文摘

了近一个世纪,心脏被视为一个终末分化的器官,直到发现常住人口的心脏干细胞被称为心脏祖细胞(年度"特别关注国")。它已经表明,可以增强年度"特别关注国"的再生能力体外修改。预处理年度"特别关注国"可以提供大幅改善心脏结构和功能;然而,一个系统的方法来确定这些修改的机械的基础建立在年度"特别关注国"的生理学是缺乏。我们还发现了一个新属性确定特别关注国应对电刺激启动细胞内Ca^{2 +}振荡。我们用共焦显微镜和细胞内钙成像技术来确定Ca的时空特性^{2 +}信号的关键蛋白质参与这个过程使用药物抑制和共焦Ca^{2 +}成像。我们的研究结果提供有价值的见解机制进一步加强在干细胞治疗潜力,我们理解人类生理学。

1。介绍

心脏被认为是postmitotic器官无法再生,直到心脏茎细胞的发现常住人口带来潜在的心脏组织再生(1]。被称为心脏祖细胞(年度"特别关注国"),主要是心肌中发现,这些细胞已经心原性的基因表达以及干细胞标志物c - kit (2]。自从第一个c - kit的报告⁺年度"特别关注国",争议的能力,这些细胞来代替心脏细胞(1,3- - - - - -7]。尽管早些时候报道说,年度"特别关注国"可以取代受损心肌(1,8),最近的血统追踪研究提供了令人信服的证据表明这些细胞不会成为心脏细胞在活的有机体内(4,5,7]。然而,它已经表明,这些细胞的再生能力,可以增强体外修改。几个实验室已经证明的可行性和实用性体外操纵成体干细胞被基因工程(9- - - - - -13]或暴露于环境、化学和生物治疗前交货(9,14- - - - - -17]。这些策略背后的想法是隔离病人的年度"特别关注国",扩大并修改它们创建一个更治疗表型。

电刺激是一种治疗已知增强心原性的潜在各种干细胞通过激活钙(Ca^{2 +})在成年细胞信号(18- - - - - -22]。Ca^{2 +}心中是不可或缺的第二信使,调节兴奋收缩的过程耦合(行动potential-mediated Ca吗^{2 +}输入触发收缩)和excitation-transcription耦合(行动potential-mediated Ca^{2 +}条目触发基因表达的变化)。先前的报道表明,电刺激引起的成人心脏脂肪tissue-derived祖细胞细胞表型和遗传机制的变化,使它们更适合心脏再生方法(19]。此外,电刺激的成年祖细胞可以诱导多种反应,如细胞骨架重组、迁移、增殖和分化,以及新创表达式的心脏sarcomeric蛋白质、肌钙蛋白T和心脏α-辅肌动蛋白,提高联接蛋白43的表达及其搬迁细胞膜(19- - - - - -22]。最近的数据表明,Ca^{2 +}参与装配的收缩装置和本地化的关键心原性的转录因子,如肌细胞增强因子2 c,在年度"特别关注国"23]。尽管这些结果,增强cardiospecific基因表达背后的机制和治疗潜在的增加成人年度"特别关注国"报道与电刺激尚未阐明23- - - - - -25]。此外,这些实验都是用很少的知识进行的这些细胞的基本成分直接他们的努力。监管的Ca系统的研究^{2 +}处理年度"特别关注国"将大大促进我们的年度"特别关注国"生理知识和他们的心脏修复的潜力,提供基本信息,可以用于开发新的治疗方法改善心肌修复和再生。

为此,我们旨在描述电诱导机制^{2 +}在人类c - kit处理⁺心脏祖细胞。在这项研究中,我们还发现了一个新属性确定特别关注国应对电刺激启动细胞内Ca^{2 +}振荡。年度"特别关注国"从人类心房组织分离和合并来自多个捐献者以防止患者在我们的实验结果。这些细胞与Ca加载^{2 +}敏感染料fluo-4 /测量胞质及核Ca^{2 +}振动响应使用活细胞共焦显微镜急性电刺激。我们为Ca^{2 +}通过测量信号的振幅胞质及核Ca^{2 +}振荡电刺激引起的识别的机制^{2 +}振荡启动和传播在整个细胞,还确定蛋白质参与这个过程的关键。这个项目可能影响许多干细胞疗法和为我们提供有价值的见解机制进一步加强干细胞的治疗潜力,我们理解人类生理学。

