理共存。一个是体液免疫反应引起的免疫复合物形成主要由类风湿因子,是造成损害关节滑液的主要因素。另一种是细胞免疫反应,分泌和释放淋巴细胞因素包括多种球蛋白、免疫复合物形式与类风湿因子,并进一步激活补体系统的炎症反应(15]。传统的疗法并不有效,因为他们不能完全调整JIA病人的免疫反应。这或许可以解释为什么贾临床症状的反复发生。这也给了我们新的视角寻找探索方法修复患者的免疫反应。msc属于成人干细胞,主要来源于早期中胚层和外胚层。MSC在骨髓和首次发现在脂肪组织和脐带16]。msc被显示为一个潜在的再生医学,因为他们是多功能细胞来源,更重要的是可以秘密细胞因子调节免疫反应和修复受损组织(17,18]。例如,msc抑制白血病/淋巴瘤细胞增殖在体外在同种异体骨髓移植小鼠(19]。更多的证据证明发现免疫系统msc的详细规定。自体或同种异体的msc可以显著抑制T淋巴细胞的增殖和激活(20.]。UC-MSCs是未分化的原始细胞。UC-MSCs低免疫原性,因为他们不表达抗原的细胞成熟,不会被免疫系统(10]。另一方面,UC-MSCs在主机和生存时间长可以表达多种细胞因子和生长因子,如干细胞生长因子,角质细胞生长因子、激素、interleukin-15,改善组织修复和生长激素(21,22]。他们还可以减少巨噬细胞的激活和炎性细胞因子的表达23]。因此,UC-MSCs是一种有前景的候选细胞移植治疗的JIA病人(24,25]。
在这项研究中,10 JIA病人UC-MSCs对待。MSC输液后没有观察到的副作用。患者继续服用非甾体消炎药,DMAIDS和强的松。在第一次治疗后3个月随访数据有明显改善。DAS28得分低,达到了低疾病的活动。实验室结果还显示改进:白细胞、ESR、CRP、炎性细胞因子il - 6和TNF -α减少,而亚群显著增加。在三个月后第二个MSC输液,DAS28分数保持较低的活动水平和实验室结果保持稳定。白细胞、ESR、CRP、炎性细胞因子il - 6和TNF -α而降低亚群不断增加。UC-MSCs可以增加输出成熟的T细胞在胸腺和外周血的亚群数量(26]。然而,之间没有统计学意义的数据第一次输液后3个月和3个月后第二次输液。需要进一步调查的原因。治疗风湿病的药物的剂量减少具有良好的耐受性。1 - 2年随访研究的数据表明,患者病情稳定大幅促进身体发育,这表明UC-MSC治疗的长期疗效。
5。结论
我们的数据首次证明UC-MSC JIA病人治疗可以减轻症状和痛苦。这可能是通过修复病人的免疫系统调节的MSC释放细胞因子。进一步的研究可能会关注哪些因素是主要的监管机构和下游转导途径。
利益冲突
所有作者声明没有利益冲突,同意该论文的内容。
作者的贡献
李明,李余张,Hongtao贡献同样本研究和分享第一作者。
承认
这项研究是由军事医学和公共卫生计划(CLZ120GA23)。