比较之间具备干细胞和基因表达的齿龈和儿童牙科毛囊

文摘

本研究的目的是比较差异基因表达和具备干细胞在人类齿龈和牙科毛囊(DFs)根据其生物学特性。齿龈()和DFs ()收集从18岁的孩子。比较基因表达谱收集使用互补脱氧核糖核酸微阵列。的开发、趋化性、间充质干细胞(msc),诱导多能干细胞(入侵)相关基因进行定量逆转录-聚合酶链反应(存在)。组织学分析使用hematoxylin-eosin和免疫组织化学染色。齿龈大角质化相关基因的表达,外胚层的开发和趋化性而DFs表现出更高的牙齿和胚胎发育相关基因的表达水平。中存在的表达水平分析表明,iPSc等因素SOX2,KLF4,原癌基因是,,在齿龈和倍VCAM1(CD146)和ALCAM(存在)和DFs的倍。msc标记包括相关的基因CD13,CD34,CD73,CD90,CD105在DFs上级表达。的结果中存在和包含IHC染色支持微阵列分析结果。有趣的是,这项研究表明“诱导多能性”细胞的转录因子表达上级齿龈。考虑到最小的手术不舒服和简单的可访问性,齿龈是一个很好的候选人再生牙科的干细胞来源。

1。介绍

组织工程使用间充质干细胞(msc)是其中一个最有前途的治疗策略,因为msc具有较高的增殖潜力和可能操纵允许分化移植前(1,2]。到目前为止,不同的人类牙齿干细胞从牙髓干细胞分离(DPSCs) [3),从脱落乳牙干细胞(棚)4),牙周韧带(PDL)干细胞(5从顶端乳头,干细胞(SCAP) [6),和牙科卵泡前体细胞(DFPCs) [7]。最近,越来越多的证据表明,齿龈派生间充质干细胞被孤立和特征multilineage分化能力和免疫调节特性8]。在牙科毛囊干细胞数量和齿龈近日披露,及相关基因表达模式尚不清楚。

牙科卵泡(DF)是一种结缔组织纤维组织囊周围釉质器和牙乳头发展中牙胚(9]。已经提出的DF细胞有能力分化成牙周膜组成的水门汀,牙槽骨,自由人民党(10,11]。尽管DFs的间充质来源相似,齿龈似乎表现出不同的功能活动期间维护组织的完整性和炎症反应(12]。它具有独特的无疤愈合过程相反的疤痕形成,受伤后经常观察到extraoral受损组织。所以牙龈组织是假定有独特的特征,加速伤口闭合,显示独特的具备干细胞诱导定向分化和再生的能力。

尽管一些在努力确定牙周组织中的差异表达的基因(12- - - - - -14),齿龈之间的遗传差异和DFs仍然未知。鉴于解剖和功能两个组织之间的差异,它是合理的假设也有不同的基因表达模式。因此,遗传调查有关epithelial-mesenchyme齿龈之间的交互和牙科卵泡可以提供至关重要在调节细胞群,在牙周组织再生的信号系统。本研究的目的是比较基因表达模式的齿龈和DFs提高我们理解不同的再生能力在DFs齿龈和组织分化的能力。

2。材料和方法

延世大学牙科医院的机构审查委员会批准了这一试验协议(批准号2-2015-0005)。所有受试者或其监护人提供书面知情同意。我们使用过程类似于歌最近应用et al。15和李et al。14]。

