文摘
骨骼肌是丰富便捷的成体干细胞来源。Skeletal-muscle-derived干细胞,称为卫星细胞,发挥重要作用在产后增长,维护、修复、骨骼肌的再生。尽管众所周知,卫星细胞数量的增加体育锻炼后,功能改变等卫星细胞增殖能力和分化效率运动及其分子机制尚不清楚。在这里,我们发现功能超载,这是广泛用于模型抵抗运动,导致骨骼肌肥大和转换卫星细胞从静止状态到激活状态。我们的分析表明,功能超载引发MyoD卫星细胞的表达和增强了这些细胞的增殖能力和分化潜能。卫星细胞特性的改变伴随着Notch信号的失活和Wnt信号激活的转录因子和可能涉及调制的袜的家庭。这些结果表明耐药性的影响运动对卫星细胞的调控的分子机制,并提供洞察卫星细胞激活后体育锻炼。
1。介绍
Skeletal-muscle-specific干细胞,称为卫星细胞,有助于产后保养,骨骼肌的生长、修复、再生1]。这些细胞位于质膜和基板之间的骨骼肌纤维占-6%的核和2.5%在正常生理条件下保持静止状态(2]。肌肉拉伤或运动,卫星细胞被激活并增殖和分化成成熟的纤维(3]。锻炼积极影响肌肉纤维成分通过调节改善肌肉卫星细胞性能。之前的研究表明,卫星细胞的数量是增加了长期或急性运动训练在人类和动物4,5)期间,减少老化与减少肌肉质量和功能潜力(6]。骨骼肌质量损失,称为sarcopenia,老化是一种严重的健康问题,影响数以百万计的成年人。因为运动可以提高肌肉力量和耐力能力,它可以作为一种手段,防止肌肉萎缩和减少sarcopenia的风险。
卫星细胞可以mitotically静止或激活增殖状态在骨骼肌营业额。可以区分这两个状态的表达特定的标记。所有卫星细胞表达stem-cell-specific转录因子,paired-box 7 (Pax7)。此外,激活卫星细胞表达肌原性的因子5 (Myf5)和肌原性的分化(MyoD) [7]。很少有研究功能改变等卫星细胞增殖能力和分化效率以下的练习。此外,exercise-stimulating细胞外因子的分子机制控制卫星细胞的激活和分化尚不清楚。
体育锻炼诱导细胞外信号的变化在影响骨骼肌卫星细胞。例如,Notch信号参与命运的决心和调节卫星细胞增殖,和之前的研究表明,体育锻炼增加Notch信号通路的表达年份配体、受体和下游effectors-in肌原性的细胞(8- - - - - -10]。另一方面,Wnt信号,导致骨骼肌卫星细胞的激活和血统规范,是激活运动(11- - - - - -13]。从切口转向Wnt信号控制从肌肉中肌原性的祖细胞增殖,分化再生(14]。虽然运动对切口的影响和Wnt信号被深入研究,详细了解他们的关系到卫星细胞的功能仍然是难以捉摸的。
功能超载(FO)的去除实验诱导协同相后的小腿肌肉模型动物和被广泛用于抵抗运动,导致各种生理反应如骨骼肌肥大和代谢的改善以及肌肉光纤类过渡(15- - - - - -18]。值得注意的是,在骨骼肌卫星细胞的数量增加后FO的机制还不清楚(19]。
在这项研究中,我们调查了FO卫星细胞的影响,包括它们的增殖和分化。我们发现,肌肉和激活但不是静止卫星细胞的数量增加佛后,也增加了这些细胞的增殖能力和分化潜能。卫星细胞性质的变化是伴随着Notch信号的失活和Wnt信号的激活。这些结果提供了洞察卫星细胞的分子机制激活后体育锻炼。
2。方法
2.1。动物
动物实验进行了以人道的方式在收到批准机构动物保健和使用委员会国家先进工业科学技术。动物被安置在标准笼子在设施与控制的温度和湿度下12:12 h光/暗周期和免费的食物和水。女性Fischer344老鼠(日本SLC Inc .、滨松、日本)12周的年龄被用于这项研究。老鼠被随机分为控制和FO组。没有老鼠体重的差异在实验的开始。
2.2。佛和组织抽样
跖肌肌肉FO组大鼠的重载通过手术移除比目鱼肌和腓肠肌肌肉如前所述15]。老鼠牺牲手术后2周过量戊巴比妥。核糖核酸或蛋白质提取,跖肌解剖从每个老鼠和冻结在液态氮测量湿重和存储后−80°C到均质化。免疫组织化学,老鼠受到transcardial灌注磷酸盐其次是4%多聚甲醛(PFA)。跖肌解剖和后缀4% PFA直到分析。
2.3。卫星细胞隔离和文化
