肝星状细胞衍生APAP即防止肝细胞损伤诱导的微泡/ H₂O₂

文摘

肝星状细胞(hsc),先前描述的肝脏特异性间充质干细胞(msc),似乎有助于肝脏再生。(MVs)纳米微泡膜碎片,可以调节靶细胞功能转移内容的母细胞。本研究的目的是调查的影响HSC-derived MVs xenobiotic-induced肝损伤。老鼠和人类肝细胞,BRL-3A和hl - 7702,被用来构建肝细胞损伤模型,n-acetyl-p-aminophenol n - (APAP即)或H₂O₂治疗。MVs是准备从人类和大鼠肝星状细胞,LX-2,和HST-T6,分别添加到受伤BRL-3A和hl - 7702肝细胞。MTT分析是用来确定细胞增殖。细胞凋亡分析通过流式细胞术和hoechst33258染色。免疫印迹分析被用于激活caspase-3的表达。肝损伤指标,丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)的培养基也被评估。结果表明,(1)HSC-MVs源自LX-2和HST-T6积极CD90膜联蛋白V表面标记;(2)HSC-MVs摄入量有关改善肝细胞在损伤模型的可行性;(3)HSC-MVs剂量依赖性抑制APAP即/ H₂O₂诱导肝细胞凋亡和激活caspase-3表达式和LDH泄漏,ALT和AST。我们的研究结果表明,HSC-derived MVs保护肝细胞免受toxicant-induced受伤。

1。介绍

肝脏是人体的重要器官新陈代谢的主要营养成分和生物转化的主要场所。多种因素会导致肝损伤,如遗传和代谢因素、药物、病毒(1,2]。慢性肝损伤甚至可以最终导致肝纤维化和肝细胞癌(3- - - - - -5]。尽管肝脏再生的能力通过成熟的复制功能肝细胞(6)的急性和严重的肝损伤,有时甚至有生命当细胞死亡超过肝脏的self-regenerative能力,如肝功能衰竭(7]。目前常规药物治疗轻微肝损伤的影响不大。当发生肝功能衰竭等严重肝损伤最有效的治疗方法是原位肝移植。但这种治疗非常的短缺和高成本的限制捐赠器官和免疫抑制药物的需要(8,9]。因此,其他选项/方法可以有效改善肝脏再生,防止肝损伤是急需的。

肝星状细胞(hsc)是肝脏特异性间充质干细胞,它们位于肝细胞和正弦内皮细胞之间的空间Disse [10]。最近的证据表明,肝星状细胞在肝扮演关键角色生理和纤维发生(11]。在稳态条件下,肝星状细胞储存维生素A和保持低增殖活动(12]。当激活时,肝星状细胞可以分化成hepatocyte-like细胞和促进肝细胞增殖和肝脏再生(10,13]。此外,激活肝星状细胞加速肝脏再生通过产生血管新生因子以及细胞因子,比如HGF能增强肝脏祖细胞和肝细胞的增殖(14- - - - - -16]。

细胞微泡(MVs), 0.1 - 1μ米大小,是由各种类型的细胞分泌进行压力、激活、细胞凋亡。他们可以与目标细胞融合和影响细胞功能通过转让或交付消息接收者细胞蛋白质和基因。最近的研究表明,MVs来源于干细胞/祖/间充质基质细胞(msc)拥有治疗潜力类似父母细胞(17,18]。和MVs疗法可能比msc对他们更有利更不可能影响系统环境和较小的规模,使得它更容易通过组织障碍(19,20.]。然而,MVs来源于肝星状细胞能否预防肝损伤父母细胞仍然是未知的。

在这项工作中,我们将探索MVs的影响来源于肝星状细胞增殖和凋亡的肝细胞在体外药物引起的损伤模型。

2。材料和方法

2.1。细胞系和文化条件

LX-2(人类肝星状细胞)和HST-T6(老鼠的肝星状细胞)是用于生成微泡。与此同时,正常的人类肝细胞(hl - 7702)和小鼠肝细胞(BRL-3A)将建立肝损伤模型。各种肝损伤模型的证据将有助于加强MVs的治疗效果。

所有细胞都来自广东乔伊斯生物技术有限公司100 mm细胞培养的细胞培养的菜肴在DMEM (Hyclone),补充10%胎牛血清(的边后卫,GIBCO), 100 U /毫升青霉素、链霉素和100 U /毫升37°C孵化器CO2/95%空气的5%。

