文摘
1α,25-Dihydroxyvitamin D3(1,25 (OH)2D3),维生素D的活性代谢物(维生素D),增加肠道吸收的钙和磷酸盐,保持一个正确的平衡的骨重塑。维生素D对骨骼系统有一个合成代谢影响,关键是在促进成骨细胞的分化的人类骨髓间充质干细胞(hMSCs)。msc也可以隔绝不成熟的牙齿,牙芽:牙科芽干细胞(DBSCs)是成人干细胞,可以有效地进行成骨细胞的分化。在这个工作我们调查的影响维生素D DBSCs分化成成骨细胞。我们的数据表明,DBSCs,培养的成骨的媒介,分化成osteoblast-like细胞;维生素D治疗刺激成骨细胞的功能,提高表达的典型标记osteoblastogenesis喜欢RUNX2和胶原蛋白(胶原I),更重要的是,确定更高的矿化基质生产结节。
1。介绍
维生素D(维生素D)对许多生物过程是至关重要的,也就是说,脊椎动物的骨矿化,维护钙稳态,细胞增殖和分化。
维生素D的行为是由其活性代谢物,1,25-dihydroxycholecalciferol [1,25 (OH)2D3或骨化三醇),通过一系列的酶产生步骤从维生素d3或维生素D3。
维生素D的主要部分3来自7-dehydrocholesterol转换(前维生素D)暴露后的皮肤紫外线辐射。年龄、皮肤表面暴露于太阳、厚度、和照射时间都是因素,控制合成维生素D (1]。
食物只提供几个单位的皮肤产生的维生素D量相比面对阳光。
维生素D是脂溶性的,在十二指肠和空肠吸收,随后通过淋巴循环(1]。
1,25 (OH)2D3对其行动,绑定到一个特定的核受体,即维生素D受体(VDR)。它属于二类类固醇激素(2]。
核VDR的小鼠与靶向消融(conventional-VDR基因敲除小鼠)代表一个重要的模型来研究系统的动作1,25 (OH)2D3/船舶。KO小鼠显示,断奶后,脱发,低钙血症的早期发展,进而诱发继发性甲状旁腺功能亢进状态,不孕,严重受损的骨形成,这些都是人类复发性的典型特征和维生素D-dependent佝偻病II型(3- - - - - -6]。
造骨细胞是细胞表达VDR;因此他们所代表的功能目标1,25 (OH)2D3行动。
1,25 (OH)2D3可以影响人类成骨细胞生长和分化刺激骨形成和矿化7]。此外1,25 (OH)2D3调节骨沉积过程防止过度和病理矿化(8]。
的影响1,25 (OH)2D3在骨基质蛋白表达在头顶的文化研究细胞,比较年轻的细胞有分化的不同时期。治疗后1,25 (OH)2D3,成熟的成骨细胞抑制,有利于那些在早期分化的状态(9]。
维生素D对成骨细胞分化的影响可能是根据动物物种被认为是不同的;两个类别之间的矛盾的反应已被证明:人类/鼠成骨细胞和小鼠成骨细胞。因此,在与刺激维生素D对人类和大鼠成骨细胞的影响,维生素D已经证明,以确定对小鼠成骨细胞抑制作用(10]。
维生素D已报道引起碱性磷酸酶活性和增加胶原蛋白I型表达的人类成骨细胞增殖和分化过程中;使用低浓度时这种效应不明显(11]。
Kveiborg等人表明,1,25 (OH)2D3能够抵消,在成骨细胞老化在体外,基因表达的减少通常所需的成骨细胞功能(12]。
在骨膜成骨细胞前体存在表面和骨髓;此外,他们可以从间充质干细胞(msc)分化。
成体干细胞是多能细胞组织再生能力的不同。骨髓包含单独使用能力,高的细胞克隆形成单位成纤维细胞(CFU-Fs),这导致骨组织细胞,软骨组织,脂肪,和纤维组织(13]。这些CFU-Fs细胞被称为msc。
可以诱导msc分化为骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞(14)以及神经细胞(15)或肝细胞(16]。
据估计,约15%有“干”的力量,,其中有些人可以给来源成骨细胞(13]。msc向分化细胞系的承诺是由转录机制叫做主开关。
RUNX2是一个转录因子,一个关键的角色在成骨细胞分化和功能的控制。
