Tenogenic诱导分化的细胞外肌腱矩阵和短期循环拉伸

文摘

肌腱和韧带病态仍然是一个治疗的挑战,由于恢复困难复杂的细胞外基质结构和生物力学强度。正在取得进展在细胞治疗和组织工程方法,全面了解肌腱愈合的祖细胞的命运仍然缺乏。本研究的目的是研究脱细胞肌腱的影响矩阵和温和的循环拉伸刺激可能直接tenogenic命运一样自然。马脂肪间充质基质细胞(MSC)被播种在脱细胞肌腱矩阵支架。机械刺激在一个定制的应用生物反应器循环压力。评估执行4 h, 8 h,机械刺激后24小时。支架培养诱导细胞排列和tendon-related基因的表达改变,虽然比单层培养细胞生存能力下降。短的机械刺激时间增强大部分scaffold-induced效果。胶原蛋白1 a2表达水平下降,而胶原蛋白3 a1和decorin水平增加。Tenascin-C scleraxis表达式显示,最初的减少,但增加了刺激后24小时。 The results obtained suggest that decellularized tendon matrix, supported by cyclic stretching, can induce tenogenic differentiation and the synthesis of tendon components important for matrix remodeling.

1。介绍

治疗肌腱和韧带在骨科疾病仍然是一个主要的挑战。在许多情况下,最初的功能不能恢复常规疗法。肌腱和韧带的特点是低细胞结构和高度结构化的细胞外基质显示非凡的机械强度和弹性1,2]。修复过程中这些组织包括hypercellular疤痕组织的形成缺乏生理基质组成和结构,从而导致低劣的生物力学特性和高的风险reinjury [1,3]。已取得相当大的进展在应用程序基于祖细胞治疗策略和组织工程技术。这里,改善组织(重新)组织是一个主要的目的为了实现机械强度和弹性2]。

马大动物模型的研究表明,本地应用程序的多功能间充质基质细胞(MSC)治疗肌腱疾病支持生理组织架构的重组(4- - - - - -6和改善肌腱生物力学特性6]。然而,这些改进调解的机制尚未完全清楚。更换tenocytes之后,应用MSC tenogenic分化可能是复杂的过程的一部分,连同当地tenocyte的调制和白细胞活动(6]。尽管tenocyte替换本身不太可能是肌腱再生的主要贡献7),tenogenic分化伴随着生产重要肌腱矩阵分子机制来支持矩阵重组可能是至关重要的。胶原蛋白,胶原蛋白,即1 a2,肌腱矩阵是最重要的组件在数量的基础上,进一步分子的重要性,尤其是对矩阵架构(2]。例如,decorin和tenascin-C参与胶原fibrillogenesis甚至表示,如果培养的MSC (8]。

旨在理解和优化再生治疗肌腱和腱组织工程策略,它仍然是重要的提高理解tenogenic通路的刺激和肌腱细胞外基质重塑。Tenogenic体外分化已经调查了使用各种各样的方法。这些包括补充与生长因子(9- - - - - -11与tenogenic]或转染的细胞转录因子scleraxis [12,13)以及不同支架的应用生物材料或机械刺激的细胞。虽然几个作者报道了有前景的结果,这一事实tenogenic分化正在接近使用这些不同的刺激突显出,还没有一个普遍接受的理解途径。

为支架材料,它已经表明,一方面,地形因素在人工组装支架可以直接lineage-specific分化(14,15]。另一方面,自然也引起肌腱腱组件标记upregulation粉(16,17[],尽管其他的研究报道相互矛盾的结果18,19]。此外,骨标记时表示下级粉肌腱矩阵添加到结构(17]。因此,自然脱细胞肌腱组织将完美结合地形和矩阵组件刺激tenogenic分化。根据这一假说,在脱细胞肌腱腱祖细胞培养矩阵显示tenogenic转录因子的高表达与细胞培养在骨或真皮矩阵(20.]。

机械刺激形式的静态张力或循环轴向在大多数研究刺激导致了令人鼓舞的结果。相比静态张力,循环应变促进细胞排列和upregulation肌腱矩阵分子如胶原蛋白,胶原蛋白3,tenascin-C和肌腱分化标记如scleraxis [21- - - - - -25]。低或中度机械刺激制度进一步完善构建生物力学属性(26]。然而,循环轴向应变也可以上调成骨分化标记(27),显然是依赖于刺激政权应用(28]。

