文摘

本研究旨在探索压力刺激的效果fibrochondrocytes的增殖和分化entheses介导通过印度刺猬(本次)/甲状旁腺与荷尔蒙相关的蛋白质(PTHrP)信号通路。微分压力刺激fibrochondrocytes entheses实施。基因表达和蛋白质水平的信号分子,包括胶原蛋白I型(I)上校,上校,上校X,本次事件,PTHrP fibrochondrocytes细胞质中被检测到。本次事件信号阻断组成立使用本次事件信号pathway-specific阻滞剂环巴胺。使用PTHrP试剂PTHrP增强集团成立。本次事件/ PTHrP双重干预组,对照组,包括研究的监管机制是本次事件/ PTHrP fibrochondrocytes信号通路。在低循环应力拉伸(CTS) PTHrP,我上校,上校II基因表达和蛋白质合成增加。根据高CTS,本次事件和坳X基因表达和蛋白质合成增加。阻止本次事件信号与环巴胺导致减少PTHrP基因表达和蛋白质合成,提高坳X基因表达和蛋白质合成。本次事件和PTHrP coregulate fibrochondrocyte entheses通过负反馈调节增殖和分化。 Fibrochondrocyte is affected by the CTS. This phenomenon is regulated by stress stimulation through the Ihh/PTHrP signaling pathway.

1。介绍

Entheses破坏和退化是常见的运动系统疾病,目前没有理想的治疗(1]。entheses的组织结构有四个层次,其中纤维软骨层entheses开发中扮演着重要的角色和退化2]。entheses的发展与fibrochondrocytes的增殖和分化。

压力刺激entheses发展和退化的一个主要影响因素(3- - - - - -7]。压力刺激影响软骨细胞的细胞外基质合成和分解的平衡,因此改变关节软骨细胞的新陈代谢。多种细胞因子参与entheses软骨细胞的增殖和分化。其中,与压力相关的蛋白质甲状旁腺与荷尔蒙相关的蛋白质(PTHrP)众所周知,促进软骨细胞增殖和软骨层发展(8- - - - - -10]。印度刺猬(本次)是一个上游PTHrP分子(11]。本次事件是一个重要的调节分子在软骨细胞增殖和分化。PTHrP是不可或缺的限制调节因子对软骨细胞增殖和分化和控制主要是由上游分泌蛋白质本次事件。本次事件和PTHrP信号一起维持软骨细胞的动态平衡发展和新陈代谢12,13]。然而,压力是如何刺激协调本次事件/ PTHrP信号通路调节软骨细胞增殖和分化在entheses在很大程度上是未知的。

因此,值得研究应力刺激如何协调本次事件/ PTHrP信号通路在entheses调节软骨细胞增殖和分化,具有广泛的临床应用价值。

2。材料和方法

2.1。试剂

2.1.1。环巴胺(最终浓度= 10µ米)

环巴胺水合物从σ采购(C4116-1MG很多# 021 m4704v P代码:11211)。

环巴胺在1000转离心5分钟,和200年µL(二甲亚砜加入溶解完全环巴胺。然后,240毫升的杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)与10%胎牛血清(的边后卫)和1%的抗生素添加到试剂瓶冲洗5次。

2.1.2。PTHrP(最终浓度= 10海里)

人类PTHrP从Peprotech购买(猫# 100 - 09年50µL122 g,很多# 1002267)。PTHrP离心机在1000 rpm为5分钟。然后,5毫升10%的边后卫和1%的DMEM抗生素添加洗五次试剂瓶和存储在10毫升离心管。PTHrP(1毫升)被添加到99毫升的DMEM(10%的边后卫和1%的抗生素)。其余试剂在离心管存储8°C。

2.2。抗体

PTHrP。1:1000稀释。从兔子主要抗体,二级抗体山羊anti-rabbit(1: 1000稀释)。

本次事件。1:1000稀释。从兔子主要抗体,二级抗体山羊anti-rabbit(1: 1000稀释)。

我胶原蛋白1 (Col)。1:500稀释。胶原蛋白1我是山羊,二级抗体兔抗体(1:1000稀释)。

胶原蛋白II。1:1000稀释。胶原蛋白II是鼠标,和二次抗体山羊anti-mouse(1: 1000稀释)。

胶原蛋白X。(1:1000稀释)。胶原蛋白X是老鼠,二级抗体山羊anti-mouse(1: 1000稀释)。

肌动蛋白。1:1000稀释。肌动蛋白是老鼠,二级抗体是山羊anti-mouse(1: 1000稀释)。

所有二次抗体来自中山有限公司(中国,北京)。

2.3。动物

我们使用两个贵州小型猪(第三军医大学实验动物中心,重庆,中国),重达18公斤,年龄5个月。根据美国国立卫生研究院动物治疗指导实验室动物保健和使用的2011年(NIH)。批准的实验第三军医大学动物实验委员会。

