三维聚合物增强脂肪间充质干细胞的治疗效果在大鼠缺血再灌注引起的肾损伤

文摘

它已经表明,脂肪间充质干细胞衍生管理(AdMSCs)增强结构和功能恢复肾缺血再灌注(IR)损伤。低的干细胞移植,然而,限制了AdMSCs的治疗效果。本研究旨在提高疗效的AdMSCs交付AdMSCs在三维(3 d)聚合形式。Microwell被用来产生3 d AdMSCs总量。体外数据显示3 d AdMSCs总量不太容易氧化,200缺氧引起的压力μM过氧化和缺氧/复氧,分别与二维(2 d)单层培养。此外,AdMSCs 3 d聚合分泌更多proangiogenic因素比在二维单层培养。2 d AdMSCs或3 d AdMSCs聚集诱导后立即被注入肾皮质肾红外受伤。体内的数据显示,3 d聚合增强的影响AdMSCs肾红外受伤后恢复功能和结构。提高嫁接AdMSCs观察相比,肾注射3 d聚合AdMSCs在二维单层培养。我们的研究结果表明,3 d AdMSCs聚合由microwell增强AdMSCs的保留和疗效肾红外受伤。

1。介绍

间充质干细胞(msc)是多能祖细胞可以从几个孤立的组织,尤其是骨髓和脂肪组织(1,2]。隔离和扩张的缓解在文化、免疫调节特性,multilineage分化细胞疗法的潜在msc承诺资源。几项研究已经表明,msc增强管理结构和功能恢复肾缺血再灌注(IR)损伤(3- - - - - -5]。注入了msc的有益作用被认为是主要从移植msc相关细胞因子的分泌,这被定义为旁分泌作用[4,6]。

尽管msc对肾红外损伤的疗效已被描述,缺乏最初的移植和保留由于早期的细胞死亡是一个主要的障碍实现临床意义(7]。这可能是由于“恶劣环境”包括氧化应激,受伤的肾脏缺氧。几个策略也已经被开发出来,以改善缺血性肾道干细胞的生存。这些策略包括基因修饰的干细胞(8,9),msc预处理[7,10),和组织工程支架的使用(11]。尽管在缺血性肾脏干细胞的存活率提高,进一步临床应用的策略仍有问题。

最近,许多研究人员表明,聚合形式交付msc可以作为一种有效的方法来解决这些问题。它已经表明,三维(3 d)聚合增强道细胞的生存以及受伤的器官的微环境。例如,交付心脏祖细胞3 d聚合的形式提高体内植入细胞的生存在心脏缺血再灌注损伤12]。缺血性四肢的肌肉移植后,3 d msc总量显示细胞生存和改善肢体存活(13]。然而,很少有研究关注的应用3 d msc聚集在干细胞细胞治疗肾红外受伤。几个三维细胞培养技术包括多孔支架、水凝胶、细胞聚集体被开发出来。其中,细胞聚集了越来越关注,因为它们是免费的外源性生物材料(14]。Microwell被报告为一个有效的技术来生产规模细胞总量(12,15]。本研究旨在检验治疗效果的3 d脂肪派生msc (AdMSCs)总量由microwell肾红外损伤鼠模型。我们假设的形式交付AdMSCs骨料可以增强AdMSCs生存在受伤的肾脏,因此提高AdMSCs的治疗效果。我们所知,这是第一个研究旨在探讨使用3 d AdMSCs总量提高的可行性为肾红外AdMSCs损伤的治疗效果。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

AdMSCs分离Sprague-Dawley paratesticular脂肪的老鼠和培养根据我们先前描述的协议(16,17]。短暂,脂肪组织是碎成小块,然后用0.075%孵化I型胶原酶(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)1 h在37°C。使离心后10分钟220克、脂质层顶部被剩下的细胞悬浮在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM,生活技术,中国上海)补充10%胎牛血清(的边后卫,生活技术)和镀1×10的密度⁶细胞在10厘米。AdMSCs是在相同条件下通过不超过5段落之前被用于分析。所有程序都是通过南京大学动物保健和使用委员会制度。