1,25 (OH)2D3RUNX2的是一个重要的监管机构,它与合作在诱导骨钙素的表达,即关键蛋白调节骨基质矿化(17]。
有很多数据在文学关于维生素D的影响从骨髓msc孤立,特别是关于其成骨分化。
1,25 (OH)2D3影响人类msc (hMSCs)抑制细胞增殖和促进其分化成成骨细胞(18,19]。它也得到了证实,hMSCs胚胎植入前的文化中,维生素D能够确定成熟成骨细胞的形成,导致增加了矿化矩阵的形成,但这些细胞植入后相同的维生素D是不够的在促进骨形成20.]。导致假设不同在活的有机体内维生素D的效果。
为了克服一些消极方面与从骨髓msc的使用,也就是说,发病率,痛苦,和低收益率的细胞,其他来源的msc。
msc可以从骨髓组织不同于孤立如脂肪组织、脑、皮肤、肝脏,和几个胎儿组织;对msc的维生素D在成骨分化的影响这些替代来源。无论如何,从脂肪组织与msc,维生素D在成骨细胞形成的能力已被证实(21]。
根据循证研究牙科组织代表另一个,并承诺产后msc(来源22- - - - - -26]。
乳牙或智慧牙,牙齿的咀嚼功能有限,往往造成过度拥挤的问题,可用于分离msc。不成熟的牙齿,MSC的生产力来源是牙芽(DB),由noncalcified组织;对于成熟的牙齿牙周韧带的来源是(27),牙髓(DP) [27- - - - - -30.),和顶端的乳头31日]。
牙髓干细胞(DPSCs)获得智齿纸浆的成年捐赠者,而牙芽干细胞(DBSCs)来自DB。DB,这是不成熟的形式,因此没有完全钙化的牙齿,是一个很好的来源的干细胞;因为它是相当大的,它是由未分化的细胞比创作的纸浆和可以删除在8到12岁的儿童称为piezosurgery预期过度拥挤的安全技术。
牙芽的优势,与纸浆相比,首先维,它包含更多的细胞,而且几乎所有的组织是由干细胞具备干细胞的增殖能力和一个优秀的程度高(24,32,33]。
组织制定成熟的牙齿,水泥和牙周韧带,釉质、牙本质,纸浆,和中央芽的一部分,相应的牙乳头,都源自DBSCs,从数据库获得,因此含有msc可成功地分化成osteoblast-like细胞。
相比DBSCs更未分化的msc,如果从骨髓的孤立;因为这个原因他们可以被认为是一个理想的模型研究的早期阶段,成骨细胞的分化过程。
分化成成骨的血统已经证明在DPSCs [27- - - - - -29日,34矩阵)和一个相当大的矿物沉积已经观察到使用创新的支架为他们培养(35,36];而且这些细胞,如果培养β磷酸三钙/聚(l-lactic酸/己内酯)三维支架,显示增加骨的维生素D与地塞米松(37]。
本研究的目的是分析维生素D的活性代谢物的影响,1,25 (OH)2D3DBSCs,它代表的是有用的模型,了解骨细胞的合成代谢活动,从非常未分化成骨细胞前体。
2。患者、材料和方法
2.1。材料
1α,25-Dihydroxyvitamin D3抗坏血酸,β甘油磷酸盐,地塞米松,茜素红的粉,从西格玛奥德里奇和碱性磷酸酶试剂盒,米兰,意大利。
从Abnova Anti-RUNX2抗体,anti-Coll我anti-OPN,和二anti-BSP来自Abcam,英国剑桥。
2.2。病人和细胞培养
正常的人类第三臼齿从牙芽芽收集10个健康的儿科患者,8 - 12岁,接受拔牙矫正的原因,主要是过度拥挤,从病人的父母知情同意后。
中央星展的一部分,相应的牙乳头,切成小块,消化与搅拌1小时37°C的一个解决方案3毫克/毫升I型胶原酶+ 4毫克/毫升dispase(英国Gibco有限公司中的)。获得单细胞悬液通过细胞通过一个70μm BD猎鹰过滤器(Falcon) (Becton & Dickinson,桑尼维尔CA)。
过滤后,单细胞悬液在1300转离心5分钟;颗粒是resuspended和培养间充质干细胞培养基补充5%胎牛血清的边后卫,100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素(Gibco有限的、中的、英国)。细胞被播种密度细胞/厘米2。