2。材料和方法

2.1。患者方面的研究

人类心脏祖细胞(年度"特别关注国")用于这项研究是在IRB获得审批,允许孤立的年度"特别关注国"鉴定心房浪费组织移除在先天性心脏病手术修复。患者不受任何额外风险参与这项研究。患者信息保密是有保证的,因为我们没有记录病人的名字或人口统计信息,不接触病人。临床研究护士获得需要的信息,如年龄、性别、种族、诊断、药物治疗,但组织样本被鉴定和数据从活检获得了只有一个内部实验室。没有偏好的性别、种族或民族用于病人登记。

2.2。试剂

所有化学药品和试剂购自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国),除非特别注明。股票的解决方案丁卡因和2-aminoethoxydiphenyl硼酸(2-APB)在甲醇和乙醇,分别在Tyrode和稀释浓度的解决方案。车辆被添加到Tyrode解决方案控制实验。l型钙主要抗体^{2 +}通道和肌醇1 4 5-trisphosphate受体是来自圣克鲁斯生物技术(美国达拉斯,TX),和初级抗体488年阿诺定受体和二级抗体Alexa萤石和Alexa萤石647人购自热费希尔科学(美国沃尔瑟姆,MA)。

2.3。人类心脏祖细胞的培养

人类的孩子(1 - 5岁)心脏祖细胞活检组织中分离的使用c - kit antibody-conjugated磁珠和传播在文化如前所述26]。短暂,组织剁碎并与2型胶原酶消化(1毫克/毫升)在汉克的平衡盐溶液,通过70年μm过滤器。细胞被孵化Dynabeads(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)结合到c - kit抗体(美国圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX)前磁排序。排序的细胞被镀在t - 75组织培养瓶和扩展到融合。细胞池从4 - 6捐助者减少可变性。中共文化媒体包括火腿的F-12基底媒体(Mediatech马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)以及10%胎牛血清(美国佐治亚州亚特兰大生物制剂,华丽的分支),1%青霉素、链霉亲和素1%,1%谷酰胺,0.1μ基本成纤维细胞生长因子g / mL。实验之前,细胞被镀在玻璃盖玻片和允许附加在一夜之间37°C。

2.4。细胞内钙离子测量

细胞被装满10μM fluo-4 /我20分钟后20分钟洗Tyrode deesterification染料的解决方案。电场刺激应用使用一个IonOptix MyoPacer细胞刺激器(10 ms持续时间、32 V;韦斯特伍德,美国马)和fluo-4很兴奋在488 nm和排放收集使用激光扫描共焦显微镜纳米(FV1000,奥林巴斯,梅尔维尔,纽约,美国)。钙振荡测量期间从年度"特别关注国"获得0.5或1 Hz刺激沐浴在Tyrode的解决方案,包含(130毫米)氯化钠,氯化钾,2 CaCl₂1 MgCl₂,10 d -葡萄糖,与氢氧化钠和10个玫瑰,pH值7.4。所有实验在室温下进行(20 - 24°C)。数据分析使用奥林巴斯FV1000 FluoView软件和斐济(27]。

2.5。膜染色

细胞膜和横管式结构可视化与膜结合荧光探针Di-8-ANEPPS(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)的二维共焦显微镜。细胞被加载与Di-8-ANEPPS(5 15分钟μ米)Tyrode的解决方案和指标很兴奋在488海里,并在> 600海里排放测量。

2.6。免疫细胞化学

年度"特别关注国"镀在玻璃盖玻片,固定在4%多聚甲醛,permeabilized Triton, 0.1%与3% BSA / PBS和阻塞2小时。细胞治疗与适当的主(Cav2.1 2型IP₃R, RyR2)和二次稀释的抗体2小时1:500。洗后用PBS, VECTASHIELD HardSet不变色安装介质包含DAPI(美国向量实验室,伯林盖姆,CA)被用来挂载玻片上的盖玻片的可视化。

2.7。长期电刺激

确定特别关注国被播种在4×10的密度⁵细胞/在6-well C-dish(美国IonOptix,韦斯特伍德,MA)在媒体刺激和孵化。中共刺激媒体包括火腿F-12基底的媒体以及10%胎牛血清,1%青霉素、链霉亲和素1%,1%谷酰胺,CaCl 2毫米₂。C-Pace EP文化Pacer(美国IonOptix,韦斯特伍德,MA)是用于文化刺激在0.5赫兹,10 ms持续时间、32 V 72小时。媒体改变了每24小时。