基于现有的知识目前的研究开始的时候,我们的结论是,文化对脱细胞肌腱支架结合机械刺激将是一个关键的一步为tenogenic分化进一步研究刺激。优化后的去细胞协议大肌腱(29日使用循环应变)和初步实验生物反应器(30.单层文化的刺激,我们开发出了一种生物反应器适合应用循环应变的脱细胞肌腱支架(31日]。本研究的目的是为了更好地了解刺激导致重要的肌腱矩阵的合成组件,由支架和循环应变假设,结合刺激会控制自己的表情。

2。材料和方法

2.1。间充质基质细胞复苏

皮下脂肪组织从1 - 5岁6个健康的马,安乐死是由于原因与本研究无关。组织碎和胶原酶消化我的解决方案(0.8毫克/毫升;德国生活技术,卡尔斯鲁厄)37°C 4 h和释放细胞被播种在组织培养瓶使用杜尔贝科的修改鹰介质与葡萄糖1 g / L(生命技术)补充10%胎牛血清(技术),0.05毫克/毫升(0.1%)庆大霉素(PAA实验室、Coelbe、德国),100国际单位/毫升青霉素和链霉素0.1毫克/毫升(penicillin-streptomycin 1%;生活技术)作为标准培养基。细胞培养在湿润的气氛中有5%的公司₂在37°C和媒介改变了每周两次。通道1细胞冻存,然后进一步扩大之前在标准条件下通过3中被用于实验。MSC马脂肪细胞以前的特点被描述由我们集团(32,33]。

2.2。肌腱支架制备

表面的数字屈肌肌腱从马尸体四肢从屠宰场中恢复过来。他们洗在磷酸缓冲盐(Biochrom,柏林,德国)补充penicillin-streptomycin 2%和0.1%庆大霉素在一夜之间4°C和存储−80°C,直到进一步的处理。接下来,肌腱像之前描述的那样是汇集和脱细胞(29日]。简单地说,他们受到5冻融循环在孵化前aqua桌子48 h,其次是100年1% Triton-X孵化(卡尔罗斯,卡尔斯鲁厄,德国)48 h和清洗步骤。之后去细胞、肌腱被切成支架(10 - 8厘米长、1厘米宽,和2毫米厚度)。支架被储存在−80°C,直到被用于细胞培养。

2.3。循环应变生物反应器

使循环拉伸肌腱支架,一个定制的循环应变生物反应器开发基于数据从初步生物力学评估获得的脱细胞肌腱支架。相关性电动机的选择,这些数据表明,加载逼近500 N拉伸支架所必需的要求(31日]。拉伸装置位于一个圆柱形介质室,包括夹子修复10厘米长肌腱支架两端同时8厘米支架长度仍然自由伸展。其中一个夹子是自由移动沿着肌腱轴和加上一个1 kN汽车为了应用单轴循环应变(图1)。

2.4。刺激实验

分析循环拉伸肌腱细胞外基质的影响,MSC,实验进行了以下实验组:静态脚手架文化(静态),动态脚手架文化根据刺激政权我(我)敌人或刺激政权II(机枪兵II),和单层控制标准的塑料培养皿中培养。

MSC是均匀分布在表面的prewarmed支架(10⁶细胞/厘米²允许附加6 h),直到标准培养基补充道。支架在标准孵化条件3天。

动态组接受了与2%应变循环拉伸间隔1赫兹的频率(机枪兵我:15分钟拉伸,休息15分钟,30分钟拉伸;机枪兵II: 15分钟拉伸,休息15分钟,30分钟拉伸,休息30分钟和60分钟伸展)。分析了支架4、8、24 h后拉伸时间间隔。

