隔离一个基于VE-Cadherin ES-Derived心血管多功能细胞群子活动

文摘

胚胎干细胞(ES)或诱导多能干细胞(iPS)细胞是心肌细胞生成的重要来源,针对再生疗法。几个体外协议目前使用的分化,但细胞方法的价值仍不清楚。在这里,我们描述一个心血管祖人口派生ES分化期间,选择基于VE-cadherin后启动子(Pvec)活动。ESCs转基因有一个游离向量,使嘌呤霉素抗性基因的表达,在Pvec活动。Puromycin-surviving细胞显示心脏和血管内皮祖细胞特征。心脏和血管内皮dual-progenitor人口的扩张和自我更新(CEDP)通过Wnt /β连环蛋白通路激活。CEDPs表达早期心脏发育stage-specific标记而不是分化心肌细胞的标志。同样,CEDPs表达内皮标记。然而,CEDPs可以接受cTnT分化为主⁺(~ 47%)和VE-cadherin⁺(~ 28%)细胞。移植CEDPs在左心室心的成年老鼠表明CEDPs-derived细胞存活和分化移植后体内至少14天。一部小说,dual-progenitor人口被隔离在ESCs分化,基于Pvec活动。这个家族可以自我更新,允许其维护心血管祖细胞的来源,是一个有用的来源再生方法。

1。介绍

心室心肌再生已经在过去十年中研究工作的中心。胚胎干细胞(ES)或诱导多能干细胞(iPS)细胞是重要的细胞来源朝着这一目标。连续阶段的生殖心脏分化在ESCs多能分化在适当的条件下建立了体外(1]。一般ES-derived细胞分离为终末分化心肌细胞(2- - - - - -4]或心血管祖人群离开体内移植后进一步区分(5,6]。这种孤立的心原性的祖细胞的治疗潜力,即便是有限的,已经在许多研究报道7- - - - - -9]。尽管各种协议的出现,用于心肌细胞生成,细胞心脏再生方法的价值尚不清楚。具体来说,导航属性、生存、增殖和成熟心肌细胞移植环境仍有待解决的挑战(10- - - - - -12]。

有限的隔离和扩张的新型多功能心血管祖细胞分化潜能可以朝着这个目标提出一个有价值的工具。ESCs会分化系统利用发展阶段选择细胞群的具体活动的推动者。VE-cadherin粘附分子,有利于形成粘合连接处并且内皮细胞之间。VE-cadherin启动子(Pvec)以前认为内皮特定的体内和体外13- - - - - -16]。然而,它的瞬时激活造血祖人群中发现称为“hemogenic内皮”[17- - - - - -19]。在我们的实验室,我们以前分析Pvec激活在ESCs分化和发现这样的激活Isl1早期的一个子集⁺心血管祖细胞(Maltabe et al .,提交)。Isl1属于一群lineage-specific转录因子表达在早期cardiogenesis [20.]。特别是Isl1⁺细胞都被定性为多功能心血管祖细胞,因为它们进一步分化心肌细胞、内皮细胞、心内膜和平滑肌细胞(21]。

在目前的研究中,我们旨在生成和孤立ESCs心血管祖人口来自一本小说,基于遗传选择策略。朝着这一目标我们使用Pvec活动开抗生素耐药性的ESCs分化过程中基因表达和我们提供的证据表明,心血管祖的人口可以通过这个策略被孤立。我们进一步证明这个群体具有自我更新能力和分化心脏和血管内皮细胞在特定的细胞培养条件下。此外,这些细胞存活和分化后直接在成年大鼠的左心室心肌内的移植。

2。材料和方法

2.1。质粒

2.1.1。Pvec

一个~ 2.5 kb片段包含鼠标VE-cadherin启动子元素和第一nontranslated外显子被使用引物PCR派生AGCAGAAACAAGGTCCTCTGGAAGAG(意义)和TCACTTACCTTGTCCGTGAGC(反义)从一只老鼠BAC图书馆作为模板,进一步subcloned Topo-XL向量(表达载体)。

2.1.2。Ppvec-puro

以下subcloning步骤进行:构造一个,pPyCAGIP的嵌合基因和填充物片段(一种游离向量,礼物A . Smith教授威康信托中心的干细胞研究,剑桥大学,英国),插入Topo-XL向量下游的鼠标Pvec SchI / EcoRI-blunt结扎。SpeI / XhoI片段从构建一个是pPyCAGIP的结扎。最后,潮霉素抗性基因插入到心好钝/萨利·。