烧瓶在37°C和5%孵化有限公司2,每3天中被改变。
为了诱导成骨细胞的分化,1500细胞/厘米2被播种和培养成骨的介质组成的吗αmem补充5%的边后卫,10−8M地塞米松,50μg / mL抗坏血酸(西格玛奥德里奇、米兰、意大利)。
DBSCs评估矩阵形成矿化结节的能力在体外,在成骨细胞培养中补充10毫米β甘油磷酸酯(西格玛奥德里奇、米兰、意大利)。
1,25 (OH)2D3(西格玛奥德里奇、米兰、意大利)重组在10−495%的乙醇,储存在−20°C。
细胞培养,95%乙醇(车辆)控制包括服用维生素d的浓度相当于,因此细胞培养与1复制,25 (OH)2D3和一个等价的稀释95%的乙醇。
2.3。茜素红染色(ARS)
矩阵DBSCs产生矿化结节的能力在体外通常归因于成骨细胞功能,评估通过执行茜素红染色细胞在成骨培养基培养21天。
因此,细胞被轻轻冲洗与PBS和固定10%甲醛在室温下10分钟。
然后他们用去离子水清洗两次孵化ARS 1%解决方案在室温下10分钟。细胞后用去离子水清洗两次,去除多余的染色,和空气干燥。单层似乎红染色。
量化ARS,细胞被孵化以10%醋酸在室温下30分钟用颤抖的。细胞层刮,涡流,然后10分钟的解决方案是孵化85°C。5分钟后湿冰,暂停离心机在20000年g 15分钟和500年μL的上层清液处理10%氢氧化铵中和酸。光密度(OD)在405 nm读一式三份。
2.4。碱性磷酸酶(ALP)
碱性磷酸酶的表达,是成骨细胞分化的标志,是评估与白细胞碱性磷酸酶工具包(西格玛奥德里奇)。
简单地说,媒体被移除和细胞细胞固定在0.5毫升的固定剂解决方案5分钟在室温下,根据制造商的指示。
随后,井被去离子水清洗和细胞染色0.3毫升高山的解决方案(FRV-Alkaline的混合溶液,萘酚是双碱性溶液,亚硝酸钠溶液)在每一个。15分钟后在黑暗中孵化,井与去离子水清洗和风干,然后细胞在显微镜下检查。
2.5。免疫印迹
检测成骨细胞的标记的蛋白质含量是由sds - page凝胶电泳和免疫印迹分析。DBSCs是细胞溶解后7、14和21天的成骨分化;细胞溶解产物清除了在13000转离心15分钟在4°C。上层清液总蛋白浓度的测定使用蛋白质化验(BIORAD)。
等量的蛋白质为每个样本被sds - page分离和转移到硝化纤维素膜(英国Amersham) Trans-Blot(美国Biorad)。探讨了膜的主要抗体在一夜之间在4°C,然后样本孵化为90分钟在室温下二级抗体结合辣根过氧化物酶。反应与《奥德赛》分析了红外成像系统的LI-COR(美国内布拉斯加州林肯LI-COR生物技术)。
2.6。统计分析
通过学生的统计分析以及与社会科学统计软件包(spssx / pc)软件(美国SPSS,芝加哥,IL)。被认为是具有统计学意义的结果。
3所示。结果
3.1。高山在DBSCs积极性和富含钙的存款
为了研究维生素D DBSCs诱导分化为成骨细胞的能力,在成骨的培养基培养细胞和刺激,25 (OH)2D310−8m .这已经观察到的最有效的集中在生理浓度的维生素D在以前的实验分析。
DBSCs文化是停在7、14和21天在区分条件下连续维生素D治疗后。
我们用组织化学分析评价碱性磷酸酶的表达,成骨细胞的分化的一个标志,osteodeposition过程的关键酶。
我们发现DBSCs培养成骨的介质和处理1,25 (OH)2D37天后表达高水平的高山,而控制(图1(一))。有一个相当大的高山水平的增加14天后,轻微的车辆之间的差异和处理(数据未显示)。
(一)
(b)
此外,长期的文化DBSCs演示能力形成富含钙的沉积;这个活动,代表了成骨细胞最后一步基质分泌,与农业研究所的量化评估。
有趣的是DBSCs沉积矿产矩阵结节明显高于与维生素D细胞培养,而控制(图1 (b))。