主要从跖肌肌肉卫星细胞获得与链霉蛋白酶消化如前所述[20.]。评估增殖,细胞培养在生长介质组成的低糖杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)补充10%胎牛血清的边后卫,20 ng / mL碱性纤维母细胞生长因子(FGF),和1% antibiotic-antimycotic液体(anti-anti) laminin-coated 8-well钱伯斯在37°C和5%的公司2。中了3天后,细胞被固定为4% PFA免疫细胞化学。评估卫星细胞分化、肌原性的分化诱导培养细胞在分化培养基组成的低糖DMEM补充10%的边后卫,10%马血清,1%在laminin-coated anti-anti 6-well盘子或8-well钱伯斯在37°C和5%的公司2。1和2天后,细胞8-well钱伯斯被固定为4% PFA免疫细胞化学和6-well盘子收集在等基因试剂(日本东京日本基因)RNA隔离。
2.4。疣状
固定样本被放置在一个30%的蔗糖溶液和储存在4°C过夜。横截面的厚度被削减200µm切片机(rom - 380,大和Kohki、埼玉县、日本)组织收集并存储在介质(25%甘油、30%乙二醇和0.05 m PO4)−20°C到分析。部分和固定细胞被洗,permeabilized Tris-buffered盐水(TBS)含0.25% Triton X,阻塞正常的驴在TBS血清,5%和孵化后主要抗体:鼠标anti-Pax7 (1: 10;杂种细胞发育研究银行(DSHB),爱荷华州的城市,IA,美国),兔子anti-MyoD (1: 200;圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国),兔子anti-Dystrophin (1: 200;GeneTex欧文分校、钙、美国),和鼠标anti-myosin重链(MyHC) (MF20, 1: 10;DSHB) 3天(部分)或1天(细胞)在4°C。免疫反应性检测通过孵化Cy3-conjugated驴anti-mouse免疫球蛋白g (1: 500;美国杰克逊ImmunoResearch西树林,PA)或Alexa萤石488 -共轭驴anti-rabbit免疫球蛋白g (1: 500;美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)一夜之间在4°C。样品和4′,复染色6-diamidino-2-phenylindole (Wako纯化学工业,大阪,日本)。 After several washes, sections and cells were mounted on glass slides using Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Images were acquired using an Olympus FV1000-D confocal microscope (Olympus, Tokyo, Japan).
2.5。RNA分离和定量实时——(qRT) PCR分析
总RNA隔绝冰冻肌肉组织和培养细胞使用等基因试剂。RNA样本处理涡轮DNase(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)去除基因组DNA。互补脱氧核糖核酸合成使用PrimeScript RT大师混合(豆类生物,大津,日本)根据制造商的建议。互补脱氧核糖核酸与diethylpyrocarbonate-treated稀释10倍水和用作模板中存在,这是使用雷鸟SYBR qPCR混合(Toyobo,大阪,日本)CFX96系统(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。引物合成生命技术(日本东京)(表1)。95°C的反应条件是40周期为15秒和60°C 40年代。每个样品的分离曲线分析来验证每个反应的特异性。相对确定目标基因的mRNA水平ΔΔCt法和归一化的表达核糖体蛋白L32(RPL32)(体内分析)或甘油醛3磷酸脱氢酶(GAPDH)(体外分析)。没有差异的结果取决于ΔΔCt和标准曲线方法(数据没有显示)。
2.6。蛋白质的提取和免疫印迹分析