2.8。细胞排列量化

72小时的电刺激后,立即细胞被固定在4%多聚甲醛在室温下20分钟。如果在媒体刺激细胞培养72小时或细胞刺激在Ca^{2 +}无媒体72小时也处理和染色如下所述基底和Ca^{2 +}端依赖量化一致性。在1 x PBS三洗之后,这些细胞被permeabilized Triton 1 x PBS为0.1%。细胞被重新洗,然后封锁在3%牛血清白蛋白在室温下1小时。细胞被沾染了10μg / mL fluorescein-5-maleimide 1小时在室温下在没有光的情况下,其次是洗涤。细胞成像前洗一个奥林巴斯IX70倒置荧光显微镜(美国纽约梅尔维尔)。二维荧光图像获得使用20 x目标和分析与斐济软件使用方向性函数获取的主要角细胞和细胞的百分比在一个标准差的方向施加电场(27]。

2.9。数据显示

荧光痕迹及共焦线扫描数据被视为个人观察代表多个录音或多个记录的平均值。荧光背景减去和策划为痕迹,在那里之前是休息的基底荧光细胞电刺激(首次振荡)或舒张期荧光之前一个振荡(后续振荡)。荧光细胞图像是二维图像代表多个试验。汇总数据的平均数±标准差测量,细胞的总数从4个不同的细胞。统计与学生的对比组进行以及。被认为具有统计显著性差异。

3所示。结果与讨论

3.1。全球Ca^{2 +}振荡电刺激人类心脏祖细胞

我们获得人类心脏组织孩子进行修复先天性心脏缺陷和利用这些样本为人类c - kit的隔离⁺确定特别关注国所描述的方法之前我们的实验室26,28- - - - - -31日]。我们的技术成果在~ 94%人口的细胞为干细胞标记阳性c - kit (26]。确定特别关注国与Ca加载^{2 +}染料fluo-4 / AM和刺激0.5或1 Hz。图1显示Ca代表^{2 +}振荡电刺激引发的年度"特别关注国"。胞质Ca迅速崛起^{2 +}观察其后frequency-independent胞质钙^{2 +}振荡(图1 (b))。在最初的振荡之后,后续振荡不下降恢复到基线水平,而是来到了一个新的水平的胞质Ca“舒张期”^{2 +}大概由于加载与Ca的细胞^{2 +}。然后,我们量化这些Ca的振幅^{2 +}振荡的频率和比较基于电刺激(0.5或1赫兹)。量化的振幅^{2 +}初始振荡振幅振荡显示无显著区别于0.5或1 Hz或后续振荡振幅(图1 (c))。此外,刺激频率并不影响的速率^{2 +}振荡观察这些细胞(图1 (d))。尽管随后的Ca^{2 +}振荡不依赖于刺激频率,很明显,电刺激启动Ca^{2 +}振荡,在维持胞质钙也起到了很重要的作用^{2 +}在这些细胞停止电刺激引起的胞质钙减少^{2 +}回到基线水平,废除了Ca^{2 +}振荡(图1 (e))。此外,所有细胞记录显示胞质钙的增加^{2 +}对电刺激的反应。我们没有观察到自发的Ca^{2 +}我们的记录条件下振荡在这些细胞之前已经报道过了,和我们的电诱发振荡振幅大约是4 - 6倍报告自发的Ca^{2 +}振荡(32]。

核的振幅^{2 +}振荡也是以电刺激年度"特别关注国",这些振荡的振幅明显高于相应的胞质Ca^{2 +}振荡。图2(一个)显示代表核和胞质Ca的痕迹^{2 +}振荡取自相同的细胞和对齐。这些数据在图进行了总结2 (b)。我们发现核Ca^{2 +}振荡的振幅明显高于胞质Ca^{2 +}振荡可能表明一个可能的角色增加核Ca^{2 +}在Ca的监管^{2 +}端依赖蛋白质和转录因子导致分化和血统的承诺年度"特别关注国"。激活的钙^{2 +}通过电刺激信号已被证明导致表型和基因型的变化在多种类型的成人祖细胞(19- - - - - -22]。我们没有观察到自发的Ca^{2 +}释放事件(Ca^{2 +}波或Ca^{2 +}火花)如果细胞在我们的实验条件下也没有成像激光激活Ca^{2 +}释放事件。总之,这些数据表明,电刺激的年度"特别关注国"抒发一个健壮的胞质及核Ca^{2 +}从这些细胞反应。