静态脚手架文化和单层文化准备和分析相应的时间点。每个实验进行了分别从每个捐赠者MSC (),一式两份。

2.5。组织学

评价细胞生存能力以及细胞形态、对齐和分布在支架表面,中央和周边地区的新收获样品受到生活/死染色使用相应的工具(技术)根据制造商的指示。

进一步评估细胞分布和集成到支架以及胶原基质生产石蜡的部分是由中央和周边地区的样本受到原骨胶原的苏木精和伊红染色和免疫组织化学染色。

疣状进行了使用山羊反原骨胶原1 a1多克隆抗体或鼠标反原骨胶原3 a1单克隆抗体(17或B-4;圣克鲁斯生物技术、德国海德堡)结合Immunocruz™ABC染色系统(圣克鲁斯生物技术)包含驴抗体或山羊anti-mouse二级抗体。简单地说,部分deparaffinized,孵化与甲醇和0.005%的H₂O₂30分钟,洗净。幻灯片被孵化的各自主要抗体(1:50)一夜之间在4°C。进一步洗涤步骤之后,他们孵化与二级抗体(1:50)30分钟,其次是在制造商的检测步骤详细说明。用苏木精复染色了。同形像控制以及消极控制省略主准备相应的抗体。

生活/死染色评估1观察者后立即处理。所有染色石蜡切片是由2个独立观察员评估样本组的无知。评分系统用于半定量的评价如表所示1。

2.6。实时聚合酶链反应

基因表达的肌腱细胞外基质组件和肌腱分化标记胶原蛋白1 a2,胶原蛋白3 a1, decorin, tenascin-C, scleraxis被实时PCR分析。胶原蛋白2 a1和骨桥蛋白(即。,secreted phosphoprotein 1) expression was additionally assessed to detect potential induction of chondrogenesis or osteogenesis. GAPDH and ACTB served as housekeeping genes. Primer sequences are given in Table2。

肌腱结构被切片cryomicrotome(厘米3050年代;徕卡微系统公司位于德国)和孵化同质化缓冲区(氯化钾玫瑰15毫米,2.5毫米,68.5毫米氯化钠,450μEDTA M Na2HPO4, 17.5毫米,27.5毫米葡萄糖在pH值包含100 7)μg / mL蛋白酶K(技术)在55°C 60分钟。均质化后,总RNA与苯酚/氯仿抽提和纯化异丙醇沉淀。总RNA控制MSC孤立使用RNeasy®迷你包(试剂盒、希尔登,德国)根据制造商的指示(09/2010)协议版本。DNase-treated RNA使用RevertAid H -反向转录合成第一链cDNA工具包(热费希尔科学、Nidderau、德国)与oligo-dT18引物所描述的制造商。相对量化的互补脱氧核糖核酸进行应用生物系统公司®7500实时PCR系统(技术)和SYBR®绿色双线DNA-specific染料(智商™SYBR绿色Supermix Bio-Rad实验室、德国慕尼黑)。

根据Pfaffl相对基因表达率计算方法(34)和归一化从各自的单层获得控制。数据提出了“折叠变化”增加或减少。

2.7。统计分析

重复的平均值和样本不同区域(中央或外围)被用于最后的统计分析。使用SPSS统计22 (IBM德国GmbH, Ehningen,德国),弗里德曼测试和Wilcoxon符号秩检验进行分析实验群体之间的差异。是水平的意义。

3所示。结果

3.1。细胞生存能力

生活/死染色显示支架文化的活细胞比例下降相比单层控件()。在大多数样品支架上培养,50 - 75%的MSC是至关重要的,对应于2得分,然而,在所有单层样本,75%以上的MSC是至关重要的,对应3得分。这种差异是观察分析时间点(4、8、24 h),也就是说,总共3到4天后脚手架或单层培养。此外,机械刺激倾向于进一步影响细胞的生存能力,但这只是重要的机枪兵II组8 h和机枪兵我组在24小时(而静态脚手架文化)(图2)。

3.2。细胞排列和集成

评价细胞形态和定位支架表面使用现场/死彩色样本显示,脚手架文化有力地带动了平行排列,更苗条的样子,细长的细胞。这导致支架组的得分之间的显著差异相比单层控件(静态和机枪兵II组4 h和8 h),尽管其他参数包含在得分没有差别。机械刺激似乎减少scaffold-induced细胞排列,成为最明显比较获得的得分在静态和机枪兵II组8 h (),但比单层细胞仍然更一致的控制。在某些情况下,部分细胞分离后观察到的拉伸大多在打第二针组(图2)。

