推导的多能细胞小鼠精原细胞似乎年龄相关的

文摘

在这里,我们旨在回答重要的生殖细胞生物学的基本问题和特别关注的年龄男性供者细胞和可能产生胚胎干细胞(ESC)像细胞。虽然相信精原干细胞(精原细胞)和真正的多功能ESC-like细胞可以从成年老鼠孤立,它仍然未知如果自发的精原细胞ESC-like细胞转换失败在某个年龄。同样,有不同的文学文化的持续时间在此期间ESC-like细胞可能会出现。我们将演示ESC-like细胞来自SSC文化的可能性,直到他们达到青春期或7周的年龄,但是我们指出不可能获得这些细胞从长大,成熟的成年老鼠。不能真正的成年细胞转移到多能性状态伴随着核心多能性基因的表达下降Oct4, Nanog, Sox2在精原细胞随着年龄的增长。同时精原细胞分化的基因通路增加。ESCs的ESC-like细胞类似于生成和表达多能性标记。在体外它们分化成三个胚芽血统;他们在SCID小鼠移植后形成复杂畸胎瘤,产生嵌合体小鼠。

1。介绍

多能干细胞未分化的细胞已经扩散的可能性,自我更新、分化成外胚层的中胚层和内胚层的所有三个胚胎生殖细胞层在体外和在活的有机体内(1]。到目前为止,几种不同的方法被用于代已经被包括的ESCs获得受精后胚胎内细胞团的胚泡阶段(1,2]。他们也获得体细胞实施多能性基因的表达,引起所谓的诱导多能干细胞(万能)3,4];的一个有前途的方法更自然和伦理不成问题的建立已经是精原细胞,尤其是对人类医学治疗方法(5- - - - - -11]。精原细胞中存在少量的睾丸,但是他们可以被孤立和扩展在体外(5]。尽管他们是单能性的干细胞的环境控制下干细胞利基,在特定的文化条件下利基之外,没有任何外源多能性基因,它们能够转换为ESC-like细胞在不同时间文化的起始或隔离后的精原细胞(5,9,10]。

小鼠睾丸细胞的一代已经被认为可以追溯到2004年由Kanatsu-Shinohara et al。5SSC),当他们生成ESC-like细胞文化从两岁幼崽,并获得这些细胞4 - 7周后文化的开始。关等。9]获得ESC-like细胞从成年老鼠4-7-week-old STRA8-GFP阳性细胞的数量。柯等人反复5周的诱导多能性——7个月大Oct-4 GFP阳性成人精原细胞的归纳和描述了依赖初始镀的精原细胞和文化Oct-4-positive细胞不分裂的时间的长度(7]。另一方面,这一群体在后来出版协议转换的精原细胞与精原细胞的多能干细胞只老鼠在断奶后35天(5周)8]。

也Seandel等人从GPR125-positive成人spermatogonial-derived干细胞细胞生成3 -八个月大的老鼠,但这些细胞只有多功能(10]。

在我们的实验中,我们确定了自发的转换从新生儿和近成年睾丸精原细胞在ESC-like细胞7-week-old老鼠。相反,它是不可能产生ESC-like细胞从老鼠比7周。根据美国国立卫生研究院标准(http://www.researchgate.net/post/At_what_age_are_laboratory_mice_considered_adult28周后),老鼠被认为是成年的年龄。小鼠的性行为开始之间的5和6周的年龄(12]。根据芬利和达灵顿(13),老鼠应该考虑成熟的成年人3至6个月的年龄。

细胞的多能细胞的潜在代显然只能意识到7岁周。因此,它是一个有争议的点是否代的多能细胞取决于他们的发展现状与青春期的完成相关。从这个细胞生成ESC-like细胞类型的可能性似乎停滞在供体小鼠完全成熟的成年人。