2.2。肝细胞的损伤模型

后的单层细胞在96孔板成为支流,BRL-3A和hl - 7702细胞处理一系列APAP即浓度(3.2毫米、4.8毫米、6.4毫米、8毫米和9.6毫米)或H₂O₂(240μ米、360μ米、480μ米、600μ米,720μ米)与10%的血清DMEM培养基24小时(6]。24小时的治疗后,MTT试验控制,APAP即或h₂O₂暴露的细胞。的EC50值APAP即和H₂O₂测定,用于建立体外肝细胞损伤模型。

2.3。的制备和表征HSC-Derived MVs

从人类星状细胞LX-2 MVs生成()和大鼠星状细胞HST-T6 ()如前所述21]。总之,LX-2 HST-T6细胞培养在100 mm细胞培养菜肴。融合细胞增加到80%时,LX-2和HST-T6文化洗了PBS和新鲜的生长培养基培养24小时。然后细胞中收集和离心机重300克,15分钟,其次是2000 g, 30分钟,去除细胞和细胞碎片。脱细胞培养基是离心机在20000 g,颗粒MVs 2 h。颗粒状MVs resuspended有20 nm-filtered(绘画纸、匹兹堡、PA)磷酸盐(PBS)。

肝星状细胞已被证明表达古典间充质标记(CD90),可以通过流式细胞术[量化22]。定义HSC-MVs,样本沾PE-conjugated anti-mouse CD90, alexa - 488标签膜联蛋白V, 5μ分别L。所有抗体都购自eBioscience (CA)圣地亚哥。孵化后,贴上HSC-MVs resuspended PBS和分析流式细胞术之下。的大小和数量HSC-EMVs被纳米粒子跟踪测量分析(莫尔文、英国)。

2.4。体外细胞的可行性分析

细胞的异常hl - 7702和BRL-3A被MTT测试(3 - 4,5-dimethylthiazyol-2yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴)(σ,5毫克/毫升)试验(23]。细胞被播种在2×10³/在96孔板和100年培养μ与10%的边后卫L DMEM培养基(补充)。建立体外肝损伤模型,hl - 7702细胞处理8毫米APAP即或600年μM H₂O₂和BRL-3A细胞治疗与6.4毫米APAP即或480μM H₂O₂。确定保护HSC-MVs对受伤的肝细胞增殖的影响,hl - 7702细胞与不同浓度的cocultured(2×10⁶/毫升,2×10⁷/毫升,2×10⁸/毫升,分别地。,defined as,,当APAP即/ H)₂O₂管理,BRL-3A细胞与不同浓度的cocultured(2×10⁶/毫升,2×10⁷/毫升,2×10⁸/毫升,分别地。,defined as L-,M -和H -当APAP即/ H)₂O₂是补充道。孵化后,细胞生存能力在48小时时间点进行了测试。

PBS细胞治疗作为对照组。积极组织为肝细胞处理APAP即或H₂O₂也没有MVs孵化。经过孵化的毒物和不同浓度的MVs,细胞生存能力与MTT试验评估。麻省理工的解决方案(20μL)添加和孵化为4 h在37°C细胞;150μL DMSO溶液添加到每个好和细胞孵育20分钟在37°C。细胞的光学密度(OD)值是读取在490 nm标(BioTek)。测量进行了48 h。细胞一式三份井在每个时间点,检查和实验重复了三次。结果计算出的值在三个独立的实验中获得的。

2.5。赫斯特33258年染色分析细胞凋亡

细胞凋亡是由赫斯特33258年分析染色,我们先前描述(23]。总之,6-well盘子,hl - 7702或BRL-3A细胞被播种密度的2×10⁵/在2毫升DMEM培养基。然后用APAP即/ H细胞治疗₂O₂和HSC-MVs。24小时处理后,细胞被固定的,与PBS洗,沾hoechst33258染色方案根据制造商的指示(Beyotime)和荧光显微镜下观察。五个独立的字段进行评估每个好,平均阳性细胞数量和总细胞领域(放大200倍)测定。细胞的凋亡率被定义为阳性细胞的比例与总细胞。

2.6。流式细胞术分析细胞凋亡

hl - 7702和BRL-3A细胞被视为上面提到的。细胞凋亡的检测进行了使用一个膜联蛋白V-PE / 7-AAD凋亡检测设备(BD生物科学)如前所述23]。简单地说,细胞用PBS, resuspended 100μ与5 L 1×annexin-binding缓冲区,孵化μL PE-conjugated膜联蛋白V和5μL 7-amino-actinomycin (7-AAD) 15分钟在黑暗中,然后通过流式细胞术分析。细胞染色与膜联蛋白V-PE和7-AAD被认为是细胞凋亡hl - 7702或BRL-3A末和彩色只有膜联蛋白V-PE被认为是早期凋亡细胞(24]。实验重复了三次。每组每个实验和三个板块进行了分析。