2.1。组织采样和RNA隔离

牙龈组织收集从儿童()(5男性和4女性,7 - 12岁)与健康的齿龈接受手术牙龈切除术的提取多余的牙齿,牙瘤,或原因矫正。从儿童DF组织获得(3)(6雄性和雌性,6 - 8岁),他们分开的日冕部分牙齿中提取多余的牙齿。在DF,一块提取插座周围牙龈组织仔细刮匙。这些样本立即冷冻和储存在液氮中。我们用新鲜组织而不是培养细胞,因为在组织层面,许多基因的基因表达反映了同步配置文件,可以提供额外的见解或组织功能的生理进程所介导的基因组合的协调行动。齿龈和DFs立即淹没在RLT缓冲区,这是一个组件的RNeasy纤维迷你包®(试剂盒、钙、美国)。RNA提取前,RLT缓冲区的组织均质使用子弹搅拌机®珠(美国纽约未来先进,Inc .)。总RNA提取齿龈和DFs使用RNeasy纤维迷你包(美国试剂盒)根据制造商的指示。提取的RNA在25筛选了μL无菌水。RNA浓度测定的吸光度值使用分光光度计波长260 nm (NanoDrop nd - 2000,热科学,美国)。本研究中使用的RNA样品260/280比例至少1.8。

2.2。互补脱氧核糖核酸微阵列构造和数据分析

全球基因表达分析使用Affymetrix基因芯片®人类基因第1.0寡核苷酸阵列(美国CA Affymetrix Inc .)。平均数量的RNA隔绝齿龈和DFs 1μg。推荐的制造商的协议,300 ng的总RNA从每个样本转换为双链的互补。互补脱氧核糖核酸是再生通过random-primed逆转录使用一个包含dUTP混合核苷酸。支离破碎,end-labeled cDNA是基因芯片杂交®人类基因第1.0位数组16小时45°C和60 rpm的末端转移酶反应将生物素化的dideoxynucleotide。杂交后,芯片被染色,洗Genechip流体站450®(Affymetrix)并使用一系列Genechip扫描仪扫描3000年G7®(Affymetrix)。确定基因差异表达之间的分离组织团体,单向方差分析进行鲁棒Multi-Average (RMA)表达式的值。应用于多个测试校正的值统计调整错误发现率。基因与调整统计值< 0.05提取。基因是齿龈或DFs中高度表达,表现出差异大于4倍信号值之间的控制和测试组选择深造。这些基因被分类基于可用的信息相关基因功能的基因本体KEGG数据库路径(http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp)。这个微阵列基因表达数据集被批准的综合性(GEO) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/);加入地理数据的数据集是GSE58480(齿龈)和GSE51342(牙科滤泡)。

2.3。定量rt - pcr

所需的单链互补dna聚合酶链反应(PCR)分析了使用500 ng提取总RNA为模板的逆转录(RT)(上标三世逆转录酶和随机引物,表达载体,英国)。RT反应在65°C 5分钟孵化,然后25°C(5分钟),50°C(1小时),70°C(15分钟),灭活逆转录酶的活动。合成cDNA稀释1:10在蒸馏水和用作定量rt - pcr模板使用ABI7300 rt - pcr系统(应用生物系统公司、沃灵顿、英国)。样本准备一式三份的体积25μ包含1 x L普遍TaqMan大师混合(4369016,应用生物系统公司),PCR引物为0.9μM,稀释的互补。放大条件50°C 2分钟和10分钟95°C,紧随其后的是40 95°C的周期为1分钟15秒和60°C。以下TaqMan基因表达分析引物(应用生物系统公司)使用:KRT6A, CXCL10、CSTA, AMBN, ADAM12, CXCL12, cMYC, KLF4, SOX2、CD106 (VCAM1),存在(ALCAM)和18 s rRNA。我们选择的代表两个已知基因组织和鲜为人知的基因参与他们的生理功能。

ABI 7300 SDS 1.3.1软件(应用生物系统公司)记录了记者和冷却器染料的荧光强度,并绘制结果和时间,所代表的周期数。放大图的检查日志早期阶段的产品上面积累背景(阈值周期数,Ct)获得一个精确的量化的初始目标。Ct值(阈值周期(Ct)数字)随后被用来确定ΔCt值(ΔCt = Ct基因- Ct的18 s rRNA控制)。相对表达式表示为应用方程的相对变化(ΔΔCt;ΔCt值)的差异。所有这些定量rt - pcr过程是获得一式三份数据。结果20使用SPSS软件分析(美国IL SPSS Inc .)。统计差异被Mann-Whitney计算测试,被认为是具有统计学意义。特定的引物检测ID和产品尺寸表列出了每个基因1。