2.1.3。Ppvec-puro-EGFP

EGFP编码序列(从pEGFP-N)消化Xho / NotI结扎pPvec构造的相同的网站。

2.2。细胞培养

ESCs E14T胚胎干细胞()请提供的a·史密斯教授和博士。钱伯斯(英国爱丁堡MRC再生医学中心)。他们传播明胶猪皮肤(0.1%),在高葡萄糖格拉斯哥修改鹰的介质(σ)补充生活条件培养基,15%的边后卫(Biochrom), 1毫米丙酮酸钠(表达载体),2毫米谷酰胺(表达载体),0.1毫米不必要的氨基酸(表达载体),0.05毫米β巯基乙醇(σ),100 u /毫升青霉素和链霉素0.1毫克/毫升(表达载体)。

2.3。稳定的ES细胞系

5×10⁶ESCs electroporated 20μ600年g的DNAμ在200 V和960 L PBS佛罗里达大学在0.4厘米试管使用BTX-ECM600 electroporator(哈佛装置)。后24 h后14天,细胞被选中和潮霉素(150 ug /毫升到120 ug /毫升)。耐药克隆是单独孤立和传播。

2.3.1。ESCs分化

在大众文化(a)。1×10⁶ESCs被播种在100毫米在分化中DM1细菌培养皿。DM1 Iscove修改杜尔贝科的介质(IMDM),补充了15%的边后卫,2毫米谷酰胺,100 u /毫升青霉素,链霉素0.1毫克/毫升、5 ng / mL人类VEGF (ImmunoTools), 30 ng / mL人类bFGF (ImmunoTools),和5μg / mL抗坏血酸(σ)。ESCs短暂,使胰蛋白酶化和悬浮在DM1介质,和细胞培养三天37°C湿润孵化器有限公司为5%²。

(b)由“悬滴。”ESCs被播种在每20 500个细胞μL DM1下降,在悬滴培养了2天。EBs形成收集和镀在细菌培养皿中进一步分化。

2.3.2。嘌呤霉素选择在分化

EBs在大众文化形成了三天培养基DM1支持内皮和心脏分化。在第三天EBs被轻微分离胰蛋白酶处理和播种在纤连蛋白涂层组织文化板块。选择,嘌呤霉素(0.75 ug /毫升1.5 ug /毫升)增加了4.5天,第八天。

2.3.3。分化CEDPs

CEDPs DM2使胰蛋白酶化和暂停。DM2 Iscove修改杜尔贝科的介质(IMDM),补充了15%的边后卫,2毫米谷酰胺,100 u /毫升青霉素,链霉素0.1毫克/毫升、10 ng / mL人类VEGF (ImmunoTools), 30 ng / mL人类bFGF (ImmunoTools),和5μg / mL抗坏血酸(σ)。球体在低依恋板块形成培养37°C湿润孵化器有限公司为5%²。

2.3.4。分化的CEDPs海藻酸(Pronova,奥斯陆,挪威)

CEDPs resuspended在1×10的密度⁶细胞/毫升1.1%海藻酸糊化的解决方案。这个解决方案在1 M CaCl一滴一滴地补充道₂pH7.4通过胰岛素注射器和封装的细胞被洗在0.9%氯化钠,resuspended DM2的媒介。增加CEDPs的可行性,他们与糊化海藻酸溶液混合,注射在大鼠体内的左心室。在这些条件下,海藻酸溶液与内源性钙离子交联,迅速形成水凝胶(22]。

2.3.5。体内研究人口和道德

15 Wistar鼠的体内实验(男,17 - 20周的年龄,体重280 - 320克)。动物们被安置在plexiglas-chambers两个或四个组,啮齿动物pellet-diet免费获取水和标准。住房设施约阿尼纳大学坚持国际指南和提供稳定的条件下,在温度(20 - 22°C)、湿度(60 - 70%),和亮到暗周期(12:12 h)。实验过程遵循赫尔辛基宣言的指导原则,对道德行为的动物研究,符合欧洲立法(欧盟指令保护动物用于科学目的609/1986,2010/63 /欧盟修订)。研究协议批准的农业经济和兽药、约阿尼纳,伊庇鲁斯的县,6003年批准文号,19/04/2013。

