急性低氧应激影响迁移机械的组织啊₂适应脂肪基质细胞

文摘

间充质基质细胞(干细胞)的能力(msc)动员从当地仓库对受伤的网站和参与组织修复使这些细胞有希望的候选细胞疗法。生理啊₂紧张的MSC利基体内大约是4 - 7%。然而,大多数体外研究MSC执行机能活动的20%₂。因此,本研究关注短期低氧应激的影响(0.1%啊₂,24 h)脂肪tissue-derived MSC能动性在约O₂的水平。未发现重大整合素表达的变化短期低氧后压力。然而,阿₂剥夺了波形蛋白分解和肌动蛋白聚合单元刚度增加。此外,低氧诱导的差别,对这些压力ACTR3、DSTN MACF1、MID1 MYPT1, NCK1, ROCK1 TIAM1,WASF1表达式,所涉及的产品是已知的前缘形成和细胞易位。这些变化是伴随着目标的衰减和不属预定目标的迁移msc短期低氧暴露后,见划痕和transwell迁移化验。这些结果表明,急性低氧压力可以调节MSC功能在原有环境,防止他们动员受伤的网站。

1。介绍

多能间充质基质细胞(干细胞)(msc)被定义为成人附着nonhaematopoietic前体能够分化成多种血统(成骨的脂肪形成的,和chondrogenic),表达CD73, CD90、CD105,和缺乏CD11b的表达,CD14、CD34、CD45 [1]。因为他们的许多独特的功能,这些细胞是细胞疗法有吸引力的候选人。在过去十年的研究显示,至少有一部分的msc的血管周的起源(2- - - - - -4),可以从许多孤立的组织(如骨髓、脂肪组织和脐血)(5]。脂肪组织是目前被认为最丰富的和可访问的成人msc。

大多数体外MSC研究空气气氛中执行95%(20%啊₂),而生理O₂水平在他们体内利基大约是4 - 7% (6,7)和严重缺氧损伤领域的特点是O(少于1%₂)[8]。此外,大量的数据表明,O₂张力是一个最重要的监管机构MSC机能活动的9,10]。特别是,我们和其他研究人员已经表明,msc的永久性扩张下“physioxia”(约O₂值)刺激增殖活动,维护msc在未分化状态,减少他们对凋亡刺激(11- - - - - -14]。这些变化都伴随着对糖酵解能量代谢的转变15)和upregulation关键基因(即“具备干细胞”。、Oct3/4 Sox2, Nanog) (13]。因此,msc永久培养环境下的反应(20%)和生理(5%)₂不同因素(低氧应激尤其是)可能发生显著的变化。

最重要的MSC的特点之一是能够从他们的组织动员仓库和迁移到区域的组织损伤参与炎症反应的调控16,17和组织修复18,19]。特别是,它已被证明,msc是网站的炎症和损伤的特点是急性缺氧和高浓度的促炎细胞因子(20.]。尽管迁移领域的损害对MSC-mediated修复和改造至关重要,我们才刚刚开始理解机制,以及低的影响₂在有针对性的MSC移植仍缺乏研究。Raheja等人表明,缺氧是一项重要的监管机构的MSC招聘(21]。此外,HIF-1的稳定α,关键转录因子调节低氧诱导信号转导,发现修改RhoA活动(22,23]。因此,缺氧可能是最重要的一个监管机构的MSC能动性和导航,为组织再生和细胞疗法是必不可少的。然而,只有少数的研究集中在O的影响₂张力在MSC迁移和数据对缺氧的影响MSC能动性是很有争议22,24,25]。

本研究旨在揭示ASC动员的机制减少损伤和再生组织的网站。为了达到这个目标,我们检查了短期低氧应激的影响(0.1%啊₂)的迁移脂肪tissue-derived间充质基质细胞(对asc)永久培养下生理O₂(5%啊₂)。