2.4。免疫组织化学染色

免疫组织化学染色,牙龈组织和DF组织缓冲福尔马林固定在10% 1天,嵌入在石蜡,然后切割厚度为3μm。包含IHC染色的标本受到抗体特定CXCL10(兔多克隆,稀释1:50;Ab9807 Abcam,剑桥,英国)、CSTA(兔多克隆,稀释1:2000;Ab61223 Abcam), AMBN(兔多克隆,稀释1:200;Ab116347 Abcam)和CXCL12(兔多克隆,稀释1:50;Ab9797 Abcam)。内源性过氧化物酶活性是通过添加3%过氧化氢淬火。5%牛血清白蛋白的部分被孵化阻止非特异性结合。主要的抗体稀释促进最佳的染色,一夜之间,部分被孵化。孵化后,想象+系统HRP-Labeled聚合物anti-rabbit (K4003 Dako北美,Inc .)、钙、美国)申请20分钟。颜色开发了使用标记链霉亲和素生物素包(Dako)根据制造商的指示。

3所示。结果

3.1。基因表达谱的齿龈和牙科毛囊

1182 33297(3.6%)基因表现出绝对的表达改变至少4倍。555个基因的表达水平比DFs在齿龈高出4倍,而627个基因的表达水平在DFs至少4倍高于齿龈。整体的数据分布和频率经密度和框块标准化日志强度的比值平均强度。最后,进一步分析了829个基因,除了几个基因与未知的生物功能。对数据进行进一步的过滤,在表中列出的基因2和3根据它们的相对生物功能。齿龈,387个基因表达水平的调节4倍或更多DFs相比,尽管442个基因的表达水平被吹袭DFs调节相比,齿龈。

3.2。基因本体论分析

确定所选基因的生物学功能和特性,表达数据集被组织成基因本体财团(去)组大卫使用基于web的工具。这些基因被分类基于信息基因功能基因本体从KEGG数据库路径。图1显示了两个数据集分析(去类统计)。

共66个基因编码代谢和分解过程表达更丰富的比DFs齿龈。55基因相关结构过程,如角质化和细胞骨架组织上级表达在齿龈。另一方面,92年发展过程相关基因高表达的DFs的生物过程,包括牙发生骨化和骨矿化。基因和信号转导和细胞cycle-associated规章制度基因表达在DFs的较高水平。这些结果是一致的DFs较高的扩散率的发生。

3.3。确认使用定量rt - pcr基因差异表达

定量rt - pcr分析验证芯片结果。六个基因的表达水平的差异之间的齿龈和DFs选择至少4倍。Mann-Whitney”“测试进行关联的相对变化与微分表达式通过PCR检测。的表达水平KRT6A,CSTA,CXCL10是,,在齿龈倍,AMBN,ADAM12,CXCL12是,,倍在DFs(图2)。这些结果与芯片结果一致。

3.4。验证结果数组的免疫组织化学染色

以下四个蛋白质IHC研究的目标:CXCL10,CSTA,AMBN,CXCL12(图3)。CXCL10在上皮的面积广泛的染色齿龈。CSTA强烈彩色齿龈的在所有的层。AMBN不是彩色的齿龈但DFs的彩色外周围的区域。CXCL12在一个细胞层和彩色DFs的胶原结缔组织。结果是一致的与互补脱氧核糖核酸微阵列分析在蛋白质水平。