2.4。注入协议

通过面具与isoflurane-inhalation麻醉诱导后,老鼠插管使用啮齿动物和机械通风设备(型号7025,尤格Basile);麻醉维持了氧气和2.5%七氟烷的混合物。

通过左侧开胸,心脏被曝光,和心包切除;植入是由心肌内的注射,如前面描述的(23]。总之,心脏是形象化和轻微的牵引应用通过一个6 - 0缝合,通过顶点,从而促进操作和注射期间提供支持。总共0.2毫升的生理盐水()或alginate-hydrogel CEDPs ()是由六个前外侧的LV壁心肌内的注射,在之前的实验(24]偶尔出血停止后轻压在本地应用。三层和气胸的切口关闭疏散。镇痛,单一的腹腔内注射镇痛的(丁丙诺啡,0.05毫克/公斤)术后管理。

2.5。免疫抑制方案

为了防止同种异体移植物排斥反应,像前面那样低剂量免疫抑制是管理(25,26]。具体地说,环孢霉素(10毫克/公斤)被填喂法的口服药物,从这一天开始注入之前,直到实验结束。

心脏标本收集三个(),7 (),14天(植入后)。这些动物麻醉(如上所述),和之前的开胸的网站重新开放。主动脉、肺动脉、上级和下腔静脉是夹紧;心脏被切除,很快就沉浸在生理盐水。随后,心被免疫细胞化学或RNA隔离处理。

2.6。免疫细胞化学

EBs和球体被允许附加在糊化玻璃盖玻片2天前染色。细胞被固定在4%甲醛10分钟rt,随后,他们孵化3% BSA含有0.2% Triton-X100 30分钟和主要抗体标记是在4°C O / N,其次是孵化的二次抗体1 h。显微镜,老鼠的心脏被固定在4%甲醛2 h,然后30%蔗糖一夜,然后嵌入在10月,切片和染色使用标准协议。总之,冰冻组织切片与冰冷的甲醇100% 10分钟permeabilized−20°C和在PBS冲洗5分钟。抗体标记进行如上所述,除了主要抗体稀释0.2%鱼皮明胶和标签进行1 h在室温下。

2.6.1。抗体

免疫细胞化学,以下用抗血清:鼠单克隆抗体对VE-cadherin (11 d4.1, BD生物科学),PECAM-1 (MEC 13.3, Santa Cruz)和钙粘蛋白(DECMA-1, Santa Cruz),鼠单克隆抗体对心肌肌钙蛋白T (CT3,爱荷华州的杂种细胞银行),Isl1 (39.4 d5,爱荷华州的杂种细胞银行),Oct3/4 (C-10, Santa Cruz), SMA (Neomarkers) N-cadherin(克隆3 b9,表达载体),MyHC (MF20,爱荷华州的杂种细胞银行),和a-actinin(克隆bm - 75.2σ),山羊多克隆对GATA4(圣克鲁斯C-20)和Isl1 (gt15051 - 100,阿克利抗体),兔单克隆抗体对MEF2c (D80C1)和VEGF受体2 (Flk1) (55 b11)从细胞信号,和兔多克隆EGFP(请提供博士Charalambia Boleti,巴斯德研究所,雅典),Desmoplakin 1/2 [27],DSC2 (DSC2 RDI研究诊断,Inc .)。

2.7。共焦显微镜

共焦图像在徕卡共焦显微镜(LCS SP5)使用LAS AF Lite软件。照片是与斐济进一步操纵图像(NIH)和/或Adobe Photoshop (Adobe)软件。

2.8。RNA隔离、rt - pcr和定量rt - pcr

RNA被隔离使用试剂盒试剂根据制造商的协议(表达载体)。合成cDNA 1μ克净化RNA用于20μL反应,使用PrimeScript™RT试剂盒与gDNA橡皮擦(豆类)。实时定量PCR分析与十二分之一或六分之一的cDNA反应模板,使用KAPA SYBR®快速qPCR装备大师混合(κ)Bio-Rad CFX96 45周期。在一式三份样品进行了分析。所有的值与GAPDH和规范化β肌动蛋白的表达水平,翻译相关值。分析是由qBase +软件(Biogazelle)。引物序列见表S1在网上补充材料补充http://dx.doi.org/10.1155/2016/8305624。

2.9。流式细胞仪分析

细胞在选择来自区分文化使胰蛋白酶化使用0.25% trypsin-EDTA和EGFP表达分析了流式细胞仪(Partec CyFlow空间)。获得的数据进行了分析与FCS表达4软件(流研究版)。