3.2。Ca^{2 +}确定特别关注国的振荡波的方式传播

Ca^{2 +}振荡进一步分析了二维和高速线扫描共焦成像来确定Ca的时空特性^{2 +}确定特别关注国的振荡。图3(一个)显示了一个代表2 d高速共焦图像蒙太奇的Ca的激活^{2 +}在中国共产党振荡。有趣的是,这^{2 +}释放开始于一个焦点区域的外围细胞然后传播波的方式通过细胞质和细胞核。从胞质荧光跟踪区域(蓝色)和原子核(红色)在图所示3 (b)。所示的痕迹,胞质Ca^{2 +}在该地区附近的Ca的网站^{2 +}释放激活增加第一(蓝色跟踪),Ca^{2 +}通过胞质信号向外传播,最终达到原子核和核Ca的增加^{2 +}(红色痕迹)。同样,一个更大的核Ca^{2 +}振荡与胞质Ca^{2 +}振荡中可以看到这些痕迹,红核跟踪达到一个更高的振幅比蓝色的胞质跟踪。这些痕迹显示Ca的时空异质性^{2 +}释放激活电刺激在年度"特别关注国",显示Ca^{2 +}振荡波的方式在这些细胞传播,启动外围的细胞和胞质及核内传播。

共焦扫描行被用来确认我们上面描述的二维数据。图3 (c)记录显示线的位置,图3 (d)由此产生的线扫描。这种扫描的代表12试验。如图所示,Ca^{2 +}释放激活细胞的电刺激从外围开始和传播行波的方式。我们也寻找细胞膜内陷,可能在中国共产党确定优惠网站类似于横小管(连接)在成人心室细胞。心肌细胞动作电位连接是sarcolemmal膜内陷,使表面膜接近肌浆网(SR)膜允许有效耦合的Ca^{2 +}条目通过sarcolemmal l型^{2 +}渠道和激活细胞内的Ca^{2 +}释放阿诺定SR受体(33]。年度"特别关注国"的染色膜染料Di-8-ANEPPS没有透露任何表面膜内陷表明这个特性没有贡献^{2 +}在年度"特别关注国"释放激活(图3 (e))。总之,电诱导Ca^{2 +}在年度"特别关注国"非常类似于Ca^{2 +}波传播在成人心室细胞(34]。尽管他们激活一般细胞的外围,他们似乎没有激活细胞内的任何更多的本地化优惠网站在同一地区或周边在随后的Ca^{2 +}振荡。一致的发现没有优惠Ca的网站^{2 +}释放电刺激期间,我们没有发现证据的连接已经被证明在心室细胞[优先发布网站33]。我们假设Ca^{2 +}发布启动发生在边缘细胞的细胞膜和内质网促进有效耦合Ca可能最亲密的在一起^{2 +}进入细胞内钙激活^{2 +}释放。

3.3。l型Ca^{2 +}通道和肌醇1 4 5-Trisphosphate受体与Ca^{2 +}在年度"特别关注国"对电刺激的反应

为了确定蛋白质参与Ca的激活^{2 +}在年度"特别关注国",我们使用特定关键Ca的抑制剂^{2 +}电刺激并进行免疫细胞化学前处理蛋白质来确认这些蛋白的表达。由于这些细胞容易对电刺激,压敏电阻器的l型^{2 +}通道高瓦斯)是我们的第一个候选蛋白调节年度"特别关注国"以电刺激的反应。预处理的细胞与确立抑制剂硝苯地平近5分钟取消电诱导胞质钙的增加^{2 +}在所有细胞记录,表明电诱导Ca^{2 +}振荡在年度"特别关注国"依赖于压敏电阻器的活动确立(图4)。在成人心脏细胞,Ca的条目^{2 +}进入细胞溶质通过确立电刺激启动大规模的Ca^{2 +}从肌浆网钙释放^{2 +}商店在阿诺定受体(RyR)。确定相同的过程是否出现在年度"特别关注国",我们第一次测试细胞外钙的必要性^{2 +}对电诱导Ca^{2 +}确定特别关注国的振荡。洗澡前5分钟记录的细胞没有Ca外部解决方案^{2 +}(0 Ca^{2 +}电诱导Ca)预防^{2 +}释放在年度"特别关注国"(图4)。细胞的预处理与盐酸丁卡因5分钟,RyR抑制剂,并没有阻止电诱导Ca^{2 +}发布在我们年度"特别关注国"(数据未显示);然而,预处理与硼酸2-aminoethoxydiphenyl 5分钟(2-APB),肌醇1,4,5-trisphosphate受体(IP₃R)抑制剂,明显降低电诱导Ca的振幅^{2 +}释放(图4)。IP₃R是另一个细胞内Ca^{2 +}释放通道中发现成人心脏细胞,也已被证明能够调解自发的Ca^{2 +}在多种类型的干细胞包括年度"特别关注国" (32,35],2-APB已被证明是一种抑制剂的IP₃R函数,尽管非特异性。