苏木精和伊红染色的纵向部分显示,在大多数支架,MSC的主要部分是位于支架上的细胞层表面,与一些细胞开始融入肌腱矩阵。虽然是一个趋势,短期拉伸(机枪兵我)推广单元集成4 h和8 h,组间无显著差异被发现对细胞的形态层在支架(图2)。

3.3。腱标记表达式

实时PCR表明胶原蛋白1 a2表达下调后支架文化相比单层控制时间点,这是重要的静态和机枪兵我组4 h ()。这种效应被机械刺激加强,特别是在机枪兵我在24 h组,但差异不显著(图3)。基于PCR的结果,我们不希望重要免疫组织化学胶原支架1染色。因此,使用样品染色只是作为模范地执行收获8 h,全都是负面的,除了1弱阳性样本的机枪兵我组。

与胶原蛋白1 a2相反,胶原蛋白支架后3 a1水平更高的文化相比,单层控制时间点,这是更加明显,当支架受到机械刺激(我和敌人的机枪兵II组4 h)。然而,胶原蛋白的变化(图3 a1表达相对较高3)。免疫组织化学染色原骨胶原3没有进一步透露独特的差异。虽然大多数样本没有或很弱的染色,个别样品染色阳性(3/6机枪兵我小组4 h;3/6在静态组24小时;1/6或2/6在所有其他组)但是没有可识别的模式对染色强度和刺激政权(图2)。

decorin独特的基因表达的变化被发现,在所有脚手架文化表达水平升高(静态,敌人,敌人II)与单层控制在所有时间点相比,无论机械刺激(在4和24小时)。此外,decorin所有支架组表达水平随着时间的推移进一步增加。8 h,虽然中间表达水平已经高于4 h,高组内差异明显。然而,随着时间的增加成为了敌人清单我组相比decorin水平4 h和24小时()(图3)。

tenascin-C之间没有发现显著差异基因表达水平在不同的组。然而,表达支架组随着时间的增加。在4 h tenascin-C表达式中所有脚手架文化组低于单层控制,它是略高在所有脚手架文化团体在24 h,增加最快的机枪兵我组观察到8 h (而4 h)(图3)。

随着时间的推移Scleraxis表达式还显示微分模式。4 h,表达水平在脚手架文化组相似但略有上升,相比单层控制水平却下降到低于单层控制在8 h。然而,在24 h, upregulation可以观察到,脚手架文化团体表达scleraxis上级比单层的控制。脚手架文化群体,机枪兵我组在各个时间点上均显示最高scleraxis表达式,这是重要的比单层细胞24小时()(图3)。

胶原蛋白2 a1并不表示在可检测水平,无论是在单层控制还是在任何支架组。然而,骨桥蛋白不仅可以在所有样本组但调节支架文化随着时间的推移越来越多的表达水平。观察到8 h,增长最快的是发现敌人我组,但价值观相似的所有支架组24小时。骨桥蛋白表达的差异相比,单层细胞重要的静态和机枪兵II组4 h,对静态和机枪兵我在8 h组,所有脚手架文化团体在24小时()(图3)。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们调查的影响细胞外肌腱矩阵和循环拉伸,结合在一个新的体外模型系统中,在tenogenic脂肪MSC的命运。获得的数据表明,这些关键刺激促进tenogenic感应和肌腱矩阵合成的MSC在很短的时间内。

脂肪组织被用于MSC恢复,因为它通常被认为是一个非常有前途的祖细胞来源(35)和脂肪MSC以前发现显示肌腱矩阵组件的基本表达高于MSC从其他来源(8]。马组织被用作马是最有经验的大型动物模型存在对肌腱病理生理学(1)以及MSC特点和MSC-based肌腱治疗(36]。此外,所有与MSC的每个实验6供体动物,没有细胞池。这可能是相对较高的原因不同的实验组,每组中发现的基因表达的变化。,在某种程度上,这些差异阻碍了结果的重要性,他们代表了自然的生物变异在人类存在的。

脱细胞肌腱矩阵被选为支架作为他们最好的代表自然肌腱组件和架构,详细。虽然这种方法导致有趣的数据,应该承认,合成材料可以获得有利的关于再现性支架的设计和数据使用脚手架。此外,对于进一步发展的体外模型,系统地使用合成支架反映细胞外肌腱矩阵的选择方面可能的高相关性来确定最相关的刺激。比较方法使用细胞外基质合成支架的同时可以因此获得更多的详细信息是有用的。