2。材料和方法

2.1。隔离的精原细胞和建立和文化ESC-Like细胞

动物实验都证实了当地及国际指南的使用实验动物,鲁瓦扬机构审查委员会批准和机构伦理委员会(德黑兰,伊朗)和地区当局在德国(Regierungsprasidium卡尔斯鲁厄)。睾丸细胞被隔绝C57BL / 6, 129 / Sv鼠标株转基因Oct4-GFP-reporter日到6个月大的老鼠。删除白膜后,细精管分离和放置在一个装有胶原酶消化解决方案4(0.5毫克/毫升,σ),DNAse我(0.5毫克/毫升,σ),我Dispase(0.5毫克/毫升,罗氏)与mg hbs缓冲区^{+ +}和Ca^{+ +}在37°C (PAA) 8分钟。消化酵素ESC-qualified停止与10%的边后卫(表达载体)和另外的细胞悬液被磨碎吸量获取单个细胞悬液。离心后,细胞颗粒被DMEM / F12 (PAA),透过70μm细胞过滤器,再次离心10分钟1200 rpm。上层清液完全移除和老鼠的细胞被resuspended SSC介质(StemPro-34介质N2-supplement D +葡萄糖、牛血清白蛋白、谷酰胺,β巯基乙醇、青霉素、链霉素、MEM维生素、NEAA,雌二醇、黄体酮,EGF、FGF, GDNF,制药业,ES-FBS,抗坏血酸,丙酮酸,DL-lactic酸)和镀gelatin-coated文化菜(5×10到0.1%⁵细胞每9.6厘米²对新生儿和5×10⁵细胞每9.6厘米²成年鼠)。对3 - 7天后,文化的细胞从新生儿从成年老鼠老鼠和7 - 14天后,GFP-positive SSC殖民地手动选择从主文化和镀在老鼠胚胎支线(MEF)层至少四24-well板块(大约500个细胞/)/组。细胞通道1:1 - 1:4每3 - 4周。起初,精原细胞表达Oct4-GFP尤其是新生儿老鼠和老鼠比7周内弱得多。但这个信号是表达下调后2 - 3周后文化的开始。在SSC栽培我们每天筛选殖民地类似于鼠标的ESCs,重新ESC-like细胞表达高水平的Oct4-GFP。

这些生成的ESC-like细胞被手动选择和亚文化MEF支线层与KO-DMEM小鼠ESC(公司的)中,(ESC-qualified英杰公司)15%的边后卫(表达载体),1% NEAA (PAA)、谷酰胺(PAA) 1%, 1% Pen-Strep (PAA), 0.1%β巯基乙醇(英杰公司)、生活(ESGRO微孔)的最终浓度1000 U /毫升。ESC-like殖民地是生长在公司的媒体和通道每3 - 4天。

在补充方法部分(在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/8216312),我们的材料和方法详细描述RNA提取和rt - pcr分析,基因表达分析(Fluidigm Biomark),免疫荧光染色(IMH),电生理学,流式细胞仪分析,碱性磷酸酶测定,胚状体的身体(EB)形成,神经元分化,心肌细胞分化畸胎瘤和嵌合体小鼠的生产,和统计分析。

3所示。结果

3.1。隔离和扩张的精原细胞

温和与胶原酶消化后,精从新生儿睾丸小管,7-week-old, 12个月大的老鼠可以显微镜下分离和紫外光下调查。Oct4-GFP信号显然可见的新鲜分离细精管新生儿老鼠睾丸(图1(一)),而在成年老鼠Oct4-GFP信号的数量和强度低得多,在12个月大的老鼠(图非常低1 (b))。消化和镀后,Oct4-GFP信号的表达式是可检测新生儿和成人细胞,尽管成年细胞的扩展和较低的强度要低得多(数据没有显示)。的所有孤立Oct4-GFP精原细胞阳性DDX4(瓦萨号)和消极的波形蛋白免疫细胞化学(数据没有显示)。细胞的形态相似,无论老鼠的年龄和文化的日子。代表性的例子如图精原文化1。

程度天开始后的主睾丸和SSC媒介文化,精原细胞积极Oct4-GFP信号观察期间观察新生儿的文化,但很少在成年老鼠的文化(数字1 (c)和1 (d))。三周后,Oct4-GFP信号完全表达下调和不可见的附近在长期文化(数据未显示)。精原细胞是通过超过22倍,可以种植一年和更长时间。