免疫细胞化学证实了确立和IP的存在₃在年度"特别关注国" R,而没有发现符合我们RyR功能研究(图5)。总之,这些数据表明,确立和IP₃R是关键蛋白质电诱导Ca^{2 +}振荡从人类年度"特别关注国",代表了一种之前从未描述通路的激活^{2 +}在这些细胞信号;然而,更多的实验是必要的来证实这些结果在人类年度"特别关注国"。

3.4。长期的文化刺激诱发共产党对齐

各向异性的心脏组织是一个关键的心脏的结构和功能的特点,促进了电气和机械活化的心肌。对齐的细胞将它们组织成一个组织如结构和可以提高干细胞的分化(36]。因此,我们试图确定长期的文化刺激会引起表型变化在年度"特别关注国"。年度"特别关注国"在媒体和受到刺激培养72小时的电刺激。年度"特别关注国"也被镀在媒体刺激和培养72小时没有电刺激作为如果控制或刺激在Ca^{2 +}无媒体作为刺激控制。细胞被固定,permeabilized孵化,10μg / mL fluorescein-5-maleimide和成像。如果和刺激的图像代表年度"特别关注国"图所示6(一)和总结图量化调整分数显示在图6 (b)。近50%的百分比增加细胞对齐平行于电场被认为经过72小时的电刺激相比,如果细胞或刺激细胞Ca^{2 +}自由媒体。这些数据说明了一个重要的表型变化与慢性电刺激和诱导在年度"特别关注国"还表示,这一变化依赖于细胞外钙的存在^{2 +}。我们的研究结果显示,长期的文化刺激诱发Ca^{2 +}端依赖各向异性在年度"特别关注国"对同轴度所需的组织架构很重要的细胞组织如结构防止电传导异常,泵功能受损,或者在中共植入心律失常。

4所示。结论

与Ca^{2 +}处理有关,直接或间接,几乎所有心肌细胞的属性包括兴奋收缩耦合和excitation-transcription耦合,一个坚实的理解这个过程在年度"特别关注国"的关键完全实现这些细胞的心脏治疗潜力给最近的研究表明,这些细胞不明显导致心脏肌细胞补充在活的有机体内(4- - - - - -6]。在这项研究中,我们还发现了一个新人类c - kit的财产⁺心脏祖细胞对电刺激启动细胞内Ca^{2 +}振荡。年度"特别关注国"人类儿科患者中分离的汇集来自多个捐赠减少病人变异性的影响在我们的实验。人类年度"特别关注国"的使用给我们的发现关联翻译成一个新的临床治疗策略使用,和我们的能力来执行活细胞胞质Ca的录音^{2 +}在电刺激年度"特别关注国"代表一个新颖的方法来理解这些细胞的生理学。这项工作所示,儿科年度"特别关注国"拥有广泛的功能性分子的元素Ca^{2 +}信号。Ca^{2 +}端依赖监管机制应该可以影响其分化潜能,我们推测,电刺激激活Ca^{2 +}端依赖增加细胞内的信号通路^{2 +}激活cardiospecific基因的转录。总之,我们是电诱导Ca^{2 +}在年度"特别关注国"通过测量信号的振幅胞质及核Ca^{2 +}振荡电刺激引起的识别的机制^{2 +}振荡启动和传播在整个细胞,还确定蛋白质参与这个过程的关键。因为我们的实验是在人类儿童完成年度"特别关注国",我们的结果可能是特定的细胞,并且需要进一步的实验来确定我们的结果是否物种——或者年龄相关性(37]。据我们所知,这是第一个研究报道的功能效应严重体外电刺激对人类年度"特别关注国"。本研究进一步加强了我们对共产党的了解生理,可用于直接与这些细胞未来的治疗策略。

缩写

中国共产党:	心脏祖细胞
Ca2 +:	钙
确立:	l型钙2 +通道
RyR:	阿诺定受体
知识产权3接待员:	肌醇1,4,5-trisphosphate受体。

相互竞争的利益

作者声明没有潜在的利益冲突。

作者的贡献

约书亚·t·麦克斯韦和迈克尔·e·戴维斯负责概念和设计的实验。收集、分析和解释数据是由约书亚·t·麦克斯韦,玛丽·b·瓦格纳和迈克尔·e·戴维斯。约书亚·t·麦克斯韦起草。所有作者都批准了最终版本的手稿。

确认

作者希望承认儿童的支持奇迹网络礼物送给儿童保健的亚特兰大。作者也希望承认的慷慨支持女士卡特里娜Ceccoli Darryll m . Ceccoli研究基金会,以及Keilani布莱恩Betkowski和Betkowski儿科研究基金。这项工作也由联邦基金支持国家心脏,肺和血液研究所HL088488玛丽瓦格纳以及美国心脏协会授予11 grnt7490000玛丽瓦格纳。