机械刺激机制是基于我们自己的初步实验,以前的出版物和康复期间遇到了体内的条件。应用1赫兹的频率大致匹配的频率自然运动和使用在几个以前的研究(22- - - - - -24,28,37]。相比之下,应变的大小之间的应用大大不同研究报道之前,从1%11)到10% (21,22,26,37]。当不同的应变大小应用在相同的研究中,高震级导致增加肌腱标记表达式(23,25,28]。另一方面,适度的压力大小2.5%的改进的生物力学属性构造比更高的压力(26)和更可行的适用于当前的研究中使用的支架没有引发损伤。此外,众所周知,体内,马表面数字屈肌肌腱,最好是肌腱与人类的跟腱,经历大约2%的菌株走(38]。在此基础上,我们选择应用菌株2%大小的实验。此外,机械刺激的持续时间及其潜在的重复在随后的日子变量可能会影响结果,是设置在不同方面不同的先前的研究[10,21- - - - - -23,28,39]。在初步实验中,我们发现,拉伸为60分钟,应用没有先前的适应时间短,导致细胞死亡。延伸较短的初始和增加后续间隔显示对细胞生存能力影响不大,尽管细胞生存仍然下降相比静态文化。因此,两个不同的刺激机制与增加压力/休息时间被应用在当前的研究中。

对细胞生存能力,应该承认,不仅机械刺激,而且脚手架文化显示出一些负面影响。可能并不是所有的种子细胞能够迅速适应新环境。在这种情况下,第一个适应期后,细胞可能仍在更长时间的可行性。然而,它仍然被排除在外,矩阵改变由于去细胞或剩余去细胞代理负责细胞毒性效应(40]。然而,广泛的洗涤步骤包含在本研究中使用的去细胞协议减少残留,和我们以前的工作证明好cytocompatibility目前的支架在14天(29日]。

我们进一步决定只适用一次刺激制度和执行评估/拉伸后的第一个24小时。这使我们监测早期基因表达变化的潜在tenogenic诱导分化后不久当结合机械和肌腱矩阵刺激首次在此设置。当前的方法相反,长或反复拉伸,2或3周应用在大多数其他研究关注tenogenic分化(10,11,23- - - - - -26,39),24小时后刺激成为第一个评估时间点在只有几11,24]。

用描述的方法,我们发现重大scaffold-induced细胞排列的变化以及肌腱的基因表达标记。关于后者,有统一的趋势,短期机械刺激(机枪兵我)增强效果的支架,可以观察到持续对大多数基因研究。此外,尤其是scleraxis tenascin-C,非常有趣的时间表达水平的变化很明显在拉伸后的第一个24小时。

基因表达的胶原蛋白保持相对恒定的调查时间点,胶原蛋白1 a2表达下调和胶原蛋白3 a1在调节所有脚手架的文化群体。此外,胶原蛋白3 a1基因表达水平高于胶原蛋白1 a2水平在所有组、各时间点(数据没有显示)。原骨胶原组织化学染色显示没有独特的蛋白质水平组之间的区别,可能由于早期评估时间点,但反映了较高的胶原蛋白的表达3相比,胶原蛋白1。一方面,胶原蛋白1的差别scaffold-induced对这些基因可能是由于大量的蛋白质在脚手架存在。然而,结果表明,胶原蛋白1水平增加7天后文化在肌腱矩阵(16]。胶原蛋白1是调节循环拉伸在第七天,但是,对应于当前的发现,它最初表达下调,这是明显的在第一天和第三天24]。在相同的研究中,胶原蛋白3表达式显示一个类似的趋势,但增加速度(24]。因此,目前的研究结果支持先前的研究,实际上可能反映体内腱愈合早期阶段的情况,在胶原蛋白3是第一个合成取代损坏肌腱矩阵,紧随其后的是胶原蛋白1 (1]。

最主要的基因表达的变化观察decorin,大力增加在所有支架组。基因表达的变化似乎是由支架,没有明确的额外的拉伸效果。有趣的是,未发现decorin表达变化后文化poly-L-lactide或胶原蛋白凝胶支架,有或没有机械刺激(23,24]。这表明,地形和自然肌腱矩阵提供的生化信号可能诱发decorin表达式的一个关键组件。此外,decorin是调节在当前实验设置,模仿自然肌腱环境,支持假设decorin在MSC-based肌腱治疗可能起到至关重要的作用,可能会导致一种改进的矩阵结构。