2.2。Microwell组装和代AdMSCs总量

Microwells生成使用micromolding UV-photocrosslinkable聚乙二醇利用(PBS)挂钩,MW = 1000, 20% (Sigma-Aldrich)与1%的光2-hydroxy-1 - [4 - (hydroxyethoxy)苯基]2-methyl-l-propanone (Irgacure D2959,汽巴特种化学品公司,抖,新泽西,美国)根据前面描述的协议(12,15]。简而言之,盯住小分子的解决方案是吸管载玻片上涂上3 - (trimethoxysilyl) propylmethacrylate (TMSPMA) (Sigma-Aldrich)。此后,有图案的PDMS压模是放在挂钩方案挂钩方案PDMS压模之间的均匀分布和TMSPMA镀膜玻璃幻灯片。与紫外线照射(10秒后l= 350 - 500 nm, 10 mW /厘米²;米西索加OmniCure系列2000养护站,EXFO,加拿大),与microwells photocrosslinked挂钩。代AdMSCs聚合,AdMSCs被播种到microwells使用之前开发的方法(18]。简而言之,AdMSCs悬架(1×10⁶细胞/毫升)是用移液器吸取microwell阵列表面均匀(100μL /厘米²)。两个小时后,数组是沉浸在媒体在培养皿中。在microwell AdMSCs形成3 d聚合。一个示意图总结协议如图S.1网上(见补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/9062638)。

2.3。过氧化氢(H₂O₂)和缺氧/复氧治疗

确定细胞的敏感性压力包括氧化应激和缺氧,AdMSCs培养在二维单层或3 d聚合处理200μM H₂O₂或缺氧复氧。简单地说,包含200细胞与培养基培养μM H₂O₂或车辆2小时模仿氧化应激。缺氧/复氧诱导的细胞受到缺氧24 h后2小时的再氧化。缺氧(2%啊₂)是通过使用一个multigas孵化器(三洋,Pfaffenhofen,德语),保持2%的气体混合物O₂,5%的公司₂,93% N₂在37°C。细胞培养的常规培养条件下同一段时间被设置为控制。细胞的生存能力确定如下所述。

2.4。细胞生存能力

快速,同时double-staining过程使用荧光素二醋酸盐碘化(FDA)和propidium (PI) (Sigma-Aldrich)是用于测定细胞生存能力19]。总之,细胞被沾染了5μg / mLπ和4μg / mL FDA和荧光显微镜下观察到一个合适的滤波器组的障碍。

2.5。实时聚合酶链反应(PCR)

基因表达的细胞外基质(ECM)和proangiogenic生长因子是由实时PCR。短暂,从细胞总RNA孤立使用试剂盒试剂(生活技术,中国上海)。RNA是reverse-transcribed (RT)的互补利用商业可用转录工具包(美国应用生物系统公司,卡尔斯巴德,CA)。使用电力SYBR绿色PCR定量rt - PCR进行主混合(技术)。每个样本的所有实验进行了一式三份,每个基因。引物序列表S.1中列出。

2.6。Immunofluorescent分析

与PBS和4%多聚甲醛固定冲洗后10分钟,细胞被冲洗和PBS permeabilized triton x - 100 10分钟为0.05%。与5%的马血清孵化后30分钟然后与初级抗体在晚上4°C,二级抗体的细胞被孵化1 h在室温下。主要包括抗体anti-fibronectin(1: 100年,圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA,美国),anti-laminin(1: 100年,圣克鲁斯生物技术)。第二抗体是alexa - 594 -共轭二次抗体(1:500;生命技术)。核沾染了4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI;生命技术)。

2.7。动物和治疗

所有实验协议进行动物是按照标准执行机构建立的动物保健和使用委员会南京大学。男性Sprague-Dawley老鼠体重200 - 250克被安置在不锈钢笼子和免费的食物和水。老鼠被随机分为四组。虚假的组接受假手术();IR组收到后立即注射PBS肾红外感应();红外+ AdMSCs组注射后的2 d AdMSCs诱导肾IR ();红外+聚合组注射后的3 d AdMSCs聚集诱导肾IR ()。老鼠安乐死手术后24小时。收集血液样本的测量肾脏功能同时为分子分析肾脏收集。