组织样本中均质裂解缓冲(50毫米玫瑰,pH值7.4;150毫米氯化钠;10毫米EDTA;10毫米氟化钠;10毫米Na4P2O7;2毫米Na3签证官4;1%的钠脱氧胆酸盐;1%诺乃清洁剂p 40;和0.2%钠十二烷基硫酸盐(SDS))与含有抑肽酶的蛋白酶抑制剂混合,e - 64,亮抑酶肽hemisulfate一水,bestatin,抑肽素(Nacalai Tesque,京都,日本)在冰上。匀浆在1770×g离心10分钟和4°C和上层的收集。蛋白质浓度测定用bicinchoninic酸蛋白质化验设备(热费希尔科学、日本横滨)和归一化2μ克/μL与SDS-polyacrylamide凝胶电泳(页面)加载缓冲区(62.5毫米Tris-HCl, pH值6.8;w / v SDS 2%;10%甘油;50 mM二硫苏糖醇;和0.01% w / v溴酚蓝)。蛋白质样品解决了sds - page (SuperSep王牌;Wako纯化学工业)和转移到聚乙二烯二氟化物膜,被封锁的阻塞一个解决方案(Nacalai Tesque)在室温下1 h。探讨了膜在一夜之间在4°C以下主要抗体(所有从细胞信号技术,丹弗斯,妈,美国):兔子anti-Akt(1: 1000),兔子anti-phospho-Akt (Ser473;1:1000),兔子anti-p70 S6激酶(p70S6K)(1: 1000),兔子anti-phospho-p70S6K (Thr389;1:500),兔子anti-glycogen合成酶激酶(GSK) 3(1:2000),兔子anti-phospho-GSK3(Ser9;1:2000),兔抗连环蛋白(1:2000),anti-GAPDH (1: 2000)。其次是孵化与辣根peroxidase-conjugated驴anti-rabbit免疫球蛋白g (1: 20000;美国通用电气医疗集团、费尔菲尔德、CT)在室温下1 h。包含0.05%渐变20在TBS反复洗涤后,皮尔斯热蛋白免疫印迹膜被孵化基质(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)和蛋白质乐队被化学发光在las - 3000迷你可视化系统(富士胶片、东京、日本)。每个膜进行了分析使用的图像国立卫生研究院ImageJ软件(http://rsbweb.nih.gov/ij/)如前所述21]。意思是强度和标准偏差(SD)计算。连环蛋白免疫反应性是GAPDH的规范化。
2.7。统计分析
与学生的数据进行了分析以及,用平均数±标准差表示。值< 0.05被认为是重要的。
3所示。结果
3.1。FO诱导骨骼肌肥大
老鼠受到佛为1周模型抵抗运动。没有身体质量差异FO和控制老鼠的实验(数据未显示)。然而,跖肌湿重的FO的肌肉明显高于控制老鼠(207.28±19.7毫克和161.72±19.3毫克)(数据1(一)和1 (b))。跖肌的横截面积也增加了FO(数字1 (c)和1 (d))。在以前的研究中,FO导致一种蛋白激酶的激活/哺乳动物雷帕霉素靶/ p70S6K信号,这增加了细胞蛋白质合成(22,23]。因此,一种蛋白激酶(Ser473)和S6K (Thr389) FO的磷酸化水平高于控制老鼠(图1 (e))。这些结果表明,FO可靠地引起跖肌肥大。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.2。功能超载了卫星细胞的激活和增殖
我们检查了佛对扩散的影响,采用免疫分析Pax7和MyoD的主要文化孤立于跖肌卫星细胞在生长培养基和培养3天(图2(一个))。Pax7的数量+MyoD+卫星细胞增加>在FO(图1.3倍2 (b)),表明增殖能力增强。
(一)
(b)
(c)
(d)
激活卫星细胞表达肌原性的监管因素(mrf) Myf5 MyoD,两个关键转录因子为肌原性的血统发展和分化,除了stem-cell-specific转录因子Pax7 [7]。我们调查数量的变化以及卫星细胞的字符后FO通过评估这些标记物的表达。Pax7的数量+细胞> FO的患病率比控制老鼠(图2 (c)),符合一个以前的报告19]。因为Pax7+激活细胞包括静止和卫星细胞群,免疫组织化学染色和Pax7 MyoD使用跖肌横截面来确定执行功能超载后卫星细胞群的变化。自积极Pax7免疫反应性在静止和激活卫星细胞,我们检查了coexpression Pax7 MyoD(卫星细胞激活的标志)跖肌横截面来确定卫星的身份FO后细胞群。Pax7+MyoD+卫星细胞被激活在控制中普遍存在,但很少观察到FO老鼠;Pax7的数量+MyoD+细胞增加后FO(图9倍2 (d))。总的来说,这些结果表明,抵抗运动诱发卫星细胞增殖和活化。