Tenascin-C scleraxis显示,不同的基因表达水平在不同的时间点,说明随着时间的推移他们的监管。有趣的是,初始下降后,观察到4 h为scleraxis tenascin-C和8 h,增加两个基因的表达都明显在拉伸后24小时,显然被支架诱导刺激和增强的机械刺激。对应于这些结果,tenascin-C表达式被发现增加了机械刺激虽然不是早在第一天(21- - - - - -23]。不影响tenascin-C表达了在使用粉肌腱矩阵(16),可能由于缺乏地形的线索。Scleraxis调节时使用胶原蛋白凝胶支架和循环荷载进一步增强,支持当前研究的结果(41]。同样,这是表明scleraxis被胶原凝胶支架调节文化和循环荷载支持维护scleraxis表达式(7天24]。然而,在相同的研究中,scleraxis表达式没有进一步增加了机械刺激(24]。监管scleraxis表达机械刺激后不久没有描述到目前为止。目前的结果表明,即使短暂而温和的机械刺激结合使用合适的支架材料诱发scleraxis和tenascin-C upregulation在24 h。这表明快速感应tenogenic分化,这将可能进一步调节细胞外基质的合成。

胶原蛋白2 a1基因表达无法检测到的样本,但在所有支架组骨桥蛋白表达增加。增加循环轴向拉伸诱导表达osteogenesis-related标记描述之前(27,28,30.]。目前的发现表明,使用肌腱矩阵脚手架不阻止这种效应;因此,应用细胞成骨分化的可能仍然是一个严重的风险在肌腱细胞疗法。然而,尽管这些体外的数据不应该被忽视,没有证据表明钙化在MSC-treated肌腱体内发现了马渊源者(42]。

基于知识后早期tenogenic感应到目前为止,在我们的模型系统中,获得进一步的研究包括重复应用机械刺激和更长的潜伏期会表示。有趣的是,研究中使用的是当前一个非常类似的方法,结合对脱细胞肌腱细胞培养支架和机械刺激,是最近发表(39,43]。这里,执行机械刺激在8或10天,直到样本收获;因此,本研究的结果添加发布的这些数据很好。Youngstrom等人发现scleraxis基因表达水平的增加,胶原蛋白1和decorin但胶原蛋白表达降低3使用刺激政权应变为3%时,被改进的生物力学属性(陪同39]。考虑Youngstrom et al。和我们的研究结果与此同时,它可以假定scleraxis和decorin表达水平不仅是早期升高,但可以保持所使用的模型系统。相比之下,对于胶原蛋白表达不同的结果,很可能由于Youngstrom孵化时间越长和后评估等的研究。因此,相应的胶原蛋白表达谱的变化可能会在第一周的tenogenic分化。

5。结论

在当前的研究中获得的数据表明,细胞外肌腱矩阵和温和的循环轴向拉伸促进tenogenic MSC分化和肌腱矩阵合成。此外,改变细胞命运似乎主要由脱细胞肌腱支架和在短时间内明显。

使用的模型系统模仿的重要方面条件后遇到的MSC intratendinous应用程序。因此,当前的结果支持假设的有益作用MSC在屈肌腱治疗可以介导细胞替代和矩阵重构。然而,疾病建模应该改进现有的模型系统的基础上,为了了解祖细胞的命运是在病理条件下指示。

相互竞争的利益

作者认为不存在任何潜在的利益冲突有关的出版。

确认

作者承认博士斯蒂芬·施万(TRM莱比锡、德国)和Rainer波姆(Bose GmbH,德国)机械评估支架和Friedbert Gellermann(技术研究所化学、莱布尼兹汉诺威大学,德国)为他的生物反应器的发展期间的大力支持。本文中给出的工作之所以成为可能,是因为从德国联邦教育和研究的资助(BMBF 1315883)和撒克逊科技部美术(SMWK)和由德国研究基金会资助(DFG布鲁里溃疡3110/1)。初步实验Mehl-Muelhens基金会和资助的服饰业。任何人& Georg布鲁斯的基础。

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