2.8。大鼠肾红外损伤模型

老鼠麻醉腹腔内的克他命(100毫克/公斤)和咪达唑仑(5毫克/公斤)。麻醉后,老鼠接受肾红外损伤(如前所述)(20.]。短暂,腹部剖腹手术后,右肾被曝光和删除。左肾蒂被曝光与血管钳夹住50分钟诱导缺血。血管钳夹之后,被诱导再灌注和切口关闭2层。Sham-operated控制动物只接受了右肾切除术。

2.9。细胞标记和注射

细胞跟踪,AdMSCs贴上EdU(生活技术,中国上海)48小时根据制造商提供的说明。因为它需要大约24小时microwell AdMSCs形成3 d聚合,总共1×10⁶EdU标记AdMSCs被播种到2 d文化菜或microwell。24小时后,细胞或骨料分离得到2 d文化菜或microwell注入。90年AdMSCs或3 d AdMSCs总量μL PBS注入肾皮质使用28 G针(三个注射:波兰人和中部地区)根据以前公布的协议(11]。

2.10。测量肾脏功能

血清被离心法分离血液样本存储在−80°C,直到分析血清尿素氮(BUN)和尿肌酐(Cr)。包子的浓度和Cr评估在重复一个商用试验设备(美国生物测定系统,海沃德,CA)根据指令。

2.11。组织学分析

中间部分的肾脏在4%甲醛固定,脱水,石蜡包埋。组织部分(5μm)与苏木精和伊红染色(他)。肾部分失明的方式检查和评估损伤程度。评分的分数反映肾小管坏死,形成管状扩张,和损失的刷状缘10随机选择,不重叠的领域(200 x)如下:0:没有;1:≤10%;2:11日至25%;3:26日至45%;4:46 - 75%;5:≥76%20.,21]。

2.12。检测细胞凋亡

定量测定细胞凋亡的评估是通过一个终端脱氧核苷转移酶介导肾部分dUTP使用原位缺口末端标记(TUNEL)测定细胞死亡检测设备(罗氏、巴塞尔、瑞士)。脱蜡和补液后,组织部分与0.1% permeabilized Triton x - 100 10分钟。孵化与标签的解决方案是用来检测凋亡细胞根据指令。凋亡得分是通过计数的数量在10个随机领域积极核。

2.13。EdU阳性细胞的检测

定量测定的EdU阳性细胞在肾脏部分评估。简而言之,脱蜡后,补液,组织部分permeabilized Triton x - 100 10分钟为0.1%。孵化与点击它^@鸡尾酒是用来检测凋亡细胞的反应根据指令(表达载体)。细胞移植是由计数阳性细胞核的数量在10个随机领域。

2.14。统计分析

所有统计分析使用棱镜4 (GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)。单向方差分析(方差分析)其次是Tukey-Kramer测试被用于事后比较分析不同群体。统计学意义是。

3所示。结果

3.1。建设3 d AdMSCs总量

AdMSCs聚合,形成良好定义的3 d聚合24 h后播种。AdMSC总量不拆卸文化时间14天(数据未显示)。AdMSCs总量的大小是均匀变化较低(图1 (c))。

3.2。描述的3 d AdMSCs总量

如图2 (b),3 d总量的大多数细胞阳性食品药品监督管理局和消极的PI染色,表明高生存能力至少7天(数据的总量2(一个)和2 (b))。3 d AdMSCs总量显示保存完好的ECM 2 d AdMSCs相比。文化在microwell 7天后,细胞表达显著增加纤连蛋白和层粘连蛋白(数据的水平2 (c)- - - - - -2 (e))与2 d细胞相比,在一定程度上表明ECM的显著增加分泌3 d AdMSCs总量。