2.4。细胞培养

收集fibrochondrocytes两步酶消化(14]。我们分离,减少钙化纤维软骨的层和纤维软骨组织切成小块然后放在一个消化腔。孵化后0.2%胰蛋白酶为18 h 2 h和0.2%胶原酶(GIBCO,英杰公司Inc .)、卡尔斯巴德、钙、美国),纤维软骨的细胞被离心机,小球resuspended杜尔贝科的修改鹰血清(DMEM) (GIBCO,英杰公司Inc .)、卡尔斯巴德、钙、美国)补充10%胎牛血清(的边后卫)(GIBCO,英杰公司Inc .)、卡尔斯巴德、钙、美国)和1%的青霉素和链霉素(GIBCO,英杰公司Inc .)、卡尔斯巴德、钙、美国)。细胞被播种到T-25发泄瓶,增长到80 - 90%融合,并在第三段。Fibrochondrocytes在第三段特征使用hematoxylin-eosin(他)染色,阿尔新蓝染色(粘多糖的象征),类型I和II型胶原免疫组织化学。细胞被识别后,文化通过第二代和镀2×10的密度⁵在Bioflex six-well板涂上坳即细胞37°C恒温的孵化器孵化有限公司为5%₂。第二天媒体改变了。细胞培养,直到six-well板罩着85% - -90%的细胞。

2.5。实验参数

对照组。控制、DMEM + 10%的边后卫+ 1% double-antibiotics 10毫升。

本次事件信号阻塞组。10µ米环巴胺double-antibiotics DMEM + 10%的边后卫+ 1%,10毫升。

PTHrP信号增强。10 nM PTHrP double-antibiotics DMEM + 10%的边后卫+ 1%,10毫升。

Double-Intervention组。10µ环巴胺和10 nM PTHrP double-antibiotics DMEM + 10%的边后卫+ 1%,10毫升。

2.6。检测指标

rt - pcr的目标。本次事件,PTHrP坳I, II上校,上校X。

免疫印迹的目标。本次事件,PTHrP坳I, II上校,上校X。

2.7。程序

2.7.1。本次事件信号屏蔽环巴胺

DMEM 10µ米环巴胺添加成四个200毫升玻璃瓶(10毫升)和37°C恒温的孵化器孵化有限公司为5%₂、3、6、12或48 h。

2.7.2。PTHrP干预

DMEM 10 nM PTHrP添加成四个200毫升玻璃瓶(10毫升)和37°C恒温的孵化器孵化有限公司为5%₂、3、6、12或48 h。

2.7.3。本次事件/ PTHrP Double-Intervention组

DMEM 10µ米环巴胺+ 10 nM PTHrP添加成四个200毫升玻璃瓶(10毫升)和37°C恒温的孵化器孵化有限公司为5%₂、3、6、12或48 h。

第2.7.4。对照组

DMEM和10%的边后卫+ 1%抗生素添加到四个200毫升玻璃瓶(10毫升)和37°C孵化器孵化有限公司为5%₂、3、6、12或48 h。

2.7.5。停止反应

文化是停在每个时间点的培养基和洗两次磷酸盐(PBS)。收集细胞rt - pcr和免疫印迹。本次事件检测和PTHrP使用rt - pcr基因表达和蛋白质合成用免疫印迹。图像Pro-Plus用于定量分析蛋白质印迹的结果。

2.7.6。Flexecell张力+系统,fx - 4000

这个实验使用Flexecell张力+系统(fx - 4000, Flexcellint) fx - 4000提供张力在细胞培养。实验细胞培养在Bioflex 6孔的盘子,盘子的底部是有机硅弹性膜。计算机控制的真空泵使硅胶膜产生拉伸变形底部的菜,这样的底部附着生长的细胞间接接受的张力。体内细胞受到张力并接受特定的生物化学变化的响应和适应变形。

2.8。统计数据

数据分析使用SPSS 16.0(美国SPSS, IL)。每个测试相同的条件下重复了三次获得数据平均值±标准错误的意思。所有参数的统计分析采用方差分析和图基执行测试。一个被认为具有统计显著性值小于0.05。

