有效的动员很小的类似胚胎干细胞和造血干/祖细胞而不是内皮祖细胞的促卵泡激素疗法

文摘

最近,小鼠造血祖细胞(hsc)和非常小的类似胚胎干细胞(VSELs)证明表达的受体激素包括促卵泡激素(FSH)。这提高了是否FSH治疗在临床应用剂量可以动员干细胞/祖细胞在人类身上。我们评估的频率VSELs(称为林⁻CD235a⁻CD45⁻CD133⁺细胞),公司(称为林⁻CD235a⁻CD45⁺CD133⁺细胞)和内皮祖细胞(epc, CD34⁺CD144⁺,CD34⁺CD133⁺,CD34⁺CD309⁺CD133⁺十五女性患者接受FSH细胞)治疗。我们表明,FSH疗法导致显著增强在外周血(PB) VSELs和公司的数量。相比之下,EPC划定的反应模式不同的细胞表型不统一,我们没有观察到任何重要的EPC号码激素治疗后的变化。我们的数据表明FSH疗法动员VSELs和公司进入外周血,一方面支持他们的发展起源胚芽血统,另一方面FSH可以成为一种很有前途的候选人工具动员肝星状细胞和干细胞VSEL表型在临床的设置。

1。介绍

维护适当的大小和构成干细胞和祖细胞池是由连续的严格监管应对周围和远程编排的信号。有趣的是,性荷尔蒙出现最后重要的监管机构造血干/祖细胞(公司)扩散1]。最近,中田宏和他的同事们发现,造血干细胞(HSC)表达高水平的雌激素受体和雌二醇的政府增加HSC细胞分裂和自我更新2]。支持这种想法,小鼠公司一起很小的类似胚胎干细胞(VSELs)最近也证明表达pituitary-derived性激素受体,即促卵泡激素(FSH)、促黄体激素(LH) (3]。符合这一发现,小鼠公司和VSELs之后在体外或在活的有机体内FSH和LH刺激了高增生性反应就是明证BrdU合并。根据上述的观察,人们很容易假设发展肝星状细胞和VSELs之间的联系和存在的原始生殖细胞(包括),自然对性激素的反应(4,5]。

迄今为止,但是,它仍然未知,干细胞是否容易受到信号由性激素可用于动员这些细胞在临床的设置。此外,基于当前可用的稀缺的数据,很难推测如果疗法使用性激素会影响只有原始干细胞的命运和肝星状细胞或者说是会发挥他们的行动对所有祖细胞的数量。因此,在当前的研究中,我们希望调查FSH治疗在临床应用剂量的影响肝星状细胞的动员和VSELs以及内皮祖细胞(epc)的数量。在这项研究中,内皮祖细胞被选为一个例子很容易识别,高度分化,相对大量的祖细胞的数量,占内皮修复,从而在很大程度上有助于维护适当的脉管系统(6- - - - - -8]。另一方面,量化减少数量的内皮祖细胞被发现改善心血管疾病(CVD)的预测(9- - - - - -11]。因此,寻找治疗方法,旨在有效地动员内皮祖细胞功能不断的。

我们测试了在人体模型被广泛接受的行动方案FSH处理对三种干细胞/祖细胞子集在不同发展层次和分化水平,即VSELs,肝星状细胞和内皮祖细胞。此外,鉴于先前的报道表明基质派生的关键作用因子- 1 (SDF-1)动员干细胞(12- - - - - -14),我们着手分析临床应用促性腺激素的行为是否会影响不仅干细胞和祖细胞,而且介质调节他们的迁徙途径。

2。材料和方法

2.1。病人和FSH刺激

为了研究我们招募了15岁的女性年(范围:27-39年)准备在体外受精和接受控制FSH卵巢刺激。FSH刺激已经发起了第三天的月经周期和FSH剂量调整是基于病人年龄、卵巢储备,和以前的FSH刺激(如果执行)。只有两个患者接受基于FSH和LH的刺激。EDTA-anticoagulated外周血收集两次:前FSH卵巢刺激(或在5例在第一天这样的刺激)和年底FSH刺激(7 - 11天)。平均日剂量的FSH (Gonal F,默克公司Serono,或Puregon,先灵葆雅,或者,在两个病人,Menopur,显示出)是194.4 IU。详细分析患者的激素状态特征表1。