2.10。细胞生长分析

1×10⁶Pvec⁺细胞被播种在30 mm细胞培养板。到达大约80%融合,细胞治疗0.05% trypsin-EDTA解决方案(Gibco)分离和计算受移植者在新的细胞培养板培养,直到下一个通道。这个过程被重复十通道。倍增时间是计算使用倍增时间计算(28]。

2.11。统计分析

GraphPad棱镜5执行统计分析软件。数据代表均值±SD从三个独立的实验。统计学意义上的差异是由单向方差分析其次是图基的多重比较检验。概率值被认为是重要的。计算在心脏组织细胞总数(图7 (e))计算机代数系统枫18和包的曲线拟合。

3所示。结果

3.1。隔离与心脏和血管内皮细胞的表型在ES细胞分化的选择基于Pvec活动

为了隔离ES-derived Pvec⁺我们转基因E14T ESCs细胞。E14T与游离细胞electroporated质粒含有嘌呤霉素抗性基因在Pvec和潮霉素抗性胸苷激酶启动子(图下1(一))。潮霉素耐药克隆A11和A12 (Pvec-ESCs)孤立和扩展。在类似的实验中,EGFP-expressing克隆八国集团和G11 Pvec也孤立(Pvec-EGFP ESCs)(图1(一))。克隆是多能性标记阳性Oct4、Sox2和钙粘蛋白及其分化性能检查(补充图S1)。组织Pvec活动评估在体外分化的八国集团和G11 EGFP的表达(图1 (b))。EBs形成在d8 double-stained VE-cadherin和EGFP double-positive细胞的百分比计算。超过90%的EGFP⁺细胞也VE-cadherin⁺,这表明高启动子特异性(图1 (c))。VE-cadherin主要被发现在等离子体膜,以及在细胞质中,形成新生在这个粘合连接处并且早期发展阶段(图1 (b))。

接下来,我们分析了现存产品Pvec和Pvec-EGFP ESCs的分化中嘌呤霉素选择DM1中(图2(一个))(见部分2)。Pvec Pvec-EGFP-ESCs耐药细胞被观察到d10,相比wtESCs-derived细胞(图中就被淘汰了2 (b))。流式细胞仪分析EGFP⁺细胞表明他们在d4.5细胞总数的26%增加到40%,d6在d7和d8和60%(数据2 (c)和2 (d))。

存活细胞进一步分析心脏和血管内皮特定免疫荧光标记表达式的d7。他们表达内皮VE-cadherin和PECAM-1(数字2 (e)和2 (h)),以及心脏发育stage-specific标记Isl1 GATA4和Nkx2.5(数字2 (f),2 (g),2 (h))。有趣的是,VE-cadherin-mediated妥协在粘合连接处并且嘌呤霉素的存在。没有检测到内胚层的或neuroectodermal特定标记rt - pcr在d3, d7,和d10(图2 (h))。作为控制,我们进行分化和选择实验克隆A11在相同条件下的潮霉素代替嘌呤霉素。自从游离向量Pvec含有潮霉素抗性在无处不在的胸苷激酶(TK)启动子(图1(一)),A11细胞存活和分化有效neuroectodermal,内胚层、中胚层的血统(补充图S2)。

3.2。激活Wnt /β选择Pvec连环蛋白通路引发传播和自我更新⁺细胞

我们发现VE-cadherin⁺和Isl1⁺存活细胞就无法进一步发展在DM1 d14后介质。为了扩大Isl1⁺细胞,诱导Wnt /β连环蛋白,信号通路支持Isl1自我更新⁺心肌细胞(图3(一个))。当某人- 216763 (29日GSK3抑制剂),添加在5 - 8天,Isl1的显著扩张⁺观察细胞在d12(图3 (b))。

Isl1的百分比⁺细胞通过细胞计数计算被发现超过60%的总细胞(图3 (c))。这些属性都保持了至少8通道30天,多个冻结和解冻周期。之后他们的增长大幅下降。Pvec的倍增时间⁺某人的存在- 216763细胞生长曲线后计算一代第一天至28天~ 4.5天(图3 (d))。