3.3。功能超载增加卫星细胞分化的效率
分化成肌细胞融合产生肌管。我们调查的影响FO孤立于跖肌卫星细胞的分化潜能在分化培养基培养肌肉和(图2天3(一个))。采用MyHC表达式的分析,表明新生成的肌管,显示肌母细胞来源于FO卫星细胞形成较大的肌管相比于控制细胞;融合指数(即。,number of nuclei/myotube) was > 3-fold in the FO as compared to the control group (Figure3 (b)),表明在细胞分化潜力增加重载的肌肉。
(一)
(b)
(c)
的表达水平Pax7,MyoD,myogenin(分化标记),MyHC3在孤立的卫星细胞被存在评估。RNA从细胞收集天0,1,2(之前和诱导分化后1和2天,resp)来检测基因表达的变化。虽然Pax7控制细胞中表达增加随着时间的推移,在FO细胞水平增加1天前回到基线2天(图3 (c)左面板上),这表明来自FO跖肌卫星细胞肌原性的血统,因此表达下调Pax7比控制细胞表达在一个更早的时间点。的确,MyoD在所有细胞水平随着时间的增加,但始终在FO高于控制细胞(图3 (c)面板右上角),这表明大部分来自FO跖肌卫星细胞已经激活,当这些细胞被孤立。Myogenin和MyHC3在天0和1表示在低水平;水平调节2天在所有细胞,但明显高于FO相比控制细胞(图3 (c)、较低的面板),与观察到的增加保持一致MyoD表达式在前。这些结果表明,卫星细胞分化和肌管的形成是由于FO加速,减少Pax7表达和相对较高的水平MyoD,myogenin,MyHC3可能是负责高效代肌小管细胞融合。此外,磁流变液的mRNA表达增加FO细胞表明监管FO引起的细胞外信号之间的联系,这些肌原性的基因的转录控制(尤其是MyoD)。
3.4。Overload-Induced卫星细胞的激活需要切口,Wnt和袜
切口和Wnt信号通路调节卫星细胞自我更新和肌发生在胚胎发生(24]。绑定的切口受体配体释放胞内域,易位到细胞核,结合signal-binding重组蛋白的免疫球蛋白J,从而激活靶基因的转录,比如那些属于他,嘿,家庭25- - - - - -27]。这些基本helix-loop-helix (bHLH)形成抑制因子活性他/ MyoD或嘿/ MyoD形成抑制MyoD表达式在静止卫星细胞,(28,29日),从而防止其分化成肌细胞。我们评估的表达Hes1和HeyL跖肌肌肉的存在,发现成绩单FO的水平明显低于控制老鼠(图4(一)),这表明抵抗运动诱发的转变卫星细胞从静止到激活状态通过阻断信号。
(一)
(b)
(c)
实际上wnt分泌蛋白质绑定到卷曲的受体在质膜(30.]。这个稳定β连环蛋白,形成一个复杂的T细胞因子(TCF) /白细胞增强因子(LEF)易位到细胞核,激活靶基因的转录31日,32]。Wnt信号调节肌细胞生成通过调制的MRF表达式(24),最近发现Wnt活化剂R-spondin诱发肌原性的卫星细胞分化[33]。我们检查了FO是否会影响Wnt信号在骨骼肌中存在跖肌肌肉样品的分析。Wnt3和R-spondin1mRNA水平增加FO相比控制老鼠(图4 (b)),这表明Wnt信号激活的抵抗运动,导致转移卫星细胞从静止到激活状态。
袜家族包括机动性高分组框转录因子参与各种组织的发育和分化。Sox8和Sox9同时表达下调在卫星细胞在分化过程中,和他们的过度抑制肌管形成和导致减少的表达MyoD myogenin,表明这些因素负调节卫星细胞分化维持自我更新的祖细胞池(34]。此外,Sox11表达分化肌管,可能积极调节卫星细胞分化[34]。我们发现Sox8成绩单是而下降Sox11在佛相比增加控制老鼠(图4 (c)),由存在决定的。综上所述,我们的数据表明,抵抗运动诱发卫星细胞的激活和通过切口和Wnt信号通路调节肌细胞生成和调制Sox8和Sox11的水平。
4所示。讨论
本研究调查卫星细胞的角色改变诱导阻力运动和分子机制激活。我们发现佛,一个实验模型的抵抗运动,增强卫星细胞增殖和分化,影响可能对通过调节切口和Wnt信号通路。