3.2。成骨细胞在DBSCs标记表达式
主要的成骨细胞的标记,如胶原蛋白(胶原I),其前身Pro-Collagen我(Pro-Coll I), RUNX2,骨涎蛋白(BSP),和骨桥蛋白(OPN),分析了在DBSCs成骨分化的不同步骤。
RUNX2是成骨分化的主基因;指导msc对成骨细胞的谱系,抑制其分化成脂肪细胞和软骨细胞等其他血统38]。
如图2(一个)期间,RUNX2的表情相当恒定的方式提出DBSCs成骨分化;然而维生素D的依赖大大增加其表达水平在7和14天的治疗。在21天的文化中,没有观察到车辆和维生素D的区别。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
相似的趋势已经描述为观察RUNX2科尔(图2 (b)):维生素D调节其表达在第一个7天的分化;的影响仍然存在,尽管减毒、14和21天的治疗。
有趣的是Pro-Coll我,科尔,我的不成熟的前体形式显示反向趋势(图2 (c)):维生素D减少了表达7点14和21天的文化暗示这种治疗促进Pro-Coll转换我的成熟的胶原。
值得一提的是,这些数据证实了科尔的典型趋势osteoblastogenesis之中我和它的前身,表明DBSCs成骨细胞的分化的一个可靠的模型:此外维生素D可以维持和增加这个过程。
然后我们评估OPN的表达和BSP被认为是最重要的noncollagenous蛋白质由骨细胞在骨基质的形成在体外(39- - - - - -41]。
BSP略的表达调节维生素D治疗7天后,在14天有显著减少;在21天BSP(图并没有表现出显著的表达变化2 (d))。
没有显著的影响归因于维生素D治疗OPN的表达(图2 (e))。
4所示。讨论
维生素D的主要行动是那些关于矿产和骨骼内稳态。长期缺乏维生素D有不同的人类骨骼后果决定骨量减少和矿化,与疾病的表现称为儿童佝偻病和软骨病成人(42,43]。低水平的维生素D也导致骨量减少或骨质疏松症主要归因于增加破骨细胞骨吸收。这些影响主要依赖间接的行为1,25 (OH)2D3。维生素D可能影响骨间接刺激肠内钙的吸收,或直接,也就是说,通过作用于骨细胞;这两个动作的主流仍然是讨论(44)和机制,维生素D影响成骨细胞大多是未知的(45]。
一些研究描述1,25 (OH)2D3能够增加人类成骨细胞矿化,导致早期和更高的矿物沉积率(46),并且能够加速hMSCs承诺与随后的成骨细胞的成熟47,48]。
骨髓一直被视为msc的主要来源;然而这些细胞可以从其他组织和器官,在某些情况下可能是一个更简单的收集网站被认为微创捐赠者。这是干细胞隔离的情况下从牙科组织。
与其他来源用于成人获得msc、牙科组织形成年龄较大,这是由于后期完成牙发生和牙齿喷发;因此这些组织含有较高数量的干细胞被发现是多功能细胞(22,49]。DPSCs和DBSCs可以隔绝第三磨牙,分别在孩子成人捐助者或。牙芽是一个不成熟的器官,这是几年出生后,由未分化细胞的增殖率高于观察从骨髓msc。
被认为是msc DBSCs完全满足的要求;事实上已经表明,他们表示超过95%的间充质干细胞标记(CD44、CD73 CD90、CD105, CD146,和HLA-I)和表达典型的间叶细胞粘附分子(33]。因此所有这些DBSCs间叶细胞的特性,加上简单的可访问性,利用牙科msc对骨髓细胞组织一个优秀的替补。
我们已经表明,osteoblastogenesis可以成功,以一种非常高效的方式,于牙科卵泡,外围部分牙芽(32从牙科芽)和33]。这些细胞分化对成骨细胞的表型;他们表达RUNX2,科尔我和高山,成骨细胞标记、特征矩阵和生产矿化结节。
