富含血小板血浆得到不同抗凝剂及其影响体外血小板数量和间充质基质细胞的行为

文摘

有可喜的成果的使用富含血小板血浆(PRP)对肌肉骨骼组织修复。然而,变化的方法获取可能会导致不同的、反对发现文献中。特别是,抗凝剂的选择是第一个定义。在这工作,血液收集与柠檬酸钠(SC)、乙二胺四乙酸(EDTA),或枸橼酸抗凝葡萄糖(ACD)解决方案,作为抗凝血剂,PRP之前获得。血液分析和生长因子释放进行了量化,并对间充质基质细胞的影响(MSC)文化,如细胞毒性和细胞增殖(MTT法)评估和基因表达,进行评估。使用EDTA导致更高的全血中血小板产生;然而,它诱导增加平均血小板体积(MPV)后血液离心步骤PRP获得。使用SC和ACD导致更高的诱导MSC增殖。另一方面,PRP获得在SC提出更高的血小板恢复血液离心的第一步和最小MSC基因表达的变化。因此,我们建议使用SC PRP获得的抗凝剂。

1。介绍

富含血小板血浆(PRP)血小板的血液产品集中在等离子体至少5次以上的基线,在全血(1]。PRP正在调查作为自体产品改善在不同条件和组织修复损伤,尤其是对肌肉骨骼组织,如软骨的病变(2- - - - - -4),病变(5- - - - - -7),肌肉拉伤8,9),和骨修复10,11]。除了它的临床应用,PRP可能是一个有效的替代胎牛血清在细胞培养(12- - - - - -15]。其治疗潜力主要是基于在血小板生长因子存在的α颗粒(16),如转化生长因子β(TGF -β)[17),血管内皮生长因子(VEGF) [18),血小板源生长因子(PDGF) [19),这已经证明了在组织修复发挥重要的作用。当血小板集中和激活,预计因素释放的浓度达到三到五倍的等离子体中发现的(16]。

通用方法获得PRP包括收集与抗凝全血,紧随其后的是一个或两个离心步骤。第一次低速离心后,erythrocyte-free血小板集中等离子体恢复和提交给高速离心。Platelet-poor等离子体然后丢弃剩余的血小板颗粒均质成什么被视为PRP (16]。几个方面对该方法仍在争论中,如离心,白细胞,血小板激活和抗凝血剂和使用和类型(20.]。当没有使用抗凝剂,血凝块形成,血清可以获得但没有增加血小板浓度(21]。PRP的获取,凝固之前并不打算发生血小板浓度;因此,必须收集血液抗凝剂的存在。

用于输血、血液通常收集袋含有柠檬酸磷酸葡萄糖腺嘌呤(CPDA-1)解决方案,作为抗凝剂(22,23),血小板聚集是通过离心全血或apheresis的两倍。血小板集中通过这种方法也可以用于促进组织修复(24]。另一方面,最近对自体PRP制剂应用程序通常是在集合管含有柠檬酸的解决方案,以柠檬酸钠的形式(25- - - - - -29日]或ACD-A [30.- - - - - -32]。ACD,最后是存在于大多数可用的商业套件PRP生产(33,34]。在其他情况下,肝素(35,36)或EDTA (37可以使用)。常用临床调查,EDTA在血液学的测试中,SC在凝固的测试中,等离子体水平和ACD血小板源测量组件(38]。因此,我们的目标是分析抗凝血液收集的选择如何调节PRP特点以及它对间充质基质细胞培养的影响。

2。材料和方法

2.1。道德声明

所有的实验程序批准的伦理研究委员会Pro-Cardiaco医院,里约热内卢(研究设计院:14878813.4.0000.5533),和所有捐助者签署知情同意。

2.2。PRP获得

PRP得到如前所述,少量修改(39]。从九志愿献血者外周血收集(6男3女)使用含有柠檬酸钠的血液采集管(SC)(真空采血管®,裁判:369714;BD生物科学,圣何塞,CA)、乙二胺四乙酸(EDTA)(真空采血管,裁判:367861;BD生物科学)或枸橼酸抗凝葡萄糖(ACD)解决方案(真空采血管,裁判:364606;BD生物科学)的解决方案。血液收集在一个ACD管保持在同一管或分为三个聚丙烯管不含抗凝(猎鹰™裁判:352063;BD生物科学),称为ACD-2。