2。材料和方法

2.1。细胞隔离和文化

脂肪组织样本来自病人的腹部皮下仓库接受dermolipectomy Souz多学科诊所(莫斯科,俄罗斯),作为一个科学协议的一部分。所有程序都是研究所的生物医学伦理委员会批准的生物医学问题,俄罗斯科学院(俄罗斯的生理部分生物伦理委员会,俄罗斯联邦为联合国教科文组织全国委员会,允许# 314 /МCK / 09/03/13)。样本反复冲洗在无菌磷酸盐(PBS)去除污染碎片和红细胞。然后,脂肪组织是机械碎,间质血管部分细胞的隔离了如前所述[26]。短暂,剁碎组织块酶消化0.075%(相当于40.7 U /毫升)胶原酶I型(美国Sigma-Aldrich)与搅拌30分钟37°C。随后,酶与同等容积的灭活αmem(美国生活技术Gibco)含10%胎牛血清的边后卫。然后组织瓦解了移液和过滤通过上下100年μ尼龙网。包含对asc,间质血管分数是通过离心法得到样品在500 g×10分钟。颗粒是resuspended,细胞接种αmem补充10%的边后卫,50 U /毫升青霉素,50μg / mL链霉素(完全培养基)低于5%₂在multigas有限公司₂孵化器(三洋、日本)。

电镀后24小时,细胞被小心翼翼地清洗PBS移除不依从细胞和碎片。根据联合声明IFATS ISCT,贴壁细胞对asc [27),这些细胞被扩大,直到他们达到90% confluency。然后,细胞收获和分析ASC表面抗原的表达和multilineage分化潜力(见下文)。然后,细胞密度的山肩3000细胞/厘米²并保持在5%以下₂在αmem补充如上表示。对asc从第二到第四章节和融合在80 - 90%被用于实验。低氧应激诱导24 h在低氧室(美国干细胞技术),O₂由O浓度控制₂传感器和维持在0.1%。

人类外周血单核细胞从血液样本收集分离从健康的人给了他们的书面知情同意。细胞用密度梯度离心法分离histopaque - 1077(σ,美国)28rpmi - 1640年)和维护(美国生活技术Gibco)补充5% heat-inactivated的边后卫,50 U /毫升青霉素,50μ克/毫升链霉素。单核细胞被刺激了10μg / mL植物凝集素PHA-P (Sigma-Aldrich)。

低温贮藏人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)提供的样本Cryocenter脐带血银行(莫斯科,俄罗斯),作为一个科学协议的一部分。199年细胞培养介质(Gibco,生活技术,美国)补充10%的边后卫,200μg / mL内皮细胞生长因子(Sigma-Aldrich), 2毫米谷氨酰胺(Gibco,生活技术,美国),1毫米丙酮酸钠(Gibco,生活技术,美国),50 U /毫升青霉素,50μO g / mL链霉素在20%₂在一个公司₂孵化器(三洋、日本)。促炎激活内皮细胞是肿瘤坏死因子诱导的α(10 ng / mL)(美国Sigma-Aldrich)前24小时共培养对asc。

2.2。对asc Immunophenotyping的

细胞表面抗原被流式细胞术分析使用BD Accuri C6血细胞计数器(美国BD生物科学)。细胞融合在80 - 90%被trypsinisation收获,用PBS洗净,与鼠单克隆抗体主要孵化。最小的细胞数量是10⁵细胞/测试。的抗体用于本研究对asc描述是基于最小表面标记面板(CD45, CD73 CD90、和CD105)提出的IFATS和ISCT [1,27]。CD54 / CD106(美国BD生物科学)和CD25 / CD69(贝克曼库尔特、法国)用作HUVECs和淋巴细胞活化标记,分别。

2.3。在体外分化分析

对asc的第二到四通道融合增长直到80 - 90%。然后,细胞培养与特定的脂肪形成的一个完整的生长培养基补充(1μ地塞米松,0.5毫米IBMX 10μg / mL胰岛素,和100年μ吲哚美辛)或成骨的(0.2毫米抗坏血酸2-phosphate,甘油2-phosphate 10毫米,和0.1μ地塞米松)电感器(间充质干细胞脂肪形成和骨生成包、微孔、美国)。这些细胞被固定为4%甲醛在PBS经过7天的脂肪形成的或成骨分化的21天。脂肪形成的分化是由与0.5%油红O染色细胞内脂滴的解决方案。成骨分化被茜素红S染色确定矿化矩阵(美国Sigma-Aldrich)。