在这个工作我们分析了维生素D可能影响DBSCs的成骨分化。为了这个目的,我们研究了典型的表达成骨细胞的标记和矿物基质沉积在DBSCs成骨分化的存在,不信,1,25 (OH)2D3。我们的结果证实了功能成骨分化DBSCs [33];除了在这个工作我们证明维生素D治疗提高了DBSCs向成骨细胞的谱系的承诺。我们确实观察到DBSCs处理1,25 (OH)2D3表达水平的提高主要的成骨细胞的标记,RUNX2,科尔,我和高山。而且我们的研究结果表明,加强承诺的DBSCs存在维生素D也伴随着一个增广的生产矿化矩阵。
RUNX2的增强表现,这是一个早期的标志成骨细胞的分化,表明维生素D作用于未提交的细胞,促使其向成骨的谱系分化,然后表达典型的高山和科尔。这些proosteogenic影响成骨细胞的标记所1,25 (OH)2D3在未分化间叶细胞祖细胞结果随后加速矩阵形成矿化结节在体外经过21天的分化。
我们的研究结果还表明,RUNX2的表达和科尔我强调细胞接受维生素D在成骨分化的早期阶段(7 - 14天),而他们的表达转向控制大约21天的文化水平,表明维生素D的影响是主要的文化。
这些结果表明,维生素D可能行为的第一个步骤msc分化成骨细胞的表型,变得不那么有效的分化细胞。我们的数据与之前的数据对人类成骨细胞,维生素D的效果取决于时间和细胞分化期似乎消失在正在进行的矿化46]。
我们的观察也表明,干细胞从牙科组织应对维生素D信号符合文学中的数据属性中维生素D的一个关键作用诱导成骨的msc分化[18,47,50从人类的骨髓。这些结果证实,msc从牙科组织与从骨髓msc分享相似的特征,表明文化的DBSCs存在维生素D可以考虑骨再生疗法。
因此这些数据反映的间叶细胞起源DBSCs及其成骨的能力;此外本研究表明成骨细胞的分化DBSCs是1,25 (OH)2D3;我们的观察表明,维生素D直接作用于这些细胞可以被认为是成骨细胞前体,指导他们增加骨基质沉积。
这项工作的的力量是DBSCs产后干细胞比骨髓隔绝,更未分化,成体干细胞与胚胎干细胞。我们的数据是所有这些结论的极限已经报告从骨髓msc;他们是一个确认。
5。结论
众所周知,钙的摄入量预防骨质疏松和骨折的疗效是伴随的假设条件的维生素D .没有足够的D假设只有10 - 15%的钙可以用于构建新骨(51]。
我们发现维生素D DBSCs刺激成骨细胞的分化与骨矿物质矩阵的后续增加沉积显示另外一个可能使用维生素D的食品援助重建治疗骨与msc。
扩大1,25 (OH)2D3人群中摄入可以推荐为预防和治疗骨疾病和创伤。
缩写
| msc: | 间充质干细胞 |
| DB: | 牙芽 |
| DBSCs: | 牙芽干细胞 |
| 维生素D, 1,25 (OH)2D3: | 维生素D |
| 论述: | 维生素D受体 |
| 科尔我: | 胶原蛋白我 |
| Pro-Coll我: | Pro-Collagen我 |
| BSP: | 骨涎蛋白 |
| OPN: | 骨桥蛋白 |
| DP: | 牙髓 |
| DPSCs: | 牙髓干细胞 |
| DFSCs: | 牙科毛囊干细胞 |
| 高山: | 碱性磷酸酶 |
| 农业研究所: | 茜素红染色。 |
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突存在。
确认
工作被授予从赞助Ministero戴尔'Istruzione,戴尔'Universita e德拉Ricerca-PRIN 20098 km9rn Mori (Progetto di Ricerca d 'Interesse Nazionale-Grant 2009);EACA感谢的支持脱硫(SFB TRR 79 TPB5);作者a . Di Benedetto由洋底Di Sviluppo e Coesione 2007 - 2013, APQ Ricerca Regione普利亚区”Programma regionale德拉一个sostegno specializzazione intelligente e德拉sostenibilita sociale ed ambientale-FutureInResearch”。