管在300 g离心5分钟(Megafuge®40,热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)。上层清液含有血浆和血小板,称为富含血小板血浆1 (PRP1),从每个管收集和转移到新的聚丙烯管不含抗凝。在ACD ACD-2,血小板计数后,从同一个捐赠者PRP1混合在接下来的实验。然后,PRP1离心机在700克17分钟。上层清液收集,即platelet-poor等离子(PPP)。购买力平价的一部分从每个管用于resuspend血小板颗粒,形成富含血小板血浆2 (PRP2),为了达到预期的浓度10⁶血小板/µl . PRP2被激活的血小板通过添加1 M CaCl₂(20毫米的最终浓度)和孵化37°C 1小时。血栓形成后,管子被维持在4°C在16小时允许血栓收缩。最后,管在3000 g离心20分钟,上层的收集,称为富含血小板血浆releasate (PRPr)。PRPr冻结在−80°C到解冻实验使用。

2.3。血液分析

血小板计数,红细胞,白细胞,和分析平均血小板体积(MPV)测定全血,PRP1, PRP2,购买力平价分数。这些分析血液分析仪(迈瑞在公元前2800年,Perdizes、SP、巴西)。血小板恢复离心的第一步后,表示为一个百分比,计算的血小板总数除以PRP1全血血小板总数。

2.4。生长因子的量化

PRPr-derived TGF -β1,VEGF是量化使用ELISA试剂盒(Ref: KAC1688和Ref: KHG0111;表达载体™热费希尔科学)根据制造商的指示。吸光度是决定使用一个微型板块读者(Multiskan去,热费希尔科学)。

2.5。骨骨髓来源间充质基质细胞(BM-MSC)隔离和文化

120毫升的骨髓捐赠后获得了知情同意从两个捐助者(一个41岁的女人,他的细胞用于细胞可行性分析,和一个60岁的人,其细胞被用于基因表达分析)。单核细胞分离使用Sepax系统(Biosafe、Eysins、瑞士),根据制造商的指示,镀在4×10⁵细胞/厘米²最低基本中鹰阿尔法(αMEM)修改(Cultilab,坎皮纳斯、SP、巴西)补充10%胎牛血清(的边后卫)(Gibco) T 150厘米²培养瓶(纽约康宁合并,康宁)和维护有限公司5%₂孵化器在37°C。5天之后,改变了媒介和不依从细胞被解雇了。媒介改变了每两天。这是称为“主文化。“大约10天后,70 - 80%的融合,细胞脱离文化烧瓶用0.05%胰蛋白酶溶液(Gibco®,热费希尔科学)和山肩到新的培养瓶8×10的密度³细胞/厘米²。第一胰蛋白酶化之后,文化被称为“# 1。“实验”进行,直到通过# 5。”

2.6。细胞生存能力分析

细胞生存能力的分析是由公司与噻唑基溴化四唑蓝(MTT试验)(西格玛奥德里奇、圣保罗、SP、巴西)。通过细胞(# 3)镀的密度5×10³细胞/厘米²在复制48-well板块(康宁合并)αMEM (Cultilab)补充10%的边后卫(Gibco), 1% PRPr PRPr PRPr 2.5%,或5%。四种不同PRPr捐助者。在另一组,四个样本汇集每个捐赠者的以同样的比例,即PRPr混合。文化的后8天,0.5毫克/毫升MTT补充道。4小时后介质被孵化,400µL / DMSO溶液的加入溶解减少甲瓒产品。48井的数量在每一个分裂成两个井在96孔板(康宁合并)。最后,板在微型板块阅读器阅读(Multiskan去,热费希尔科学)在570海里。在这个实验细胞培养基是没有改变。