3.5。具备干细胞特性的表面蛋白标记

基于之前的研究,牙齿干细胞特征使用表面蛋白标记(16,17]。干细胞标记基因的表达比较结果列在图4(一)。我们的研究结果表明,DF组织派生MSC为间充质细胞群,更积极的MSC标记(包括CD13,CD34,CD73,CD90,CD105)根据国际社会细胞疗法18]。比较四个诱导多能干细胞的表达(万能)标记基因(即,OCT-3,4,SOX2,cMYC,KLF4在齿龈上级)表示。由于存在,SOX2,KLF4,cMYC出现58.5,12.43,和12.23倍的齿龈VCAM1 (CD106)和ALCAM(存在)分别为33.54和4.27倍DFs(图4 (b))。然而OCT-3 4没有显示一个明确的差异相对于其他标记(0.46倍的区别)。

4所示。讨论

在这项研究中,芯片技术比较分析关注差异基因表达谱的齿龈和DFs的孩子。大多数的基因(32115 33297 96.5%)显示出类似的表达水平之间的齿龈和DFs在使用4倍绝对改变截断值。大部分的基因编码的细胞粘附蛋白,蛋白质参与结构流程,或与细胞信号转导相关的蛋白质和监管。这一发现表明,齿龈和DFs分化成不同的组织之后虽然他们来源于间充质细胞。这可能是由于类似的胞内信号通路的调控。相比之下,大约有4%的基因差异表达上面所选阈值。虽然只占一小部分的整个基因阵列,这些基因可能会导致不同的生物功能和区分彼此的表型和形态。调查这一假设,比较基因表达分析基因的生物功能。

在齿龈,KRT1,CSTA,焦距表示在更高的水平。牙龈上皮为复层扁平角质化组织,这些角质化或角化细胞分化相关的基因。KRT1标志着分化的角质化途径,是表达角质化的领域(19]。CSTA是一种前体蛋白质cornified细胞信封的角化细胞,在表皮的开发和维护过程中发挥作用20.]。焦距必不可少的表皮内稳态的规定,与角蛋白中间丝(21]。表皮和外胚层发展基因强烈齿龈和DFs的调节。KRT6B和KRT6A明显调节在齿龈,与90.30 - 57.61倍的微分表达式,分别。这些蛋白质在wound-proximal迅速诱导表皮角质细胞在皮肤损伤和调节皮肤角化细胞的迁移潜力在伤口修复(22]。SCEL可能在装配或功能调控的蛋白质的角质化的信封(23]。这些基因可能表明存在的upregulation周转率快的齿龈,可能促进成纤维细胞增殖,这是组织修复的一个重要事件。

口腔黏膜受到暴露在化学物质和微生物等各种外在因素。基因与细胞凋亡和趋化性等CXCL10,CXCL17,ANLN,CCL21强烈表达了齿龈。CXCL10角化细胞分泌,是宿主免疫反应的一个标志24]。趋化因子起着重要的作用在Th1细胞的渗透和影响的齿龈加剧牙周疾病(25]。这些趋化因子的过度表达可能与免疫和炎症反应的生成和交付齿龈。

另一方面,牙齿和胚胎发育相关的基因表达明显高于DFs展出。这些结果是一致的与之前的DF基因表达的研究,比较DFs自由人民党(14]。表达的增加AMBN表明,DFs发挥重要作用在釉质基质形成和矿化26]。在这项研究中,WNT2和LEF1在DFs表明DFs参与调节信号因素的复杂的相互作用调节齿起始和形态发生27,28]。Runx2是一个关键的调节成骨细胞标记基因和促进间充质干细胞向成骨细胞的分化。文献表明,Runx2函数在牙齿间质和介导转导信号从口腔上皮到间质在牙齿发育(29日]。也影响的分子事件,调节齿eruption-the最重要的生理作用可能在喷发的网站(30.]。鉴于DFs的自适应作用,这些基因的存在表明DFs牙形成的核心作用。

基因编码的蛋白质改性,然后将信号分子蛋白往往表示上级DFs齿龈。的metalloprotease亚当12已经涉及到生物过程包括受精和神经发生在DFs (11]。MMP-13可能是一个主要的溶胶原的酶降解细胞外基质在牙齿喷发。MMP-13的上调意味着DFs协调具有重要功能的牙齿喷发(31日]。CXCL12是间充质干细胞的趋化因子,介导osteoclastogenesis这些细胞的抑制效果。这个因素可以表示DFs在牙齿发育包括上皮周围发展中牙芽(32]。