2.4。细胞增殖实验

评价细胞增殖、组织O₂适应低氧应激前后对asc是镀的初始密度3000细胞/厘米²。五个随机选择的图像视图字段(0.77毫米²字段区域)都被用Eclipse Ti-U尼康显微镜(尼康、德国)0,电镀后24和96 h。这些细胞被使用图像分析软件计算SigmaScan Pro 5.0 (SPSS Inc .)、美国)。人口翻倍(PD)倍计算 参见[29日]。

2.5。细胞生存能力分析

细胞生存能力分析使用一个膜联蛋白V-FITC /π工具包(Immunotech、法国)。简单地说,对asc培养在5% O₂和低氧应激(24小时)被trypsinisation收获和孵化与膜联蛋白V-fluorescein异硫氰酸酯(FITC)和propidium碘(π)15分钟在黑暗中在4°C根据制造商的指示。然后,细胞分析使用BD Accuri C6血细胞计数器。可行的细胞被定义为那些消极AnnexinV-FITC和PI染色,凋亡细胞被定义为那些积极的膜联蛋白V-FITC PI染色和消极,和坏死细胞被定义为那些PI染色阳性。

2.6。检测活性氧(ROS),也没有

的ROS,没有检测到使用CM-H2DCFDA (H2DCFDA chloromethyl导数)(美国分子探针Inc .)和二乙酸DAF-FM(美国分子探针Inc .)根据制造商的指示。简单地说,在80 - 90%融合对asc孵化文化板块10μM CM-H2DCFDA或2μM DAF-FM乙酰乙酸盐为20分钟37°C下5%或0.1%₂。与PBS洗涤后,细胞被捕获并分析流式细胞术(海里)。细胞内ROS水平,没有被测量评估chloromethyl-dichlorofluorescein (chloromethyl-DCF)或苯并三唑荧光二乙酸DAF-FM CM-H2DCFDA或亚硝基化氧化后,分别。

2.7。体外愈合试验

不属预定目标的ASC迁移评估在单层细胞的细胞密度10⁴细胞每厘米²使用体外“刮”的测定[30.]。一个支流单层挠了无菌吸管提示创建一个“伤口”大约0.8 - -1.0毫米宽。然后,培养基所取代αmem补充10%的边后卫去除细胞碎片。划痕检测都是表现在六个复制。估计伤口闭合,串行数字图像捕获用Eclipse Ti-U尼康显微镜(尼康、德国)后,在特定的时间间隔(3、6、9和24 h)之后。图像进行分析使用NIS-Elements软件(尼康、德国)测量的宽度划痕之前标记点每个培养皿(5)沿其长度。迁移区域计算的初始和最终的伤口广场之间的区别。

2.8。Transwell迁移分析

transwell试验评估不仅迁徙活动也趋药性的影响。因此,在本研究中,移民进行了化验24-well transwell板块(美国康宁合演)用聚碳酸酯膜8μm毛孔(美国康宁合演)。促炎激活内皮细胞和PBMCs ASC迁移的目标。对asc的密度5×10⁴细胞在150 /毫升μL的介质被安置在参议院transwell组装。众议院中600μL phytohemagglutinin-activated单核的悬架(5×10⁵细胞/毫升)或层的肿瘤坏死因子α激活内皮细胞。孵化24小时后,膜的上表面轻轻刮去除nonmigrating对asc和PBS洗。膜固定在4%多聚甲醛15分钟和溴化乙锭染色1米(美国Sigma-Aldrich) 10分钟。迁移细胞的数量是由计算10随机视图字段/使用Eclipse Ti-U尼康显微镜。