2.7。基因表达的评估

(# 5)通过细胞培养在阿尔法MEM (Cultilab)补充10%的边后卫(Gibco) 1%, PRPr PRPr PRPr 2.5%,或5%。PRPr用作池的四个不同的捐赠者。经过五天的文化,总RNA提取使用试剂盒®(Ambion®,热费希尔科学)。RNA浓度确定使用Nanodrop 2000紫外可见分光光度计(热费希尔科学)和2µg reverse-transcripted成互补DNA(互补)使用上标®第一链合成系统rt - pcr(表达载体,# 11904 - 018)的反应总额20µL,遵循制造商的协议。寡核苷酸和探针qPCR买来应用生物系统公司(TaqMan基因表达分析,# 4331182):HPRT1 (Hs02800695_m1),分析作为看家基因,SOX9 (Hs00165814_m1) RUNX2 (Hs00231692_m1) PPARG (Hs01115513_m1)和POU5F1 (Oct-4) (Hs0099634_9H)。qPCR反应进行的应用生物系统公司7500标准时间PCR系统20µL反应体积使用TaqMan®普遍掌握混合二世与)(应用生物系统公司,# 4440038),根据制造商的指示。分析使用ΔΔCt方法(40]。

2.8。统计分析

数据分析使用的小动物——一张长有配对以及血液分析,分析了一组相同的捐赠者与不同的抗凝血剂。生长因子的量化和细胞培养实验中,在配对样本并不一定发生,小动物——一张长有未配对以及执行。统计学意义是考虑。

3所示。结果

3.1。不同抗凝剂对初始血小板计数的影响和恢复

五个不同捐赠者的血液样本收集管包含EDTA、SC、或ACD和血小板数在一个自动化系统。血液样本收集与EDTA产生更高的血小板数量,其次是SC和ACD(图1(一))。平均、血小板计数在SC EDTA低于16.28%,而在ACD 23.01%低于低于SC EDTA和7.94%。然而,血小板恢复,对血小板总数后离心的第一步,是更高的SC与EDTA和ACD相比。血小板恢复EDTA和SC的平均值76.15%和81.21%,分别。引人注目的是,收集的样本中,血小板恢复和ACD是45.71%,几乎半数当使用EDTA或SC。所有三个抗凝血剂测试在此购买商业分布管。ACD包含管是bigger-taller larger-compared EDTA和SC。

为了验证低血小板复苏管相关格式,PRP获得血液样本实际上在ACD使用管类似的大小与EDTA和SC (ACD-2)。血小板恢复改善(49.82%),但仍远远低于那些恢复当使用EDTA(76.15%)和SC (81.21%)。值从ACD-2在统计学上不同于那些获得使用SC (EDTA(相比),但不)(图1 (b))。如果单独分析,可以观察到血小板恢复增加了三个五捐助者使用ACD-2代替ACD时,尤其是在捐助2,增加了63.74%,同时减少了两个捐赠者,特别是在捐赠1,减少25.48%,血液进入小管的分布(图1 (c))。平均,血小板浓度在PRP2 1009±57×10³/µL在EDTA样本,582±108×10³/µ在SC L样本,726±200×10³/µL在ACD样本,664±170×10³/µL在ACD-2样本。所有值彼此之间在统计学上类似的(EDTA和SC(之间),除了)(数据未显示)。

虽然平均血小板体积(MPV)和血小板相关尺寸和表明其程度的激活,类似时全血(WB)样本实际上在所有三个抗凝血剂测试,后逐渐增加两个离心步骤EDTA集团所有捐助者(平均增长11.60%后离心的第一步,额外增加2.84%的第二次离心步骤,总计14.44%的增长相比,全血)。这不是观察到当世行实际上在SC和ACD(图2)。

3.2。TGF -β1,从富含血小板血浆VEGF释放不同的抗凝剂

这一点,很明显,抗凝血离心后影响血小板的恢复。然而,我们质疑如果它还将改变生长因子释放血小板中恢复过来。为此,我们量化TGF -βELISA试验1和VEGF水平。生长因子浓度之间的类似抗凝组(TGF -)β1和VEGF。TGF -β1浓度是18146 .99±2370 .33 EDTA pg / mL;48559 .10±12839 .86点在SC pg / mL;和30786±6654 pg / mL在ACD(图3(一个))。VEGF浓度为278.88±71.78 pg / mL, EDTA在SC 143.65±71.63 pg / mL, 362.70±77.95 pg / mL在ACD(图3 (b))。

3.3。骨骨髓来源间充质基质细胞培养

为了显示释放的影响因素使用不同的血小板体外抗凝血剂在调节细胞扩张,我们使用MTT细胞生存能力分析来分析BM-MSC PRPr扩散在不同浓度的存在。FBS-supplemented培养基(图作为参考4)。PRPrs分别进行了测试和混合(混合)。所有PRPr浓度测试所有捐助者能够刺激体外细胞增殖。正如所料,更高浓度测试(5%)刺激体外增殖率越高,不管抗凝剂使用。然而,对于这个浓度、平均细胞增殖较低的EDTA派生PRPr SC和ACD(图4)。此外,保持纤维母细胞形态学不管抗凝类型(图5)。