3.3。D AdMSCs总量不太容易氧化和缺氧的压力

验证3 d聚合增强保护缺氧,细胞AdMSCs在单层培养的2 d或3 d聚合受到缺氧的24小时后跟2 h再氧化。如数据所示3(一个)和3 (b),细胞生长在3 d聚合不太容易缺氧/ reoxygenation-induced压力相比在二维单层培养由π/ FDA比率。此外,我们检查了2 d AdMSCs或3 d聚合的反应到200年氧化应激模仿μM H₂O₂。类似结果后缺氧/复氧,减少细胞死亡,由π/ FDA,在3 d聚合(数字3(一个)和3 (c))。

3.4。增强Proangiogenic分泌生长因子从3 d AdMSCs总量

实时PCR用于检测的mRNA表达proangiogenic因素2 d AdMSCs或3 d聚合。3 d聚合显示相当大的proangiogenic生长因子的表达。如图3 (d)的表达血管内皮生长因子(VEGF),纤维母细胞生长因子2 (FGF2)和肝细胞生长因子(HGF)是更大的比2 d AdMSCs单层(图3 (d))。

3.5。D AdMSCs聚集保护肾功能和肾组织学

血清水平的包和Cr选择确定肾功能。如数据所示4(一)和4 (b)包子和Cr含量明显高于IR组比虚假的组。注入AdMSCs,单层培养的2 d或3 d聚合,显示,保护肾功能,积极作用反映在显著降低面包和Cr水平相比IR组。更重要的是,包的水平和Cr在红外+聚合组与2 d AdMSCs组相比显著降低。这些发现暗示,3 d聚合显示显著提高保护作用与2 d AdMSCs相比。

确定AdMSCs在IR-induced肾损伤的影响,一个组织学评分系统基础上采用典型的急性肾小管损伤的微观特征(图4 (c))。在24小时后红外过程,伤害IR组得分最高,明显高于虚假的组。受伤的分数在红外+ AdMSCs和红外+聚合组与IR组相比显著降低。损伤评分在红外+聚合组的价格相比显著降低红外+ AdMSCs组(图4 (d))。这些发现表明3 d聚合比2 d AdMSCs提供更多的保护。

3.6。D总量减少红外后在肾脏细胞凋亡过程

探讨IR相关凋亡细胞,我们测量TUNEL阳性细胞在肾组织。如图524小时后IR,没有观察到凋亡细胞的肾脏从虚假的组。凋亡细胞的数量在IR组与虚假的组显著增加。相比之下,组织从AdMSCs和聚合组包含一个小得多的TUNEL阳性凋亡细胞的数量。此外,凋亡细胞的数量在3 d聚合组在3 d总量显著减少组相比,在2 d AdMSCs。

3.7。D总量提高体内AdMSCs的生存

EdU积极AdMSCs肾部分的数量是计算来确定细胞移植后注入。如图6,埃杜在肾部分阳性细胞的数量从3 d聚合组的价格相比也显著大于2 d单层,表明3 d聚合的形式表现出更大的生存时,植入体内后肾红外受伤。

4所示。讨论

我们的结果显示,首次microwell产生3 d AdMSCs总量提高肾脏功能通过抑制IR-induced海拔包子和Cr,恢复IR-damaged肾组织学结构,减少肾小管细胞凋亡与2 d AdMSCs单层。

肾红外损伤是严重和常见的临床肾病的发病率和死亡率高的疾病。通常是不可避免的副作用在肾移植和频繁发生的休克或手术22]。不幸的是,创新的干预超出支持性疗法尚未公布。因此,迫切需要开发一个新的肾红外损伤修复和有效的方法。

在过去几年中,许多研究表明,移植肾红外损伤(msc是一种有效的战略5,23]。从不同的组织包括骨髓msc孤立24,脂肪25,26),沃顿商学院的果冻27),胎膜(28),和脐带29日)已经被移植到防止肾红外受伤。其中,AdMSCs最有希望的种子细胞之一,因为丰富的存在,在收割。几个比较研究表明,AdMSCs在细胞表面表达谱相似,与msc分化潜力,治疗效果来源于骨髓(30.- - - - - -32]。最重要的是,足够数量的AdMSCs临床应用程序可以以最小的副作用在局部麻醉的情况下获得(33),使AdMSC另一种肾细胞来源修复红外受伤。尽管AdMSCs-based治疗肾红外受伤之前,低潴留和广泛的早逝的移植细胞被剩下的问题之一。