2.9。荧光染色法

对asc是生长在盖玻片。immunofluorescent和phalloidin染色,细胞被固定为4%甲醛在PBS 15分钟和permeabilised 0.1% Triton x - 100 10分钟。然后,细胞与PBS洗3次,孵化与主anti-vimentin鼠单克隆抗体(美国微孔Chemicon)或anti-tubulin鼠单克隆抗体(美国圣克鲁斯生物技术)1 h在37°C。随后,罗丹明phalloidin(美国生活技术分子探针)和Alexa萤石488 -共轭anti-mouse免疫球蛋白二次抗体(分子探针,生活技术,美国)添加1 h。然后,样本清洗和安装与DAPI Fluoroshield (Sigma-Aldrich)。图片是使用一个LSM 780年收购(卡尔蔡司、从德国)共焦显微镜。

2.10。原子力显微镜

原子力显微镜是研究细胞力学的一个有用的工具31日]。在这项研究中,细胞横向刚度测量使用解决P47-Pro仪器(NT-MDT,莫斯科,俄罗斯)如前所述[32]。简而言之,对asc是生长在圆形玻璃盖玻片(12毫米直径)细胞培养(美国康宁公司)。然后,盖玻片ASC液体层被安装到细胞的原子力显微镜调节表。Force-distance曲线得到联系方式用软硅悬臂。悬臂弹簧常数(Microlever公园科学仪器,美国)和尖端曲率半径是0.01 N / m和10 nm,分别。实际的压痕深度和力量应用计算使用以下公式:,,在那里是实际的压痕深度(米)是实际的力量应用于细胞(N),然后呢悬臂刚度系数。压痕深度150海里,作用力决心和单元刚度的变化估计使用以下公式:。结果处理使用MATLAB 6.5软件开发尤其是对这项研究。

2.11。蛋白质提取和免疫印迹

细胞细胞溶解,溶解缓冲区包含63毫米Tris-HCl、10%甘油、5%β巯基乙醇、2% SDS (pH值6.8)和停止蛋白酶抑制剂鸡尾酒(美国ThermoFisher科学)冰。蛋白质的溶解产物浓度测量使用Nanodrop 2000 c (ThermoFisher科学、美国),和等量的蛋白质被加载到井的SDS-polyacrylamide凝胶电泳(页面)凝胶(10%)。然后,蛋白质是由sds - page分离和转移到硝化纤维膜根据标准协议在一夜之间90毫安(+ 4°C)。特定蛋白质的检测,以下中小学使用抗体:反β肌动蛋白(1:200),反ϒ肌动蛋白(1:200),反β微管蛋白(1:200),anti-vinculin(1: 50)(美国圣克鲁斯生物技术)和anti-mouse IgG-biotin抗体(1:2000)(美国Sigma-Aldrich)。与二次抗体孵化后,所有膜处理streptavidin-peroxidase(1: 4000)(美国Sigma-Aldrich)。特定的蛋白质乐队被发现使用3、3′-diaminobenzidine(美国Sigma-Aldrich)和分析ImageJ软件。蛋白质含量估计测密度术和正常化对微管蛋白作为加载控制。

2.12。定量rt - pcr分析

252个基因的表达缺氧后使用细胞骨架监管者RT压力进行了分析²分析器PCR数组,PI3K-AKT信号通路RT²分析器PCR数组,MAP激酶信号通路RT²分析器PCR数组(美国试剂盒)。

评估基因表达,总RNA提取与QIAzol试剂(美国试剂盒)和苯酚/氯仿技术纯化。反转录进行使用QuantiTect逆转录工具包(美国试剂盒)根据制造商的协议。互补脱氧核糖核酸与RT混合²SYBR绿/火箭PCR大师(美国试剂盒)和混合添加到96孔板。PCR进行使用Mx300P系统(美国Stratagene),使用RT和获得的数据进行分析²分析器PCR数组数据分析版本。3.5软件(http://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php)。五个看家基因的表达水平(ACTB,B2M,GAPDH,产生HPRT,RPLP0)包含在数组是异形。根据他们的稳定表达在低氧的情况下,B2M,产生HPRT,RPLP0被选为参考正常化的目标基因表达的基因。正常基因表达被计算方法。基于学生的计算值以及复制的每个基因值的控制和治疗组。