3.2。基因表达分析新生儿和成年老鼠的细胞

我们量化和分析重要富含细菌的基因的表达(LHX1、斯特拉瓦萨号,DAZL, CD9 EPCAM, GPR125, GDF3, THY1, STRA8, GFRa1, 1 itgb1 TAF4b,装备,ETV5,和BCL6B)和多能性相关基因(Oct4、Nanog Sox2、TDGF1 KLF4, MYC, LIN28, SALL4, DPPA3,和DPPA5)在新生儿和成人细胞,从7岁和12个月大的老鼠获得通过实时PCR Fluidigm nanofluid技术。

层次聚类(系统树图)和主成分分析(PCA),如图2,明显,新生儿和成人精原细胞是不同的和局部分离系统树图或地区的树木在PCA。

数组的热图分析多能性和生殖细胞相关基因显示一个集群的各种人群的新生儿精原细胞明显不同于其他组,而成人精原细胞从7 - 12个月大的老鼠集群在一个单独的树。

新生儿精原细胞表达了显著更高层次的多能性Oct4基因,NANOG TDGF1,Sox2相比成人精原细胞(褶皱变化> 2以及)(数据2和3;补充表1)。

相比之下,一些生殖细胞相关基因在成人精原细胞表达在降序排列节点,MYC LHX1、GDF3 GPR125, BCL6B,叔,CD9、ITGB1,瓦萨号,TAF4b, EPCAM, BCL2L2, ETV5, DAZL, KLF4,后悔,THY1和在新生儿水平显著高于精原细胞(褶皱变化> 2以及)。

新生儿和成人之间没有显著调节精原细胞工具包,GFRa1 STRA8 LIN28,DPPA3(褶皱变化> 2以及)。

在一个比较新生儿精原细胞和精原细胞获得12个月大的老鼠,这些差异更加明显(见补充表)。此外,比较精原细胞从7-week-old和12个月大的老鼠,在精原细胞获得多能性基因表达明显高于7-week-old老鼠。

在酒吧里的情节(图一样明显3),核心多能性基因Oct4、Nanog和Sox2显著下调成人精原细胞从12个月大的老鼠,而生殖细胞基因的表达被发现更稳定更发达和分化精子形成的上皮细胞。与新生儿从7-week-old精原细胞和老鼠,Oct4也是无关紧要的12个月大的老鼠相比,成纤维细胞的差异表达。这可能表明一个重要的先决条件自然转向男性生殖细胞多能性是失去了在青春期。多能性基因的表达的下降在成熟是在aheat地图的边缘图和相关性分析4。核心多能性基因的表达水平Oct4, Nanog,Sox2精原细胞与动物的年龄下降。

3.3。多能的发生从Oct4 ESC-Like细胞GFP阳性细胞仅限于新生儿7-Week-Old老鼠

在数据记录5和6ESC-like细胞只能产生精原细胞从老鼠获得不超过7周,在这些细胞的培养时间46天至143天。如数据所示5(一个)和5 (b)46,ESC-like殖民地被观察到在天,48岁,84年,91年,101年和119年新生儿精原细胞和116和143天后7-week-old老鼠,计算从文化(起始数字5和6)。没有ESC-like细胞或殖民地可以观察到细胞的组织从9-16-week-old和23-24-week-old老鼠(获得数据5和6)。

我们没有观察到从SSC ESC-like殖民地文化的发展在46天前和后143天。

3.4。ESC-Like细胞多能,形成畸胎瘤,并产生嵌合体

ESC-like殖民地有拥挤的主轴-圆形形态与光滑边界(补充图2 a1)。此外,他们显示的高强度Oct4-GFP信号(补充图2 a2、a3)。ESC-like细胞系是通道1:5 - 1:8胰蛋白酶消化后超过15倍,据估计倍增时间48 - 72 h。他们仍然表示Oct4-GFP后长期培养。在多个通道细胞保存他们的未分化状态。老牌ESC-like细胞株成功扩张,冻存和解冻没有损失增殖或分化的能力。数据7和8做出明显的密切相似ESC-like细胞的基因表达谱和ESC富含细菌和多能性相关基因但显示明确的区分成纤维细胞。阅读系统树图、主成分分析和热地图,我们观察新生儿的ESCs推导和7-week-old老鼠ESCs混合物在树木和地区。此外,它变得明显从酒吧情节,所有的多能性基因强烈表达ESC-like细胞和ESCs(数字7和8;补充表1和2)。DPPA3、BCL2L2 SALL4,Nanog在ESC-like调节细胞相比ESCs(改变> 1.5折起来吗以及)。