2.7。代谢物检测肝细胞

丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)通常测量的检测肝脏破坏(25,26]。在目前的研究中,LDH泄漏评估通过测量LDH的活性在细胞培养媒体LDH测定工具包(Beyotime,中国)。此外,AST和ALT在细胞培养媒体也以各自的检测分析试剂盒(南京建成生物工程研究所、中国)。短暂,hl - 7702和BRL-3A细胞被置于6-well盘子。细胞融合后增长到80%,被视为我们上面所描述的。每组治疗24小时后,培养基收集测量LDH水平,AST和ALT根据生产指令。

2.8。免疫印迹分析

从hl - 7702细胞和BRL-3A细胞蛋白提取与裂解缓冲。蛋白溶解产物通过sds - page凝胶电泳和转移到PVDF膜。1 h和孵化的膜被封锁主要抗体caspase-3(美国CST)和β美国肌动蛋白(CST)一夜之间在4°C。与TBST洗涤3次,30分钟后,免疫反应性的可视化是发射极耦合逻辑(Amersham、瑞典)的解决方案。

2.9。统计分析

数据都表示为均值±SD。多个双向方差分析进行比较。比较了两组用一个学生的表现以及(GraphPad棱镜5软件)。被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。的EC50值APAP即和H₂O₂

如表所示1,EC50值APAP即或H₂O₂在BRL-3A和hl - 7702肝细胞被MTT分析计算。EC50 APAP即和H的价值₂O₂在BRL-3A细胞毫米,μM,分别对hl - 7702细胞毫米和600±120μm . APAP即的EC50值和H₂O₂被用于生产体外肝细胞损伤模型。

3.2。HST-T6-MVs和LX-2-MVs的特点

流仪分析表明两者和膜联蛋白V和肝星状细胞表达特定标记CD90(图1(一))。纳米粒子跟踪分析(NTA)分析表明,HSC-MVs在100 nm - 400 nm,大小和HSC-MVs约为2×10的浓度¹⁰/ 30毫升细胞培养基(图1 (b))。

3.3。HSC-MVs增加细胞活力BRL-3A和hl - 7702肝细胞损伤模型

肝癌细胞增殖试验表明,BRL-3A和hl - 7702肝细胞受伤后APAP即或H₂O₂治疗48 h(治疗控制和车辆;数据2(一个)和2 (b))。我们发现HSC-MVs显著增加APAP即/ H的增殖能力₂O₂治疗肝细胞(和治疗控制;数据2(一个)和2 (b))。此外,我们的研究结果显示出剂量反应HSC-MVs促进BRL-3A的扩散效应和hl - 7702。M-HSC-MVs治疗细胞的生存能力高于L-HSC-MVs细胞治疗组(与L-HSC-MVs;数据2(一个)和2 (b)),H-HSC-MVs治疗肝细胞细胞生存能力(最高和M-HSC-MVs;数据2(一个)和2 (b))。

3.4。HSC-MVs减少BRL-3A和hl - 7702细胞凋亡的肝细胞损伤模型

赫斯特32258染色膜联蛋白V-PE / 7-AAD分析表明APAP即和H₂O₂诱导细胞凋亡在BRL-3A和hl - 7702细胞(与车辆;数据3(一个),3 (b),3 (c),3 (d))。HSC-MVs治疗显著降低细胞凋亡率和裂解caspase-3蛋白质含量与对照组相比(和治疗控制;数据3(一个),3 (b),3 (c),3 (d),3 (e),3 (f))。与此同时,HSC-MVs巧克力摄入量有关的保护作用。细胞凋亡率和裂解caspase-3 M-HSC-MVs治疗细胞的表达降低与L-HSC-MVs治疗细胞(与L-HSC-MVs;数据3(一个),3 (b),3 (c),3 (d),3 (e),3 (f)),而H-HSC-MVs最受伤的肝细胞保护作用(与M-HSC-MVs;数据3(一个),3 (b),3 (c),3 (d),3 (e),3 (f))。