来验证芯片结果,6个基因的不同的功能选择定量rt - pcr分析。的表达水平KRT6A,CSTA,CXCL10在齿龈调节;AMBN,ADAM12,CXCL12在DFs调节。这些结果与芯片结果一致。为了更好地理解角色的差异表达基因,包含IHC分析识别功能在组织水平。CXCL10和CSTA强烈彩色在所有层的牙龈组织但在DFs没有染色。齿龈的基因高表达在上皮染色因为齿龈之间的显著差异结构和DFs的角质化的上皮细胞。AMBN和CXCL12被广泛的外部区域彩色DFs尤其是在釉质上皮细胞减少。

几个细胞具有干细胞特性与口腔组织的不同部分。他们参与组织修复和维护提出了(1]。虽然很难描述牙科使用表面蛋白标记干细胞,我们的结果表明相对超表达的重要标志包括CD13、CD34、CD73, CD105在DFs。这些都是无所不在地表达的所有牙齿干细胞或前体细胞(6,16]。除了CD90、CD13、CD34经常被援引dental-derived干细胞标记在先前的研究中,我们选择CD106(VCAM1)和存在(ALCAM)表达了更强烈的牙科毛囊。其他dental-derived干细胞标记基因包括CD29, CD90, CD73表示上级指示自我更新和分化能力在DFs (33]。

有趣的是,高水平的表达的齿龈iPS-associated标记(OCT4,cMYC、SOX2和KLK4)和DFs (34]。这些蛋白质是重要的转录因子维持自我更新的能力或多能性(35]。“诱导多能性”细胞提供了一个优势传统msc因为他们显示一个无限的增长能力,可以作为干细胞的不竭动力36]。类似的可比的报告分析,牙科组织派生mesenchymal-like干细胞可以重组成万能更有效率,相比其他成熟体细胞等人体成人msc和成人真皮成纤维细胞(37]。

口腔组织的可访问性,包括msc,可能仍然是有限的,因为这些细胞只能孤立在特定情况下,比如在提取的牙齿。然而,齿龈是其中一个最方便的通过活检组织收集,减少疤痕形成,减少手术后的捐赠者不适。此外,牙龈组织通常在儿童牙科手术切除,如手术提取影响牙齿和牙齿手术开放与延迟爆发,和这些组织通常被视为生物医学浪费。在实验室里,它也是可行的隔离牙龈组织中的干细胞根据其高度增殖的本性。因此,齿龈可以是一个重要的替代来源的干细胞再生牙科。如果干细胞分离出牙龈组织可以利用类似于储存脐带血,这些细胞的动态特性揭示潜在的使用。尽管这项研究仅限于监视表达式模式没有临床联系,比较基因表达分析不同的组织可能提供遗传信息的功能,如组织修复和牙齿发育。还需要进一步的调查来评估神经形成能力,成矿潜力,和细胞增殖能力的干细胞从齿龈和牙科毛囊基于本研究。

5。结论

本研究首次概要齿龈和DFs之间的基因差异表达。互补脱氧核糖核酸微阵列进行了描述和比较具备干细胞的分子指纹。DFs已经被认为是一种多功能组织根据他们的能力来生成牙骨质,骨头,自由人民党。而具备干细胞多能性的齿龈并未注意到,这项研究证明了“诱导多能性”细胞的转录因子表达水平上高于齿龈和最dental-derived干细胞标记在DFs强烈调节。考虑到最小的手术后的不适和简单的可访问性的牙龈组织,齿龈是一个很好的候选人再生牙科的干细胞来源。

信息披露

投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者欣然承认所有参与者的合作。这项研究是基础科学研究项目支持的韩国国家研究基金会(NRF)由教育部、科技部(2011 - 0022160和2012 r1a1a2041910)。

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