最近,以3 d形式交付msc已经证明是一个有效的策略来提高干细胞的生存和治疗效果14]。与传统的2 d基质相比,3 d文化模仿体内微环境和最大化干细胞所需的信息交流功能。在目前的研究中,3 d AdMSCs骨料被用来促进移植AdMSCs的存活率。几种方法,如多孔支架、水凝胶和细胞聚集体已经成功地应用于提供3 d文化环境为各种不同的细胞类型,包括msc (14]。在这些技术中,细胞聚集了越来越多的关注,因为他们都是免费的外源性生物材料,可能会导致麻烦的反应在细胞移植(34,35]。细胞聚集的主要技术,悬滴被广泛用于干细胞文化(14]。然而,悬滴是无效的骨料的生产规模。在目前的研究中,我们使用挂钩派生microwell数组作为一个3 d文化体系形成AdMSCs总量。如图1AdMSCs总量较低的是同质的大小变化。最重要的是,microwell有效生产的大规模AdMSCs聚集而挂掉。此外,媒介改变microwell数组一样简单普通的2 d细胞培养,这使得它可行的时间离体培养。此外,许多体外测试可以直接内执行microwell数组,而无需将细胞转移到另一个容器。

在目前的研究中,不容易氧化和缺氧的压力在3 d AdMSCs总量与AdMSCs在二维单层培养。与体外数据一致,显著提高嫁接AdMSCs也观察到红外肾脏。3 d聚合的保护作用与压力,如氧化应激和缺氧,可能是因为AdMSCs预处理的三维微环境(14]。描述,可以创建一个3 d聚合结构异构微环境提供营养的尺度依赖的梯度,氧气,细胞因子。氧气建议是一个主要因素影响的生物属性聚合内的msc。3 d AdMSCs骨料被证明提供一个轻微的缺氧环境,促进分泌的低氧诱导因子(HIF) (13,36]。已经证明,干细胞进行细胞凋亡后立即暴露恶劣的环境包括氧化应激、缺氧。3 d聚合可以抑制细胞凋亡的移植预处理AdMSCs缺氧微环境,通过刺激低氧诱导的生存因素,如低氧诱导因子的表达式。

人们普遍认为为IR-induced AdMSCs肾损伤的治疗机制主要是通过细胞因子的表达式,它被定义为旁分泌作用。增加移植干细胞是负责AdMSCs增强治疗效果。此外,它已经表明,3 d聚合调节proangiogenic因素如VEGF的分泌,FGF-2, HGF的msc,建议由轻微缺氧诱导环境3 d聚合(13,36]。从我们的体外结果,proangiogenic因子的分泌在3 d AdMSCs骨料被提拔,这是与以前报道的结果一致(13]。此外,移植的3 d AdMSCs骨料缺血性肾抑制肾小管细胞凋亡与2 d AdMSCs相比在单层生长。这可能由于proangiogenic因素的调节表达式,从而保护管状上皮免受IR-induced受伤。

我们的研究有一些局限性。首先,观察保留AdMSCs总量只有24 h后红外过程。这将是有趣的检测AdMSCs骨料的保留时间点。我们已经开始实验,旨在确定保留AdMSCs红外受伤后在肾脏长时间点。第二,3 d AdMSCs骨料被直接发送到受伤的肾脏。尽管治疗效果,这个方法不适合临床应用交付。进一步的研究将调查AdMSCs总量的影响进行静脉注射。

5。结论

我们的数据提供了第一次3 d AdMSCs骨料具有生存优势当植入大鼠肾脏后红外受伤。Microwell有效生产规模的3 d AdMSCs总量,可以用来推进AdMSCs治疗肾的功效红外受伤。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Xiaozhi赵、雪峰秋亭张同样起到了推波助澜的作用。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金的资助(81302542,81302542,81171047),中国博士后科学基金会(2014 m551562)和基础研究基金为中央大学(20620140532)。

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