研究了参数	的意思是	SD	最低	最大

年龄(年)	32.9	3所示。9	27	39
刺激的持续时间(天)	8.8	1.1	8	11
平均日剂量的FSH (IU)	194.4	43.8	120年	262.5
成熟卵泡数量后,FSH刺激	10.9	3所示。4	5	16
雌二醇在7天(pg / mL)	1153年	405年	540年	1684年
孕激素在7天(ng / mL)	0.5	0.15	0.25	0.67
LH在7天(个人/毫升)	1.1	0.67	0.31	2.33
雌二醇在最后一天(pg / mL)	2314年	1367年	1367年	3294年
在最后一天黄体酮(ng / mL)	0.8	0.33	0.32	1.52
LH在最后一天(个人/毫升)	1.7	0.85	0.72	2.97

所有病人的样本收集的伦理委员会批准比亚韦斯托克的医科大学。

2.2。细胞外染色和流式细胞术

170年μL新鲜EDTA-anticoagulated全血沾了组小鼠反单克隆抗体的详细描述表2。样品在室温下培养30分钟在黑暗中。此后,2毫升的流式细胞仪赖氨酸溶液(BD)补充说,紧随其后的是15分钟在黑暗中孵化。细胞被洗两次冷PBS(磷酸盐)和固定CellFix (BD生物科学)。适当的fluorescence-minus-one (FMO)控制用于设置补偿和保证正确的选通。肝星状细胞的控制策略和VSELs如图1,而控制策略确定CD34⁺细胞和内皮祖细胞呈现在图2。样本获得使用FACSCalibur流式细胞分析仪(BD生物科学)。获得的数据进行了分析使用FlowJo版本7.6.5软件(树明星)。


的名字	克隆	同形像统计图	格式	额外的信息	制造商

鼠标反anti-CD34	8 g12	IgG1	FITC	这种抗体结合105 - 120 kDa单链跨膜糖蛋白,试管	正欲
林反血统鸡尾酒2 (2)			FITC		正欲
鼠标反anti-CD3	SK7	IgG1		这种抗体结合链的CD3抗原,试管
鼠标反anti-CD19	SJ25C1	IgG1		这一抗体识别抗原90 kDa,试管
鼠标反anti-CD20	L27	IgG1		这种抗体结合磷蛋白质的分子量35或37 kilodaltons (kDa),根据程度的磷酸化,试管
鼠标反anti-CD14	米票数	IgG2b		这种抗体反应与53-55 kDa glycosylphosphatidylinositol——(GPI)固定和单链糖蛋白,试管
鼠标反anti-CD56	NCAM16.2	IgG2b		这一抗体识别高度糖140 kDa NCAM的同种型免疫球蛋白(Ig)总科的一员,试管
鼠标反anti-CD235a	GA-R2	IgG2b	FITC	这个抗体与血型糖蛋白结合,sialoglycoprotein礼物对人类红细胞(RBC)和红细胞前体细胞	正欲
鼠标反anti-CD45	HI30	IgG1	体育	这种抗体结合190、190、205和220 kDa蛋白亚型,RUO	正欲
鼠标反anti-CD144	55-7H1	IgG1	体育	这种抗体与calcium-independent反应抗原决定基在钙粘着蛋白5日RUO	正欲
鼠标反anti-CD309	89106年	IgG1	体育	这个抗体与CD309反应(血管内皮生长因子受体2 (VEGFR-2))	正欲
鼠标反anti-CD133	AC133	IgG1	APC	这种抗体反应CD133抗原决定基1,RUO	Miltenyi研究

试管:这是用于克隆在体外诊断;RUO:适用于研究只使用。

图1

代表示威的控制策略对HSC和VSELs流式细胞仪阴谋。首先,2 - 4μm大小事件的基于一个向前和侧散射(FSC / SSC) (a),然后2 - 4点阴谋μ米门在样本数据可视化使用FSC / SSC点阴谋(b)。接下来,2 - 4μ事件显示在直方图的情节(黑峰,FMO控制;灰色的峰值确定阳性染色)和林⁻CD235a⁻事件是封闭的(c)。最后,FMO控制被用来设置HSC和VSELs门和排除背景噪声(d)。接下来,肝星状细胞被定义为林⁻CD235a⁻CD45⁺CD133⁺细胞(上层门)和VSELs被称为林⁻CD235a⁻CD45⁻CD133⁺细胞(e)。