自我更新的细胞检测心肌细胞分化stage-specific标记表达式。我们分析了心脏祖标记GATA4和Mef2c表达式,发现Mef2c, AHF的标记(前心字段),coexpressed Isl1和GATA4在大多数细胞(数字3 (e)- - - - - -3 (g))。在某人- 216763诱导传播也很明显,内皮细胞存活,有效地扩散,并形成广泛VE-cadherin-mediated和粘合连接处并且PECAM-1连接,通过免疫荧光染色(图所示3 (h)- - - - - -3 (j))。Isl1、VE-cadherin GATA4 Pvec之间表达水平进行量化和比较⁺细胞在某人- 216763和Pvec扩大⁺细胞经过qPCR选择。SB-treated文化中发现Isl1调节2.7 - 4.7倍,GATA4是调节1.5 - 3.6倍,VE-cadherin调节1.8——两个生物独立选择/三倍扩张实验(图4(一))。

进一步抑制心脏分化是他们对MLC2v不利,MLC2a,和cTnT,尽管他们coexpressed肌间线蛋白和Isl1(数字4 (b),4 (c),4 (d))。这是符合Wnt /的角色β连环蛋白信号通路诱导增殖和抑制Isl1⁺细胞分化。

内皮细胞也没有进一步区分,和vWF CD39成熟的内皮标记并不表示(补充图S3)。表达式Nfatc1和Nrg1发现,有趣的是,这意味着心内膜细胞(图的存在4 (d))。在控制实验中多能性标记Nanog和Sox2在这些细胞中不表达,通过rt - pcr分析(图所示4 (d))。

因此,在上述协议传播心脏/内皮dual-progenitor人口(称为CEDPs)。

3.3。心脏和血管内皮细胞体外CEDPs分化

我们检查了下CEDPs分化的潜力进一步对心脏和血管内皮细胞类型。为此,CEDPs在分化培养基培养存在与否的DM2 sb - 216763在低附着力盘子。sb - 216763抑制分化,由小型球体形成明显没有跳动的活动。相比之下,在缺乏sb - 216763大约3-4-fold大球体与殴打表型形成(图10天后5(一个)和补充图S4)。球体包含cTnT的广泛领域⁺或MyHC⁺coexpressing细胞粘附分子Desmoplakin Desmocollin 2,表明心肌细胞之间插入磁盘结构形成(数字5 (c),5 (d),5 (e)))。MLC2a和MLC2v分化心肌细胞的标记也被发现在这种文化通过rt - pcr分析,对比CEDPs(数字5 (f)和4 (d))。诱导内皮标记vWF CD39和VE-cadherin⁺鹅卵石结构形成分化期间观察CEDPs表明成熟内皮细胞(数字5 (g)- - - - - -5(我))。有趣的是,细胞表达祖标记Isl1 Mef2c可以检测到在心脏和血管内皮细胞,分别在分化(数字5 (j)和5 (k))。此外,SMA⁺细胞也可以观察(图5(左))。

心脏和血管内皮细胞在CEDPs分化在12天被计数cTnT量化⁺和VE-cadherin⁺细胞在三个独立的实验(10417细胞)。我们发现,47%的细胞被cTnT⁺,28%是VE-cadherin⁺,其余nonendothelial非心脏细胞(大约25%)平滑肌肌动蛋白和波形蛋白阳性(图6(一)和补充图S5),可能代表一个细胞群与心脏间质有关。cTnT、VE-cadherin Isl1、GATA4 Nkx2.5, Flk1表达水平进行量化和比较在CEDPs和CEDP-derived qPCR分化细胞在12天。我们观察到的upregulation cTnT、Nkx2.5 VE-cadherin, Flk1 Isl1和GATA4(图的差别,对这些6 (b))。这些结果表明,CEDPs可以进一步分化为心肌细胞。

控制实验对内胚层分化neuroectoderm并没有观察到球形,自从lineage-specific标记(FoxA2,法新社,Pdx1内胚层和Tub-b3巢蛋白,和Pax6 neuroectoderm)没有检测到rt - pcr分析(补充图S6)。

CEDPs微分属性意味着它们可能代表一个祖人口对心脏再生有用。因此,我们检查了他们的分化效率在藻酸盐,水凝胶生物材料常用的支架移植实验(30.]。CEDPs被封装在DM2培养基培养海藻酸和(补充图S7)以上。球体形成和保持10天在水凝胶生物可降解材料开始瓦解。我们观察到CEDPs分化在藻酸盐以类似的方式与液体DM2媒体相比,明显的心脏跳动,观察经过12天。