2.13。统计分析

所有数据从3 - 5个独立的实验和计算平均值±标准偏差表示。分析组的差异是由Mann-Whitney独立样本使用SPSS 14.0软件进行测试。被认为是在统计意义。

3所示。结果

3.1。描述组织的啊₂对asc适应在不同O₂条件

随着阿₂水平通常用于细胞培养(20%啊₂)没有反映生理条件,分析了急性低氧应激的影响(0.1%啊₂对asc 24 h)的特征保持在5%以下₂。

细胞的形态学永久培养physioxia和急性缺氧暴露在了类似(图1(a))。流仪对asc的分析表明,低氧压力没有改变基质的表达CD标记,并对asc CD73两组被发现是积极的(%),CD90 (%)和CD105 (%)和消极CD45 (%)(图1(b))。评价细胞生长的ASC组并没有发现组间差异在细胞数量增加和人口倍增时间(图1(c)),这表明短期低氧压力并不影响ASC体外增殖活动。此外,急性低氧应激影响成骨的和脂肪形成的对asc(数据的潜力1(d)和1(e))。

3.2。细胞内ROS水平和ASC短期低氧应激后生存能力

我们检查了细胞内ROS和水平对asc短期低氧应激后使用CM-H2DCFDA和二乙酸DAF-FM,分别因为ROS可能hypoxia-mediated信号转导的监管机构(33,34]。短期低氧暴露被证明导致细胞内ROS增加1.5倍,而没有生产这些条件下保持不变(数字2(一个)和2 (b))。与此同时,对asc的生存能力培养在5% O₂高(%),没有发现细胞死亡诱导急性缺氧后压力(%)(图2 (c))。

3.3。短期低氧压力减弱“愈合”潜在的和有针对性的对asc的迁移

不属预定目标的ASC迁移被抓(愈合)测定分析。评价急性低氧应激的影响,细胞培养下physioxia(5%啊₂)暴露在短期O₂剥夺(0.1%啊₂24 h),紧随其后的是抓的单层(图3(一个))。伤口关闭估计3,6,9岁和24 h后刮(图3 (b))。短期低氧应激了导致ASC能动性和愈合的潜力下降1.5倍(图3 (c))。

有针对性的ASC迁移在缺氧条件下分析了使用修改后的Boyden室迁移试验与Transwell®文化板块。我们发现低氧应激显著影响组织的迁移O₂适应对asc激活内皮细胞和淋巴细胞。迁移细胞的数量在急性低氧暴露超过两倍的数量对asc迁移为5%₂(图3 (d))。这些结果表明,低氧应激不仅降低细胞活性,而且对asc的能力应对趋化现象的刺激。

3.4。低氧应激导致改变f -肌动蛋白和波形蛋白,但不是微管蛋白结构

细胞骨架组织是最重要的因素之一,决定细胞的能动性。因此,我们研究了缺氧对细胞的影响纤维组织。急性低氧应激了导致一个明显的肌动蛋白细胞骨架的变化和中间丝结构但没有显著影响微管(图的结构4(a))。physioxia下,中间纤维形成的对asc鸡窝状结构,而缺氧预处理提升波形蛋白解聚(图4(a))。对asc稀疏,随机排列的肌动蛋白纤维是典型的培养在5%以下₂,而低氧应激刺激肌动蛋白聚合,通过增厚,增加平行的微纤维的数量和构成的组件(骨料)(图的形成4(a))。此外,我们发现对asc短期接触0.1% O₂膜结合的数量增加,但不是全部,β- - -γ肌动蛋白,不影响vinculin的数量和β微管蛋白(图4(b))。

3.5。急性低氧暴露提高ASC刚度

基于这样的观察:急性缺氧影响ASC迁徙潜力和细胞骨架组织,我们使用原子力显微镜评估低氧压力对细胞刚度的影响。我们发现短期暴露对asc O的0.1%₂导致了他们的刚度(图1.5倍增加5)。