图2

代表流式细胞仪情节展示CD34的控制策略⁺细胞和内皮祖细胞。PBMCs封闭的基于向前和侧散射(FSC / SSC)情节CD34 (b)⁺细胞被封闭在CD34 / SSC情节CD34 (c)⁺CD144⁺细胞(右上象限,Q2)封闭的基于CD34 / CD144点情节(d)。FMO控制被用来设置盖茨(a)。为了确定CD34⁺CD144⁺CD309⁺细胞数量,PBMC事件显示FMO的基础上控制样本(e)和盖茨将排除随机噪声。接下来,盖茨是可视化CD34 / CD133 (f)和CD34的阴谋⁺CD133⁺细胞被封闭(右上象限,Q2)。最后,CD34⁺CD133⁺CD309⁺细胞子集被封闭在直方图的情节(g)(黑峰,控制;灰色的巅峰,正染色)。

2.3。酶联免疫吸附测定

SDF-1等离子体水平量化通过商业化酶联免疫吸附分析(ELISA、DuoSet、研发)。根据制造商的指示直接样本化验。样本中的蛋白质含量计算的参考曲线生成的使用参考标准。用ELISA检测范围的设定7之间,81和500 pg / mL。样品进行了分析与自动光吸光度读者(LEDETEC 96系统)。2000年MicroWin结果计算软件。

2.4。统计数据

统计分析进行了使用GraphPad棱镜6 (GraphPad软件)。Wilcoxon测试使用。被认为是具有统计学意义的差异。结果表现为中位数(四分位范围)。

3所示。结果

首先,我们分析了影响FSH管理循环肝星状细胞(图的频率3(一个))。我们发现林FSH处理导致统计上显著的增加⁻CD133⁺CD45⁺HSC数量(从125.5(66 - 133.5),175.5(83.5 - -428.8)细胞每170人μL(全血),)。同样,FSH林治疗导致显著增强⁻CD133⁺CD45⁻VSEL水平(图3 (b))。FSH疗法后,VSEL数量从4个增加细胞(3-11 5)34(16,5-57)每170人μL(全血()。

(一)

(b)

接下来,我们着手调查的影响FSH CD34在整个人口的频率管理⁺细胞和内皮祖细胞的数量并由CD34等表型⁺CD144⁺,CD34⁺CD133⁺,CD34⁺CD133⁺CD309⁺细胞。值得注意的是,我们没有观察到任何重大变化单一CD34的数量⁺细胞后FSH政府(图4(一))。同样地,我们没有展示任何重要的内皮祖细胞的数量确定为CD34的变化⁺CD144⁺细胞(图4 (b)),CD34⁺CD133⁺细胞(图4 (c)),CD34⁺CD133⁺CD309⁺细胞(图4 (d))。

(一)

(b)

(c)

(d)

最后,我们想调查FSH政府是否影响血清水平的SDF-1,动员关键因素之一VSELs和肝星状细胞(图5)。然而,我们并没有发现任何显著改变SDF-1浓度在完成FSH管理局()。

4所示。讨论

我们证明了管理pituitary-derived性激素在临床应用剂量允许高效的动员VSELs频率和肝星状细胞而不是内皮祖细胞。这些发现建立一个平台,开发新颖的基于激素的治疗策略,旨在增强VSELs或肝星状细胞数量的条件,需要有效的动员这些细胞的子集。

值得注意的是,这是表明促性腺激素荷尔蒙和干细胞之间的联系可能远远超出了对VSELs和肝星状细胞的影响。天所和同事表明FSH是至关重要的监管机构之一胚干细胞(GSC)的命运15]。FSH监管神经胶质细胞的稳态控制line-derived神经营养因子(GDNF)进而加速gsc扩散。这些发现表明,监管GCS人口规模受GDNF / FSH通路。它还有待建立的影响FSH治疗VSELs和肝星状细胞是介导GDNF的相关操作。最近,与这种想法,Tourkova和他的同事们表明,间充质干细胞(MSC)表达FSH-R回应FSH的粘附和增殖加法(16]。此外,短期治疗的FSH剂量与观察到更年期扩增MSC增殖的影响与Erk1/2磷酸化相关信号。