3.4。调制的富含血小板血浆骨骨髓来源间充质基质细胞基因表达的文化

我们也分析了基因表达的细胞体外(图扩展6)。只在5% PRPr细胞培养测试。使用10%的边后卫作为参考,RUNX2略调节EDTA组和SC组中表达下调。PPARγ2略调节EDTA集团和SC和ACD组织中表达下调。SOX9在所有组表达下调。Oct-4调节在EDTA和ACD组和SC组中表达下调。尽管如此,一般来说,PRPr组之间的基因表达相似,尤其是当观察基因表达的最大和最小相对量化,SC组提出了最小的变化与对照组相比,通过分析四种基因的平均相对表达PRPr组相比的边后卫。平均,SC相对基因表达不同于对照组,24.73% EDTA是46.79%和ACD 29.74%不同。

4所示。讨论

富含血小板血浆(PRP)是目前的一个主要策略,以促进肌肉骨骼组织修复。在文献中有几个报告证明其潜在的临床试验(2- - - - - -11)以及体外分析(12- - - - - -15]。作为具有成本效益的来源的自体生长因子可以影响干细胞增殖和分化,它被越来越多的研究作为一个补充,佐剂,载体,或支架杆细胞疗法(41- - - - - -45]。然而,缺乏标准化的方法来获取和使用PRP在不同组可能会妨碍这种技术的发展(20.]。收集血液抗凝剂的使用是一个主要问题。目前的工作旨在验证PRP获得与三种类型的商用采血试管中EDTA、SC、ACD抗凝血剂。

血小板计数在血液收集管含有更高的EDTA,其次是SC和澳洲牧牛犬。事实上,之前已经表明,血小板在EDTA可以高于柠檬酸抗凝血剂(46]。此外,当EDTA添加柠檬酸盐样品,它能增强血小板在全血(47]。血小板恢复后离心的第一步是在ACD管与EDTA和SC相比减少。另外,更高浓度的PDGF-BB PRP中发现了用EDTA ACD(相比48]。在我们的例子中,我们试图增强血小板恢复在ACD管将其内容分成更小的管子(12×75毫米×5毫升),没有额外的抗凝剂。虽然无统计差异被发现两者之间ACD形式,血液在小管的分裂导致类似的血小板恢复相比,EDTA组。自从ACD管更大(16×100毫米×8.5毫升)比EDTA(13×75毫米×4.0毫升)和SC管(13×75毫米×4.5毫升),有可能降低血小板恢复不仅是由于抗凝剂的类型本身还管格式。特别是管格式可能有优越的影响全血比血清/血浆离心,鉴于其高粘度(49]。下列实验,我们决定混合ACD和ACD-2 PRP1来自同一个捐赠者,因为它是由相同类型的抗凝和离心后准备执行PRP2以来所有群体的相同类型的管进行了分析。

为了验证影响血小板形态离心步骤,我们量化平均血小板体积(MPV)在全血,PRP1, PRP2获得不同的抗凝血剂。EDTA的MPV组,但不是在SC和ACD组,增加了离心步骤后,这可能是血小板活化的指标(50,51]。的确,更高的MPV预计将在全血中收集的EDTA与柠檬酸盐样品(46]。此外,EDTA可能改变血小板形态从铁饼状的不规则球形(52]。实际上,使用EDTA面临的伦理问题,如被指为持久性污染物在自然环境中(53),使用和障碍在某些国家(54]。ACD和citrate-theophylline-adenosine-dipyridamole (CTAD)也比肝素更有效的维持血小板形态和SC。在这种情况下,它也表明,获得的PRP ACD和CTAD导致更高的TGFβ1浓度和诱导MSC增殖(55]。在另一个先前的研究中,EDTA、SC和ACD比较血小板反应的维护者聚合诱导物。ACD是最能保持intraplatelet信号转导机制在PRP制剂(56]。同一组,最近,表明ACD还能够维持血小板功能时间优于SC (57]。在我们的例子中,我们找不到任何差异的能力血小板活化和血栓形成在PRP2获得三种不同的抗凝血剂。