3.5。HSC-MVs减少水平的AST、ALT和LDH的培养基BRL-3A和hl - 7702肝细胞损伤模型

我们的结果表明,AST的水平,ALT, LDH的培养基BRL-3A和hl - 7702肝细胞处理后显著增加APAP即或H₂O₂24 h(与车辆;图4)。HSC-MVs BRL-3A治疗和hl - 7702细胞,泄漏AST、ALT和LDH显著下降(与治疗控制;数据4(一)和4(b))。我们还发现,保护作用的HSC-MVs摄入量有关(H-HSC-MVs与M-HSC-MVs;M-HSC-MVs与L-HSC-MVs;数据3(一个),3 (b),3 (c),3 (d))。

4所示。讨论

本研究评估MVs来源于肝星状细胞的作用衰减xenobiotic-induced肝损伤。为此,我们探索了王亚南HSC-MVs APAP即和H₂O₂诱导肝细胞(BRL-3A或hl - 7702)损伤模型。肝星状细胞是肝脏特异性间充质细胞,归航正弦内皮细胞和肝上皮细胞(27]。经典肝星状细胞表达间充质制造商(CD105, CD44, CD29、CD13 CD90),但不是内皮标记CD31,内皮祖细胞标志物CD133或造血标记(CD45和CD34)。LX-2和HST-T6肝星状细胞(22]。MVs源自HSC-T6和LX-2细胞经检测的表达CD90 (HSC特定标记)和膜联蛋白V (MVs特定标记)28]。更重要的是,我们发现HSC-MVs剂量依赖性增加肝细胞生存能力和减少细胞凋亡的肝损伤模型。保护作用的能力也能得到印证HSC-MVs抑制ALT、AST、LDH泄漏引起的肝细胞APAP即和H₂O₂。

MVs是亚微米膜碎片从几乎所有的细胞类型和参与调节靶细胞的各种功能(29日]。茎细胞MVs已报告参加各种组织损伤的修复(30.,31日]。在目前的研究中,我们首次报道对外源性物质HSC-MVs受伤的肝细胞的治疗效果。APAP即和H₂O₂两个著名的hepatotoxicants调解肝损伤。APAP即和H₂O₂代表两种不同机制的肝脏毒性。APAP即引起肝损伤的共价修饰蛋白质的目标和氧化应激损伤介导的通路,而H₂O₂通过氧化应激通路介导肝损伤分别(6,32]。APAP即和H₂O₂诱导细胞凋亡的肝细胞(33,34]。因此,APAP即和H₂O₂被用来构建体外肝损伤模型。我们的研究结果表明,MVs来源于LX-2和HST-T6剂量依赖性促进细胞生存能力和抑制细胞凋亡和裂解caspase-3表达在我们的模型系统。这些研究结果支持先前的报道显示肝星状细胞来修复受伤的肝脏(10,14]。我们的研究结果显示,HSC-MVs可以发挥父母细胞的治疗效果,添加新的治疗肝星状细胞的机制。值得注意的是,我们的数据表明,HSC-MVs可能有一些特权作为新的治疗途径治疗肝细胞损伤,因为他们不太可能引发免疫反应和体内肿瘤发生。

肝酶,特别是ALT、AST、LDH,通常以筛查的检测化验肝损伤(25,26,35]。LDH泄漏,AST和ALT显著增加肝细胞暴露于hepatotoxicant [36]。在这项研究中,我们发现,ALT、AST、LDH释放hl - 7702和BRL-3A肝细胞明显增加肝细胞暴露于APAP即后或H₂O₂。符合我们的期望,MVs剂量依赖性的影响降低ALT的中等水平,AST、LDH。这是符合体内最近的一项研究中,液来源于间充质干细胞被发现降低生化参数(ALT和AST)和肝细胞损伤引起的亚兰(6]。这些结果提供进一步的证据支持HSC-MVs在肝细胞损伤的保护作用。这种效应是否与MV膜合并/融合与受伤的细胞的膜还有待进一步研究。

5。结论

总之,治疗HSC-derived MVs可以保护肝细胞免受toxicant-induced受伤。MVs的有益效应很可能通过维持增殖活性和肝细胞的凋亡和antiautophagy能力。HSC-MVs可能提供一个新的治疗药物引起的肝毒性,代替传统肝移植的有限的可用性。但是,还需要进一步的调查来确定MVs的王亚南组件和操作的具体分子机制。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

人黄和Qunwen锅了同样的工作。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金(国家自然科学基金委,不。81400360)、竞争项目湛江(2014 a01016),和特殊资金建设博士学位的广东医学院(2 jb12010)。

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