3.4。移植后的存活和分化CEDPs

的存活和分化CEDPs进行体内移植后免疫抑制大鼠的左心室(LV)。CEDPs-derived和内源性心肌细胞之间的区别是基于心脏祖标记Isl1目前只在CEDPs及其后代,但不是在成人心脏的LV。为此,LV地区从CEDPs或盐水接受者老鼠解剖后,检查3、7、14天,采用rt - pcr分析CEDPs的存活和分化。疣状Isl1的冻结部分展示了在所有情况下⁺细胞群出现专门在saline-injected CEDPs——但不是动物。rt - pcr分析还表明,Isl1⁺表达式不能发现在这颗心部分(图7(一))。多能性的表达标记Oct4 Nanog并没有检测到移植动物检查(补充图S8)。

分化CEDPs MLC2v进行rt - pcr,分化标记不表达CEDPs使用一套mouse-specific底漆(图4(一)和补充图S9)。

CEDP-derived细胞检测到3日,7日,移植后第14天(数字7(一)- - - - - -7 (d))。体内分化诱导移植后3天见了CEDPs MLC2v表情第三,移植后7日,第14天(图7(一))。

Isl1的数量⁺移植后细胞存活7天在解剖lv量化。为了这个目的,一个4毫米区域被切割(400部分,10μ米每)。六种不同的飞机选择(在1.4毫米,1.8毫米,2.4毫米,2.8毫米,3.4毫米和3.7毫米)和10个部分每架飞机都沾染了anti-Isl1左右。Isl1⁺细胞被发现在1.4和3.7毫米(280部分,大约2.8毫米)和统计。基于Isl1⁺细胞依靠两个不连续的部分/飞机(补充表S2)我们产生一个分段插值样条函数和情节这个表达式的对象。然后我们评估细胞的总数通过积分函数的区间,发现Isl1⁺细胞大约31日×10⁵(图7 (e))。考虑到Isl1⁺细胞百分比是CEDPs ~ 60%(图3 (c));幸存的Isl1⁺细胞最初代表21.8%的注射。

4所示。讨论

遗传策略基于组织的活动发起人建立隔离ES-derived细胞类型。心脏特定的启动子αmhc和MLC2v被用来分离高纯度心肌细胞在分化的转基因多能ESCs [31日- - - - - -36]。此外,发展的活动像Flk1 stage-specific推动者,Isl1, Nkx2.5用于孤立心脏前体细胞胚胎或iPS细胞(21,37- - - - - -43]。

4.1。主要发现

我们提供的证据表明,小说的人口可以孤立Pvec活动ESCs分化。内皮的特定活动(−2486 + 24)鼠标VE-cadherin启动子片段已经证明在转基因动物和ESCs分化(13]。进一步利用内皮血统追踪,内皮特定淘汰赛突变小鼠一代,和隔离ES-derived内皮细胞(14,16]。然而,瞬时激活Pvec hemogenic内皮还发现,人口分化内皮和明确的造血祖细胞谱系(19]。这表明准确及时的评估Pvec活动选择实验是至关重要的。

我们之前已经详细研究ESCs的Pvec活动模式在分化。也许令人惊讶的是,我们发现这是暂时性的激活在Isl1的子集⁺天4和5之间的多功能心血管祖细胞;基于这一发现,我们选定的细胞存活在这个时间窗口。这种基于基因的方法导致Pvec隔离⁺与内皮细胞群,心脏原始表型但不是内胚层的或neuroectodermal表型,说明具体的选择。在我们的组织培养体系,利用激活Wnt /βPvec连环蛋白信号导致传播⁺选定的祖细胞。基因的方法利用Pvec隔离内皮细胞。在这些情况下Pvec活动结合流式细胞仪选择的第八天ES细胞分化主要使用导致内皮细胞的数量(14,44]。孤立CEDPs另一方面是一个复杂的细胞群,有能力自我更新至少30天,由内皮、心肌、心内膜和间充质细胞类型。因此,它显然代表一个不同的,小说的细胞群。最显著的区别我们的研究和其他导致心脏祖细胞(年度"特别关注国")隔离,我们选择一个策略允许同时隔离和内皮和心脏祖细胞的扩张。为了这个目的,我们的策略是基于两个步骤:最初Pvec⁺细胞的选择和随后Isl1⁺细胞扩张。Wnt /β连环蛋白诱导Isl1的扩张⁺细胞是与之前的报道相一致45]。然而,意想不到的事情自我更新由Wnt /β连环蛋白通路激活内皮祖细胞的观察,发现需要进一步调查。因此,两个独立的种群与自我更新能力是孤立的,与之前的研究相比,在内皮细胞衍生后年度"特别关注国"差异化(21,41]。内皮祖细胞可以改善心脏祖细胞的分化和生存能力属性以协同的方式。