3.6。急性缺氧对粘附分子表达的影响

粘附分子的表达是另一个因素调节的功能属性对asc和迁移能力。在这项研究中,我们使用流式细胞术分析短期低氧的影响强调CD29(整合素的表达β1),CD44 (HCAM) CD49d(整合素α4),CD49e(整合素α5),CD51(整合素αV) CD61(整合素β3),CD184 (CXCR4)。所有对asc培养为5%₂是积极CD29、CD44、CD51 CD61(图6),而只有部分细胞阳性CD49d, CD49e, CD184。我们发现短期暴露对asc O的0.1%₂HCAM和趋化因子受体CXCR4表达的影响。特别是,缺氧不仅压力减少的百分比细胞表达标记(图6 (b)),但趋化因子受体CXCR4的表达本身,因为减少平均荧光强度(图所示6 (c))。此外,急性低氧应激障碍CD44表达,而没有发现重大的整合素表达的变化对asc physioxia-cultured和hypoxia-exposed之间。

3.7。表达一种蛋白激酶、MAPK和Cytoskeleton-Related急性低氧胁迫下的基因

未发现基因表达的戏剧性的变化在短期ASC暴露于0.1%₂。然而,36 252分析基因的表达被证明有1.5倍以上急性低氧压力(图7和表1)。与此同时,七个基因的表达(APC、CCNA1 FASLG”丛书,GJA1 MAP2K6,MID1)超过2倍的变化。七只基因(”丛书、CDKN2D MAP2K1、MAPK7 MAPK13基因,SFN)的特点是增加他们的表达,而其他基因的表达减少。分析基因表达的细胞骨架监管机构表示,短期暴露对asc O的0.1%₂表达下调的表达ACTR3、DSTN MACF1、MID1 MYPT1, NCK1, ROCK1, TIAM1,和WASF1,的产品代表了重要的监管机构β肌动蛋白解聚和板状伪足的形成。的差别,对这些p53和upregulation应激SFN和p38-delta表达式发现这里可能导致ASC急性低氧胁迫下生存。

一个交互式网络显示更改移民相关基因的表达在低氧的压力是呈现在图8。这个交互式网络建成使用字符串9.1数据库和展示了预测蛋白质相互作用由移民相关编码基因变量表达式。我们假设MAPK的组件——和PI3K / mTOR / PTEN-signalling瀑布(安全系数、MAPK7 MAPK13, MAP2K1, mTOR, PI3CA, PTEN、RHEB, RPS6KB1,和TP53)在细胞运动中起着重要的作用[35,36),代表这个交互式网络的功能模块。网络的其他组件(ACTR3、DSTN MACF1, MID1, MYPT1, NKC1, TIAM1,和WASF1)结构蛋白或效应器,但不细胞功能的主要监管机构,和他们的蛋白质相互作用知之甚少。因此,只有少数已知这些蛋白质和MAPK的主要网络之间的联系,Akt-signalling分子。

4所示。讨论

在目前的研究中,急性低氧压力显示显著损害组织的迁移能力₂对asc改编。这是伴随着肌动蛋白和波形蛋白重组的差别,对这些PI3K - MAPK和cytoskeleton-related基因。

有越来越多的报道比较功能的细胞培养在不同O₂浓度。毫无疑问,O₂培养基中控制细胞的机能活动的一个重要因素。O₂从1到10%浓度的变化而变化(physioxia)在不同的组织7]。在这方面,我们和许多其他研究者认为标准细胞培养条件(20%啊₂轻度氧过多),以增加抗氧化防御系统酶的活性(37,38]。

不同病理条件(缺血、炎症、肿瘤、组织损伤)是当地减少组织O紧随其后₂分压到0.1% (39]。msc是组织修复的关键球员之一。因此,永久缺氧和急性低氧应激的影响msc的功能特点已被广泛研究的焦点(15,25,40,41]。然而,细胞反应有关的出版物缺氧状态是相互矛盾的。大部分的差异可以解释为不同O₂浓度、曝光时间和细胞来源。一般来说,越来越多的证据表明轻度缺氧作为一个强有力的监管机构的各种干细胞类型(9,42]。O₂张力超过1%作为增殖刺激对于大多数细胞类型和防止细胞周期阻滞,而缺氧和非常低的O₂级别(不到1%)诱导MSC细胞应激和凋亡12,13,43,44]。因此,低氧水平对干细胞的影响是广泛的,取决于缺氧的严重性。