ESC-like细胞系显示自发分化的能力在体外衍生品的所有三个胚芽层由EB形成后第十天,电镀(补充图4图5和补充)。信使rna和蛋白质表达为外胚层的谱系特定标记基因(巢蛋白,Map2,Tuj1,NeuN,GFAP,Pax6)(补充图4),中胚层(Gata4,Brachyury,EPCAM1,Myf5,MyoD,Islet1,SM-actin,FLK1)和内胚层(法新社和Keratin-18)(补充图5 a)证明了这一点。此外,定向分化成心肌细胞显示14(±3)击败每个领域的6-well板87(36±)跳动每分钟宫缩(补充图3 c;补充电影)。还分析了分化心肌细胞全细胞电流钳起搏器活动。这是观察到跳动的细胞随着时间的推移,有节奏的动作电位一代以一个恒定振幅(补充图3 c)。

因此,谱系特定标记基因的表达,Map2,巢蛋白,NeuN,Pax6, Tuj1,GFAP,展示了定向分化成神经细胞表型(补充图4),我们进一步检查的功能ESC-like细胞衍生神经细胞膜片箝记录(补充图3 f)。在一个简短的电流脉冲5 ms,所有细胞(动作电位)火。不断有细胞将火(2细胞6细胞记录)和细胞不会火(4细胞6细胞记录,数据未显示)。有趣的是,强势hypopolarizing当前显示的记录细胞动作电位后一代。此外,细胞之间的静止膜电位是变量。

我们测试的能力ESC-like细胞形成畸胎瘤和产生嵌合体小鼠进一步证实他们的多能性。我们皮下移植2×10⁶ESC-like SCID小鼠细胞。在注射后4周,ESC-like导致畸胎瘤包含所有三个生殖细胞层(数据9(一个)- - - - - -9 (d);补充图5 b)。组织学分析显示神经结构和表皮的存在(如外胚层的衍生品),骨骼结构和脂肪组织(如中胚层结构),和肠道结构畸胎瘤(内胚层的衍生品)的部分(数据9(一个)- - - - - -9 (d);补充图5 b)。调查嵌合体形成,ESC-like细胞转移到囊胚和嵌合小鼠被外套颜色(数字9 (e)- - - - - -9 (h))。

4所示。讨论

精原细胞是唯一的天然来源真正出生后多能干细胞的生物,而不需要人为地重新编程,如万能。背后的分子机制自然从一个单能性的转移到一个完全多能细胞在建立小鼠ESC-like细胞细胞直到现在还无法完全理解。然而,看来动物的年龄,鼠标使用应变,文化条件与生长因子参与,精原细胞在培养过程中,细胞密度的时间开始后的文化,文化可能所有关键球员的长度在过渡过程中(5,8- - - - - -11]。

在我们的工作中,我们展示了稀缺的精原细胞ESC-like细胞的转换。转换发生自发从精原细胞的新生儿到7-week-old小鼠睾丸但不是从年长的老鼠被认为是成年甚至成熟的成年人12,13]。这个观察意味着代ESC-like细胞从精原细胞的同时,鼠标的一般发展到一个青少年阶段,此后停止。尽管35天小鼠性发育成熟的年龄,相对成熟的快速增长继续对大多数生物过程和细胞。组织和器官继续发展在鼠标直到大约三个月的年龄12,13]。

我们观察到阳性细胞的数量和信号密度Oct4-GFP细精管的新生儿老鼠睾丸是高于老老鼠睾丸(后7周的年龄)。减少Oct4、Nanog Sox2,TGFβ1表达与衰老可能与减少未分化的SSC池。这些可能包括生殖母细胞和睾丸的prespermatogonia新生儿和年长的动物。这些观察也表明困难的一代ESC-like细胞从年长的老鼠。