我们的下一步是评估PRP在细胞培养中取得的效果。为此,我们归一化理想1000×10的血小板浓度³/µL组,结果不相关的血小板浓度抗凝剂的类型。这PRP中血小板浓度是指作为体内的治疗浓度的目的(1]。在骨,例如,低浓度不满意和更高浓度抑制促进组织修复(11]。唯一的统计差异中观察到血小板浓度在PRP2 EDTA和SC组之间。SC组的低价值可能归因于resuspend血小板颗粒的困难。血小板袋准备与柠檬酸样本,集中在ACD的形式,包含总量超过袋准备与EDTA (52]。此外,PRPr对细胞培养的影响总是10%的边后卫中补充。尽管作为一个异种的血清与伦理和科学问题(58),的边后卫仍广泛应用于细胞培养(59)和MSC在体外扩张(60]。

在我们的研究中,我们找不到TGF差异β1和VEGF在抗凝血药浓度。它可以是可能由于血小板浓度组间相似。平均,TGF -β1浓度从18.15 ng / mL的EDTA在SC 48.56 ng / mL。其他文献报道存在浓度优于我们的发现:120 ng / mL (61年],169 ng / mL [62年],89 ng / mL PRP中血小板浓度的4.69倍优于全血基线但20 ng / mL PRP中血小板浓度的1.99倍优于全血基线(63年]。VEGF浓度范围从143.65 pg / mL SC在ACD 362.70 pg / mL。其他报告存在不同浓度从50 pg / mL [64年)到155 ng / mL (61年]。然而,我们的研究结果都优于一些商用设备(65年]。

正如所料,PRPr诱导细胞增殖。虽然有差异比较捐助者之间的对细胞增殖的影响,可能是由于一个固有的差异在生长因子和其他内容在每个血小板颗粒分子,一个明显的模式出现了:5%的浓度在细胞培养基PRPr足以诱导细胞增殖以类似水平的边后卫的10%。此外,SC和ACD-derived PRPr提出了更大的影响对细胞增殖与EDTA组。细胞形态是团体中没有改变。BM-MSC维护他们的成纤维细胞的形态无论抗凝。虽然仍有争议在文献中关于PRP对BM-MSC分化的影响,其效果有一个共识作为诱导物扩散的66年]。

最后对BM-MSC PRPr影响的分析,我们观察到细微的调节在成骨的主基因的表达(RUNX2),脂肪形成的(PPARγ2),chondrogenic (SOX9)血统67年),以及Oct-4具备干细胞基因相关的维护(68年,69年]。特别是SOX9表达下调。的确,在文献中有一个讨论关于PRP对软骨形成的影响,一些组织声称其诱导效应(70年,71年)和其他人的抑制性影响(72年,73年]。最近,我们已经表明,它可以依赖PRPr用于细胞介质的浓度,浓度较低的诱导软骨形成和更高浓度抑制(74年]。Oct-4表达了强烈的变化,upregulation EDTA在SC差别和ACD组和对这些组。这是否可以维护具备干细胞细胞的指标,必须进一步研究。PRP组之间在一般情况下,基因表达相似,尽管SC组呈现较小的变异与10%的边后卫文化相比,证明细胞呈现最轻的表现型的变化与治疗。

5。结论

文献提供了各种方法来获取PRP。第一个变化是方法收集血液抗凝剂使用。在本文中,我们分析了三种不同的抗凝血剂的影响,得到了在商用管,PRP获得。尽管没有显著改变观察生长因子释放,一些功能可以突出显示。血液收集管包含EDTA导致更高的全血血小板产生。然而,这是伴随着增加MPV离心步骤后,血小板形态变化的指标。另一方面,使用含有柠檬酸的管解决方案导致更大的诱导MSC增殖。特别是,SC的获得导致更高的血小板恢复后离心分离的第一步。如果使用ACD,管尺寸的减少可能会增加血小板的恢复。此外,SC的PRP获得了最小的MSC基因表达的变化与细胞培养在10%的边后卫。 Therefore, in order to obtain a bigger amount of platelets and induce MSC proliferation without dramatically interfering with their phenotype, we suggest the use of SC as anticoagulant for PRP acquisition.

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者要感谢所有的工作人员阿米尔生命科学的支持。

引用

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版权

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