3所示。结果

本次事件信号抑制后的上游PTHrP通过添加环巴胺,PTHrP基因表达显著降低随着时间()(图2(一个))。PTHrP表达的相对价值干预组和对照组分别为0.75±0.08,0.54±0.10,0.32±0.12,0.12±0.06后3、6、12和24小时(表3)。与此同时,我和上校坳二世表达随时间下降()(图1(一))。坳的相对价值观我和坳二世表达减少从0.83±0.17,0.95±0.15,0.10±0.04,0.18±0.10,分别从3到24 h(信号抑制。坳X表达,然而,随着时间的增加()(图1(一))。坳X的相对基因表达增加从1.39±0.21,3.61±0.29(3到24 h (i.h.h(抑制)(表1)。上校,上校II,坳X蛋白质合成不同干预条件下是显示在表中2。本次事件和PTHrP蛋白质合成不同干预条件下是显示在表中4。免疫印迹的上校,上校,上校X蛋白表达不同干预条件下是显示在补充图(在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/8235172)。和rt - pcr基因表达不同干预条件下是显示在补充数据。

添加PTHrP之后,PTHrP基因表达显著降低随着时间()(图2 (b))。相对基因表达水平在3、6、12、24 h分别为0.67±0.06,0.42±0.04,0.28±0.05,0.11±0.07,分别(表3)。我和上校上校II基因表达和蛋白质合成显著增加()(图1 (b))。坳我和坳II基因表达水平增加从1.52±0.22,1.45±0.22 3 h 3.51±0.25, 4.18±0.26在24 h。然而,坳X表达随时间而下降()(图1 (b)从0.90±0.15),3 h在24小时(表0.06±0.041)。

本次事件/ PTHrP double-intervention组,我和上校上校II基因表达和蛋白质合成增加()(图1 (b)从2.35±0.29,2.50±0.32)3 h 4.45±0.28, 5.66±0.36在24 h(表1)。

在CTS实验中,使用4%、8%、12%应变加载1赫兹,类型I, II,和X胶原蛋白mRNA表达和蛋白分泌增加而增加曝光时间()(图4)。因此,结果表明,适当的机械刺激促进肌腱发展类型I和II型胶原蛋白的分泌,而过度的机械刺激增加肌腱组织的退化到矿化组织。

在CTS实验中,使用4%、8%应变加载在1赫兹,PTHrP和本次mRNA表达和蛋白质分泌增加应变加载(数据的增加持续时间3(一个),3 (b),3 (d),3 (e))。但在12%应变加载在1赫兹,PTHrP和本次mRNA表达和蛋白质分泌减少与增加应变加载的时间。这些结果表明,机械刺激PTHrP分泌的影响。

4所示。讨论

软骨细胞增殖和分化是由一系列的控制生长因子和内分泌激素,其中本次事件/ PTHrP信号通路发挥最重要的监管作用[15- - - - - -17]。在软骨成骨、PTHrP的主要作用是促进软骨细胞增殖。与此同时,PTHrP抑制软骨细胞肥大,抑制软骨细胞分化和成熟。本次事件/ PTHrP信号通路是一项重要而复杂的监管控制软骨发展途径。

已经证明,PTHrP刺激软骨细胞增殖抑制软骨细胞成熟,因此延长软骨骨生成,并帮助在复杂的骨架形状和结构的形成。软骨细胞增殖和分化更快速PTHrP比野生型小鼠基因敲除小鼠。同时,终端软骨细胞的分化速度,而软骨生长板的吸积区显著缩短(10]。相反,过度的PTHrP或连续甲状旁腺素1受体的激活导致软骨细胞分化的抑制和肥大。PTHrP会使骨形成蛋白(BMP)通过RunX2信号,抑制成骨细胞分化[18]。此外,坳X是软骨细胞的分化和成熟的一个标志。PTHrP选择性地抑制坳X基因表达和蛋白质合成,从而抑制软骨细胞的分化和成熟19,20.]。

本次事件是最重要的细胞因子调节软骨细胞增殖和分化,扮演一个重要角色在软骨骨(21,22]。本次事件被发现的主要上游分子PTHrP,使用本次事件^−−/老鼠。在缺乏刺猬蛋白,本次抑制跨膜蛋白的活动波动性(Smo)。本次综合水平较低,肥厚性生长板软骨细胞的扩大,软骨细胞增殖减少,导致矮短肢畸形。在本次事件^−−/模型中,受损的软骨细胞增殖和分化,或者受损的成骨细胞形成和矿化骨结构,一被发现,表明本次参与调节软骨骨(15,16]。此外,多个骨缺损疾病是与本次基因突变有关。

据报道,当PTHrP补充道,PTHrP和本次基因表达水平显著降低。因此,过度PTHrP抑制本次事件表达和合成,导致减少PTHrP表达式。本次的研究/ PTHrP信号通路模型证明本次事件的激活信号上调PTHrP表达式。PTHrP增加的数量增殖抑制软骨细胞肥大软骨细胞。同时,本次事件和PTHrP精确调节长骨的生长通过反馈调节机制(23,24]。