我们也观察到的另一个限制ESC-like细胞起始后的文化现象只发生在一个特殊的时间窗口(46到143天)开始后的精原细胞的文化。一些报告关于长期培养精原细胞无法描述这个自发转移细胞多能ESC-like细胞(14,15]。

这些结果的一个至关重要的时间窗口给人的印象一代精原细胞和ESC-like不切实际的多能细胞产生的连续Oct4-GFP SSC文化。Kanatsu-Shinohara等人也生成ESC-like细胞在一个时间窗口约4 - 7周后启动的文化新生儿小鼠精原细胞(5]。回答这个问题的起源有关SSC-ESC-like转变,不同的记者包括Stra8 [9],GPR125 [10],Oct4 [7,8)是用于代ESC-like细胞。此外,Kanatsu-Shinohara et al。16]分析了单个细胞的发育命运的SSC文化出现在转染实验。但在所有这些实验中,原始细胞来源是异构的,尽管ESC-like细胞高纯度。

Ko et al。8)表明,诱导多能性从SSC文化Oct4转基因记者鼠标在断奶后35天。他们认为,这种转变主要是依赖于不同的细胞数量和长度的文化重组(2 - 4周),虽然他们并没有提到如果重组发生在每一个阶段的SSC文化。

我们证明了ESC-like细胞多能,表达多能性标记,可能对于复杂的畸胎瘤的形成,并产生嵌合体ESCs的接受者老鼠类似于老鼠。此外,他们是高度分化后神经元和心肌细胞表型的能力在体外分化,这也显示了其他组(17,18]。

主要感兴趣的研究因素,包括小分子,也可以增加概率和SSC PSC转换的限制时间窗口。最近,它已被证明,增加糖原合成酶激酶3抑制剂testis-derived SC文化增加的可能性从精原细胞[ESC-like细胞的发生11]。

在孤立的细胞的主要文化Oct4转基因记者老鼠,我们观察到Oct4-GFP信号表示在新生儿的适度低水平的年长或成人精原细胞。这个表达式完全表达下调在短期和长期SSC文化(19),高密度ESC-like细胞信号转换后才又再次出现。

信使rna表达分析证实,生殖细胞特定基因的表达随着年龄的增加,因此在细胞明显高于7 - 12个月大的老鼠相比,新生儿精原细胞。同时,我们观察到的表达Oct4a和Nanog,和Sox2在新生儿显著调节精原细胞和成年细胞表达下调。

在已经被认为,核心转录基因控制不同的谱系特定基因的表达和阻止多能细胞分化[20.]。已经证明这些基因以及其他与多能性相关的基因已经表示在新生儿癌虽然大多在一个较低的程度上(5]。我们分析显示一个至关重要的时间窗口的转移细胞ESC-like细胞来源于小鼠精原细胞发生生殖细胞的差别,对这些基因和upregulation产后核心多能性基因的老鼠,直到青春期。小鼠精原细胞转换成的自然潜力的多能细胞与小鼠的ESCs还不理解。多能性和有争议的一些挑战multipotency ESC-like细胞的存在(尤其是ESC-like细胞生成从人类睾丸)(6]。然而,自然的转变,从一个单能性的细胞参与精子形成一个多功能的细胞群,就是能分化为生殖细胞和细胞的细菌层,提供了一个道德不成问题的,为再生医学nonartificial替代。但是可能有局限性,这可能与供体的年龄也是一个特殊的时间窗口可以观察到自然重新编程的细胞在文化。

这项研究得出结论,单能性的精原细胞成多能细胞的自然重组不能只发生在成人,意味着这种转换是可观测到青春期和在一个特殊的文化开始后的时间窗口。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者想表达感谢所有同事请帮助他们在这个研究:史蒂芬阿尔布雷特,杰拉尔德Bendner(海德堡大学解剖学与细胞生物学研究所),和所有其他人们和机构支持这项研究。

补充材料

引用

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