仍然是难以捉摸的动员效果是否VSELs FSH / LH治疗和肝星状细胞在女性患者与他们直接作用于骨骨髓来源干细胞或者说是在卵巢干细胞动员本地化。另一方面,两种可能性不需要互斥的。以前,这是表明,卵巢中发现的干细胞的表型VSELs他们可以产生更多的差异化卵巢GCS [17,18]。这被后来的研究证实杰克逊和同事证明VSELs gsc在场在卵巢表面上皮(OSE) [19]。在这项研究中,FSH处理导致显著增加茎cell-harboring大阪证交所,从卵巢释放功能的干细胞。此外,帕特尔和他的同事们发现,FSH处理导致增加ovary-associated干细胞的克隆扩张(VSELs和卵巢方面,FSH受体表达,而只在卵巢干细胞而不是在卵巢上皮细胞(20.]。同样,Sriraman和他的同事们研究发现,PMSG (FSH模拟)增加VSELs数字chemoablated雌性老鼠(21]。然而,如何促性腺激素激素对干细胞的影响人口规模与卵巢需要登记的男性患者接受治疗FSH和LH,条件是由于道德原因肯定不能达到设置的当前的研究。

值得注意的是,在我们的研究中,我们没有展示任何重大影响促性腺激素疗法对内皮祖细胞的水平。与这个概念,在一个代表性的炎症性肠病的患者,Garolla和他的同事们没有发现FSH和LH水平之间的关系,内皮祖细胞的数量22]。然而在一些对比,减少内皮祖细胞的数量被发现在hypogonadotropic hypogonadal男性患者FSH和LH水平较低(23]。有趣的是,FSH受体表达血管内皮的大多数转移性肿瘤(24]。因此,尽管缺乏促性腺激素疗法的重要影响循环内皮祖细胞的数量在最近的研究中,分析相互之间的关系的主题内皮祖细胞,内皮细胞,pituitary-derived性激素的确值得进一步的调查。

我们的研究结果也带来了一个有趣的视角对于理解干细胞和祖细胞之间的关系和FSH和LH水平升高检测到老年时代。根据我们的数据,它很容易假设增强老年人的FSH和LH水平可以代表机制提高否则减少造血干细胞数量减少。同样,这在小鼠模型观察以前记录,其中VSELs的数量是最高的年轻学科,随着年龄的增长(减少25]。

考虑到这些数据,FSH和LH治疗可能成为一个有吸引力的和容易的工具使动员干细胞在再生医学。然而,考虑到广泛的性激素的产生影响,这种方法需要的安全检查进一步临床研究执行在不同组的患者包括男性。必须记住,FSH和LH被发现参与某些肿瘤的生长。作为一个例子,霁和同事们发现信使rna编码的水平明显高于FSH受体(FSHR)侵入性卵巢肿瘤相比低恶性肿瘤和正常的大阪证交所(26]。同样,据报道,过度的FSHR大阪证交所细胞导致的表达增加蛋白质参与卵巢癌发展如表皮生长因子受体、原癌基因和HER2 / neu。因此任何治疗策略旨在增强干细胞/祖细胞池的大小通过使用gonadotropin-based疗法需要仔细研究的临床安全性。

总之,我们的数据支持最新发现的角色FSH VSELs和肝星状细胞的生物学报告我们组在小鼠模型4]。因此,这些数据支持的概念发展生殖细胞系之间的联系,VSELs,造血作用[4,5]。最后,我们证明了在这里第一次动员干细胞VSELs表型和公司可以通过使用基于pituitary-derived性激素广泛使用的治疗方案。

利益冲突

路易斯维尔大学的主人VSEL VSELs和一些地区的专利技术,这是授权给Neostem Inc .)、纽约。作者都没有任何Neostem Inc .的股票,纽约,或任何其他干细胞生物技术公司。

作者的贡献

莫妮卡Zbucka-Kretowska、Andrzej Eljaszewicz Danuta Lipinska同样导致了工作。

确认

基金支持的研究是领先的国家研究中心(知道)比亚韦斯托克的医科大学。作者要感谢比亚韦斯托克医科大学的社会科学的学生帮助提供血液样本。

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