本次事件/ PTHrP信号途径如下:刺猬蛋白受体结合本次补丁(Ptch)刺激一系列的复杂的规定。跨膜蛋白(Smo)抵抗被激活,这直接导致目标基因的转录调控本次受体(25),导致增加PTHrP合成在软骨细胞、软骨细胞和高架PTHrP水平扩散前肥厚性软骨细胞区域,促进软骨细胞增殖,抑制软骨细胞分化。Van Donkelaar和Huiskes [9]证明PTHrP-related因素是软骨细胞肥大的主要调控分子,和Ihh-related因素主要为软骨细胞增殖调控分子。本次事件和PTHrP软骨细胞增殖和分化过程中扮演不同的角色。本次调节软骨细胞增殖和分化在休息阶段通过诱导其下游信号分子PTHrP,因此维持软骨细胞的属性和功能(26]。

本次事件信号通路抑制剂环巴胺是一个植物甾体生物碱,抑制了本次事件信号通过对抗Smo [27,28]。一些研究还表明,环巴胺可能抑制基因表达的本次pathway-related信号分子包括PTHrP,本次事件,Ptch [29日]。目标基因的差别,对这些基因的剂量依赖性。因此,环巴胺抑制本次有效信号通路。根据马克的研究等。30.),shinmoyama教授等。31日],Mak et al。32),10µ米环巴胺,half-effective抑制浓度,显然递延软骨细胞肥大和增生,这表明PTHrP可能诱发fibrochondrocyte增殖并抑制其成熟。在这个实验中,环巴胺阻塞PTHrP上游信号分子本次事件和减少PTHrP基因表达。因此,本研究证明PTHrP表达式是本次受上游信号分子。

Fibrochondrocytes专门合成我和二坳坳。这是表明我和二坳坳坳X所取代的分化对肥厚性纤维软骨细胞,软骨细胞和酸性粘多糖在mesochondrium分泌减少。与此同时,细胞活动减少。因此,X上校被认为是评估fibrochondrocyte增殖和分化的一个重要参数33]。坳X是用来评估fibrochondrocyte分化的程度。结果表明,PTHrP显然提升坳我和坳II基因表达和蛋白质合成和抑制坳X基因表达和蛋白质合成,表明PTHrP可能诱发fibrochondrocyte增殖并抑制其成熟。当上游本次事件信号通路被环巴胺,PTHrP基因表达和蛋白质合成减少。相比之下,坳X基因表达和蛋白质合成增加,表明本次促进fibrochondrocyte entheses成熟和肥大。在本次事件/ PTHrP double-intervention集团,我和上校上校II基因表达和蛋白质合成增加。因此,PTHrP可能诱发坳我和坳II基因表达和蛋白质合成,促进软骨细胞增殖。这种效应不受本次事件信号。本次诱导PTHrP表达式,PTHrP过度表达下调本次事件。PTHrP和本次协调调控软骨细胞增殖和分化在entheses通过负反馈机制。 This proved that Ihh signal regulates fibrochondrocyte differentiation in entheses through PTHrP.

总之,本次事件/ PTHrP信号通路调节entheses fibrochondrocyte发展的至关重要的监管机构。本次事件是由前肥厚性软骨细胞合成的纤维软骨层entheses。通过自分泌和旁分泌分泌,本次与跨膜结合本次fibrochondrocytes受体在G0 / G1期表层内的纤维软骨层调节和诱导fibrochondrocyte增殖和分化,增加PTHrP合成。PTHrP抑制肥厚性内的软骨细胞分化entheses的纤维软骨区。与此同时,PTHrP抑制本次事件在前肥厚性软骨细胞合成纤维软骨层。

本次事件/ PTHrP信号通路的重要调节器fibrochondrocyte entheses增殖和分化。本次事件信号控制fibrochondrocyte分化在entheses PTHrP促进fibrochondrocyte肥大和成熟,而PTHrP诱发fibrochondrocyte增殖但抑制分化和成熟。本次entheses PTHrP信号共存,形成一个信号通路交互调节fibrochondrocyte增殖和分化通过负反馈循环,确保entochondrostosis的生理过程,维持平衡纤维软骨层的生长和分化,从而保护entheses的生理功能。

我们的研究有一定的局限性。尽管fx - 4000系统可以模拟调查细胞反应机械载荷最大能力,它仍然是无法模拟的机械载荷Entheses猪跟腱在不同的运动。

5。结论

在这项研究中,本次事件和PTHrP coregulate fibrochondrocyte entheses通过负反馈调节增殖和分化。低抗拉强度的CTS (4%, 3 h 1 Hz)促进细胞增殖,和高的抗拉强度的CTS (12%, 12 h 1 Hz)导致fibrochondrocytes分化。这种现象是受压力刺激通过本次事件/ PTHrP信号通路。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(批准811000806)和中国军事医学创新主体(ZD35)。

补充材料