在这里,我们发现,短期低氧暴露并不影响ASC最小标准参数和生存能力,但它大大削弱针对性和不属预定目标的迁移的组织啊₂对asc改编。高细胞缺氧后生存能力的维护压力可以解释为至少两个我们的观察。首先,增加细胞内ROS水平为0.1%₂可以提高ASC抗氧化系统的活性。以前,我们证明了轻微的氧化应激对asc其次是超氧化物歧化酶活性的增加培养持续在5%以下₂(38,45]。其次,以上的差别,对这些TP53(p53),FASLG(Fas配体),APC基因表达和upregulationSFN(14-3-3σ)表达式中发现这项研究应该阻止凋亡事件。研究胎儿和骨髓msc、Fas配体被证明中扮演重要角色的规定不仅免疫活性的干细胞凋亡[46,47]。尽管数据缺氧对MSC基因调控的影响,研究其他细胞(HCT116)表明,14-3-3σ(编码SFNp53诱导基因)G₂/ M核对基准点蛋白质,增强细胞的生存压力下的巴克斯封存(48]。HT-29细胞系,APC的诱导表达,结果发现凋亡细胞的数量增加10倍,因为半胱天冬酶活动的增加(49,50]。

细胞骨架组织细胞的主要监管机构的能动性。以前,发现细胞活性与细胞刚度(51),主要特点控制细胞刚度似乎f -肌动蛋白细胞骨架的52]。我们的数据表明,f -肌动蛋白和压力的稳定对asc纤维形成低氧胁迫下伴随着细胞刚度增加。这同意最近的研究,揭示了相关性低细胞刚度和高运动性/转移性肿瘤细胞的潜力[53,54]。这种现象可以从几个方面来解释。首先,高度能动的细胞(即。,cancer cells) are known to have decreased stress fibres, increased cortical actin, and more lamellipodia, which are much softer than stress fibres [55]。其次,细胞高度等的特点是低粘附基质和粘着斑营业额的比例高56]。根据我们的数据,我们假设低氧应激促进病灶粘连的稳定和粘着斑的形成斑块的压力在增加膜结合肌动蛋白纤维和结果。

MSC移植缺氧下管理机制仍然知之甚少,尽管骨髓间充质迁移到损伤领域的能力是一个关键参数确定这些细胞的潜在的用于细胞疗法。形成的“前沿”,基于肌动蛋白聚合Arp2/3由一个复杂的蛋白质复合体,DSTN, WASF, profilin, cofilin,和其他蛋白质,是定向细胞易位的第一步(57,58]。进一步发展活跃的边缘和转发单元易位可能只是胶结构的形成(焦复合物)在活跃的边缘地区,导致重组的肌动蛋白纤维网络,f -肌动蛋白组装形成和出现收缩张力所需细胞易位。小gtpaseρ家族(ρ,Rac, CDC42)中发挥核心作用的规定actin-binding蛋白质,细胞骨架动力学,和细胞活性(59]。大量研究表明HIF-1各种细胞类型α稳定RhoA活动有相当大的影响,这是紧随其后的是迁移活动的变化(22,23,60]。我们以前演示了HIF家族转录因子的表达变化组织O₂对asc改编后缺氧应激(45]。特别的差别具有统计学意义对这些HIF-1α和upregulationHIF-3α表达对asc发现低氧(1%后24 h O₂)接触。这些数据与其他群体的研究表明,激活HIF-1α在更早的时间点检测(4 - 8小时),然后HIF-1α消失了(61年]。在本研究中,我们未能发现低氧应激的转录的影响ρ,Rac,和CDC42基因。然而,观察到的数量和厚度增加应力纤维可能表明RhoA活动增加急性低氧胁迫下(0.1%啊₂),这与其他研究的结果是一致的(23,62年]。岩石(ρ激酶)是主要的ρ效应目标中间丝蛋白(59]。因此,我们建议,波形蛋白低氧应激下拆卸RhoA和岩石激活的结果。正如上面提到的,应力纤维形成不足以提供定向细胞易位,板状伪足的形成和“收缩”细胞仪是必需的。然而,我们在这个研究表明,ASC暴露于低啊₂结果的表达ACTR3、DSTN NCK1,和WASF1基因,actin-binding蛋白质参与活动的产品边缘形成(58,63年,64年]。的差别,对这些MACF1 MID1,和MYPT1基因的产物,参与肌动球蛋白复合体的形成提供所需的收缩张力易位的迁移细胞,检测。因此,我们假设ASC迁移活动的抑制缺氧胁迫与刚度增加,形成前缘,能力降低,降低收缩性的肌动球蛋白复合体的离解。