4.2。Wnt信号

Wnt信号是关键的祖细胞增殖的各种组织,如骨骼肌(46)和神经元(47,48],造血[49),和心脏50,51)组织。它的作用在心脏分化详细研究及其激活被发现正常心脏的必要条件规范,祖扩张,心肌的增长。具体来说,激活Wnt /β连环蛋白在Isl1的出现⁺细胞克隆扩张了这些心血管祖细胞(45,50]。在稍后的阶段,当Wnt /β连环蛋白表达下调,Isl1⁺心脏和内皮细胞(细胞分化21]。

我们的报告,除了心脏,内皮细胞扩散在Pvec我们的文化条件下实现⁺选择细胞。这一发现是非常重要的,考虑到之前的研究的不确定的结果在Wnt信号对内皮祖细胞的作用[52]。GSK3是否积极调节内皮祖细胞的抑制Wnt激活的结果在Pvec的子集⁺细胞,或者他们是否来自Isl1⁺心血管祖细胞仍有待观察。

4.3。自我更新的细胞数量

隔离的祖细胞与心血管的潜力,能够自我更新,尤其有趣,因为他们分化是局限于心脏,血管内皮和平滑肌细胞类型。这些细胞可以为心脏移植后再生提供一个源(39,53,54]。在目前的研究中,我们使用了VE-cadherin子活动模式隔离一个小说,dual-progenitor细胞群。这些细胞可以自我更新,在Wnt /β连环蛋白通路刺激和分化进一步内皮,心肌和平滑肌细胞。双分化为内皮细胞和心肌细胞可以被视为一种优势,因为它导致血管移植的形成,增强移植后生存潜力(55]。

4.4。体内细胞存活

老鼠的生存来源鼠移植细胞受体动物是基于Isl1表达式作为一个积极的标志。的Isl1⁺在哺乳动物胚胎细胞人口下降,可以发现主要在成人心脏窦房结而不是左心室(56]。温伯格Isl1等人报道⁺在成人心脏的窦房结细胞存在,一群来自胚胎Isl1⁺细胞。在我们的实验中,我们描述了Isl1的隔离⁺人口出现在心血管发育和分化形成成人心脏的主要部分(左心室、心房的一部分,和流出道内皮)。未来的研究将显示其特定的心脏亚种群分化潜力。

在我们的研究中,我们在左心室移植CEDPs,所有采用和PCR分析孤立左心室心脏的一部分。因此,我们相信Isl1⁺细胞代表一个真正的CEDPs-derived人口。基于这一特性,我们表明,移植细胞存活和分化在成年人的心至少14天,突显出其潜在的细胞治疗心肌梗塞。

小说的概念本手稿中描述心脏和血管内皮的人口可能会潜在有价值的领域的心脏再生跟着人类系统时提供必要的修改。临床开发战略需要建立文化条件,人类的ESCs定义(或万能)对心脏分化,无血清培养基。的VE-cadherin⁺/ Isl1⁺细胞群可以进一步孤立和使用基于早期VE-cadherin表达式之间的人类通过流式细胞仪分选(4和557]。

5。结论

我们孤立和小说心血管祖细胞的人口特征,具有自我更新能力和进一步区分内皮,心脏,平滑肌细胞在体外和体内。这些细胞可用于细胞治疗心肌梗死和药物筛选。需要进一步的表征,关注心肌结构,如连接系统,肌纤维膜复杂,缝隙连接。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢安娜斯塔西亚Politou博士和Charalambia Boleti试剂,Eleutheria Karanika初步数据,c . Konaxis进行插值分析,博士(Katerina Soupsana qPCR数据分析,和安娜Melidoni博士,Spyros Georgatos博士和博士Nikos Tsigkas有益的讨论。CT3和39.4 d5单克隆抗体由林,j . J.-C。Jessell, T,分别从发展研究杂种细胞获得银行,由美国国立卫生研究院和维护美国儿童健康与人类发展研究所的生物学系,爱荷华大学爱荷华州的城市,是52242人。这项工作得到了欧洲Union-European社会基金(养)和希腊国家来源,框架的项目我和Synergasia毕达哥拉斯。

补充材料

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