体育锻炼有不同的生理效应,包括减少体重,最大摄氧量增加,代谢的改善和增加骨骼肌卫星细胞的数量(35- - - - - -37),虽然机械基础增强卫星细胞增殖和分化以前没有报道。我们确认在我们的模型中,来自重载肌肉卫星细胞增殖能力和分化潜能较高相比来自控制肌肉。另一方面,一项研究报告称,卫星细胞来源于nonloaded小鼠后肢暂停降低分化潜能(38]。这些发现表明,外部应用机械刺激,包括体育锻炼,可以调节骨骼肌卫星细胞的属性。bHLH转录因子MyoD诱发肌原性的分化形成形成在E-box监管等阳性基因序列myogenin,肌动蛋白α1,肌细胞增强因子2 s,肌钙蛋白c2,i2,t3(Tnnc2,Tnni2,Tnnt3)等(39,40]。我们发现来自重载肌肉卫星细胞表达高水平的MyoD,这是与增加增殖和分化有关。最近表明,运动诱发的染色质重塑MyoD启动子和刺激转录13]。因此,抵抗运动可能促进卫星细胞增殖和分化的upregulation诱导MyoD。
切口和Wnt信号通路调节卫星细胞命运的决心和扩散。Notch信号,激活的体育锻炼8通过抑制,抑制肌原性的分化MyoD在卫星细胞表达。然而,我们发现切口的表达目标Hes1和HeyLFO的1周后下降。一个可能的解释是,运动性切口的激活是一个瞬态响应,返回到基线18 h后(41]。另一项研究表明,的水平HeyL和Delta4,这是一个主配体的信号通路,在成年小鼠表达下调4周后车轮运行(13]。此外,抑制Notch信号使用药物分泌酶抑制剂诱导肌管肥大(42]。因此,运动给卫星细胞性质可能改变Notch信号调制,但具体机制尚未阐明。
Wnt信号在胚胎发育中扮演重要作用而且在成体干细胞在不同组织的维护。在成年神经发生,星形胶质细胞细胞周围的成人神经干细胞分泌Wnt3,触发神经发生的诱导bHLH转录因子的表达NeuroD [43- - - - - -45]。因为Wnt3表达式在成年人的大脑可以改变等外界刺激的运动(46],干细胞利基市场作为传感器,调节成年神经干细胞的行为。在成人骨骼肌,Wnt3和R-spondin1表达式是随着卫星细胞的激活增加了抵抗运动。我们猜测,Wnt-inducedMyoD卫星细胞的表达使得他们的转变从静止到激活,增殖状态的老鼠受到佛,与之前研究的结果一致(13]。
Sox基因是必不可少的发展和各种组织的分化以及命运的决心在卫星细胞(34]。我们发现开关在卫星细胞从静止状态到激活状态发生在一起Sox8downregulation,表明Sox8负调节卫星细胞的激活。在中枢神经系统的发展过程中,Sox2块神经发生在胚胎干细胞(47]。然而,Wnt激活的去除Sox2触发器NeuroD表达和神经发生。这种监管机制取决于重叠Sox2和TCF / LEF结合位点NeuroD1启动子(44),这意味着神经元分化发生通过Sox2之间的串扰和Wnt信号。我们建议的表达MyoD-another bHLH转录因子卫星细胞是由一个类似的机制和Sox8调节肌原性的分化细胞通过调制的Wnt信号通路,尽管这种交互的详细描述是必需的。
5。结论
研究的结果显示阻力的影响运动对卫星细胞性质的规定,包括细胞数量的增加和增强分化潜力导致骨骼肌肥大。这些影响的差别与对这些切口,upregulation Wnt信号和转录因子可能涉及调制的袜的家庭。我们的研究结果表明,抵抗运动可以有效预防sarcopenia的进展。然而,进一步的研究调查的因素Notch和Wnt信号通路与卫星细胞的激活在运动中需要一个更完整的理解的功能和内在能力的卫星细胞在成年肌细胞生成。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
Kuwabara设计研究,导致采集的数据,并帮助写论文;Shin Fujimaki进行研究,分析数据和写论文;Masanao町田和Tamami若林史江导致采集的数据;和Makoto Asashima Tohru Takemasa支持研究和提供资源。所有作者阅读和批准出版的论文。
确认
作者感谢Hideto Takimoto动物保健提供援助。Shin Fujimaki, Masanao町田,是Makoto Asashima, Tomoko Kuwabara被支持的国家先进工业科学和技术。Tomoko Kuwabara和Tohru Takemasa支持科学研究补助金是(B)。Tomoko Kuwabara部分支持的科学研究在创新领域的补助金,武田科学基金会和三菱的基础。