细胞的定向迁移(趋化性)是由趋化因子及其受体的相互作用激活信号级联导致细胞骨架重塑。许多研究表明SDF-1 CXCL12和PDGF-B主要化学引诱物调节MSC动员,贩卖,归航20.,65年,66年];他们的趋化因子受体CXCR4 (CD184)和PDGFR -β,分别。此外,众所周知,交互可能激活PDGFR——integrin-extracellular矩阵β在缺乏生长因子和刺激细胞迁移67年,68年]。在这项研究中,我们表明,缺氧压力降低的能力对asc迁移激活内皮细胞和外周血单核细胞。此外,我们没有发现的影响减少O₂浓度(0.1%)整合蛋白的表达,但表明短期ASC暴露在急性缺氧趋化因子受体CXCR4的表达减少,HCAM-1 (CD44)。许多研究已经证明了一个重要的角色在MSC趋化因子受体CXCR4动员和趋化作用,中和减少导航和移植MSC显著(69年- - - - - -71年]。我们假设一个减少的趋化因子受体CXCR4 (CD184)表达式是一个监管机制的组织啊₂适应目标ASC迁移缺氧胁迫。此外,趋化因子受体CXCR4 (CD184)表达减少可能导致减少网站的ASC动员受伤,可能扮演重要的角色在组织再生。此外,最近的研究已经证实透明质酸受体(CD44)的一个重要的角色在MSC移植的规定对损伤的面积(72年]。在这方面,我们可以假设观察到减少ASC趋化因子受体CXCR4和CD44-dependent趋化作用的能力。

我们所知,这是第一个结果来描述急性缺氧的影响压力的能动性msc永久培养下约O₂。缺氧抑制祖细胞迁移可能提供几个功能。首先,在MSC急性缺氧微环境表明局部缺血和组织vascularisation和修复的必要性。这个建议是间接地证实了我们之前的旁分泌活动数据tissue-adapted O₂对asc在急性缺氧。此外,我们表明,缺氧应激刺激分泌proangiogenic因素(从组织VEGF,引发)O₂对asc改编(45],它应该促进血管生成。上述结果与其他研究的结果,证实缺氧预处理促进MSC血管生成活动(41,73年]。其次,释放化学引诱物的细胞损伤领域创建一个趋药性的梯度,刺激MSC移植的血管周的利基市场向受伤的区域,它的特点是急性缺氧。也有可能抑制MSC移植急性缺氧对MSC的保护下推迟他们的迁移,直到O₂浓度与细胞的生存。进一步研究治疗增强血管生成和O₂交付可能会加速修复受损组织的调整过程和援助。

5。结论

在目前的研究中,我们已经表明,急性低氧压力变弱组织O₂适应ASC能动性和愈合的潜力。此外,对asc趋化现象的刺激的反应显著依赖于O₂微环境。组织的变化啊₂适应ASC运动性低氧胁迫下都伴随着细胞骨架重组,增加细胞刚度和减少HCAM和趋化因子受体CXCR4的表达,而不是整合素。我们的研究结果强调的重要性₂基质祖细胞功能调节的领域的缺血性组织损伤。然而,上述结果偏离“normoxia”下的数据获得msc(20%啊₂),它应该考虑当讨论MSC参与组织再生。进一步调节低氧诱导信号转导机制physioxic msc应该调查。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究受到了俄罗斯科学基金(批准号14-15-00693)。

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