建立人类神经祖细胞从人类诱导多能干细胞与多样化的组织起源

文摘

人类神经祖细胞(hNPCs)以前生成从数量有限的人类诱导多能干细胞(hiPSC)克隆。这里,21 hiPSC克隆来自人类皮肤成纤维细胞,脐带血细胞和外周血单核细胞分化神经感应方法,使用两个胚状体的身体(EB) formation-based方法和EB的形成方法使用双SMAD抑制剂(dSMADi)。我们的研究结果表明,扩展hNPCs可以从hiPSC克隆生成不同体细胞组织起源。老牌hNPCs展出中期/ hindbrain-type神经身份和统一的神经祖细胞基因的表达。

1。介绍

人类神经祖细胞(hNPCs),这是存在于胎儿和成人的神经组织,有潜力成为治疗有益治疗神经疾病如脊髓损伤或中风;然而,它在技术上是很难获得hNPCs从人类神经组织。人类胚胎干细胞的发展(为)1)和人类诱导多能干细胞(hiPSCs) [2,3极大地提高了再生医学的前景。我们现在能够获得无限hiPSCs从每个体细胞组织来源(4]。然而,hiPSC克隆展览变量分化倾向(5),类似于为(6]。

许多协议已报告的神经感应为/ hiPSCs。移植神经前体最初来源于为,受到自发形成胚状体的身体(EB),其次是神经玫瑰的选择(7]。EB-mediated神经玫瑰的形成不仅用于建立rosette-stage神经干细胞(R-NSCs)为(8),但也产生长期自我更新neuroepithelial-like茎(lt-NES)细胞为/ hiPSCs [9,10]。然而,这些方法的神经诱导效率取决于先天分化倾向hESC / hiPSC克隆(11]。使用一个策略基于神经违约模型,抑制剂的骨形态发生蛋白(BMP)信号通路,如‘诺金’或小分子Dorsomorphin,被用来直接分化为其向神经/ hiPSCs血统(12]。此外,Lefty-A或小分子SB431542可以用来抑制节点,转化生长因子(TGF)的一个成员β家庭导致内胚层、中胚层的命运选择,为促进神经感应。BMP拮抗剂和转化生长因子的结合β/苯丙酸诺龙/节点抑制剂已被用于加快神经感应为/ hiPSCs [11,13- - - - - -15]。建立一个可再生的EB-based方法,Eiraku等人被完全分离为/ hiPSCs SFEBq(血清培养EB-like骨料)在存在Rho-associated蛋白激酶(岩石)抑制剂,导致形成的均匀大小的EBs (16]。它也表明,神经前体细胞可以来源于为其生理氧含量(3 - 5%)17]。

神经诱导使用这些方法已经成功只有数量有限的hESC / hiPSC克隆。Koyanagi-Aoi等人最近报道了SFEBq-mediated诱导多巴胺能神经元为和hiPSCs来源于各种体细胞组织(18]。当前研究的目的是确定hNPCs是否可以来自任何hiPSC克隆无论其体细胞组织起源。我们评估21 hiPSC克隆来自人类皮肤成纤维细胞(HDFs, 13个克隆),脐带血(CB)细胞克隆(3)和外周血单核细胞(PBMN)克隆(5)使用一个EB formation-based方法(EBFM)和EB的形成方法,包括双SMAD抑制剂(dSMADi)。虽然有共识,SMAD抑制神经感应正如上面提到的,必须有很多方法之间的差异。因此,我们执行dSMADi方法,条件易于控制,使用两种类型的媒体和两种不同的含氧量。因此,之前报道神经感应方法扩展到四个条件。我们的数据表明,双重SMAD抑制可用于生成/中期hindbrain-type hNPCs hiPSCs不论体细胞组织起源。这些扩展hNPCs可能是一个有用的细胞来源再生医学研究和神经疾病的治疗。

2。材料和方法

2.1。hiPSCs文化

本研究进行了符合赫尔辛基宣言的原则,和使用hiPSC克隆大阪国立医院伦理委员会的批准(编号为110)和CiRA,京都大学。所有hiPSC克隆(表S1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/7235757)培养在CiRA丝裂霉素C-treated SNL馈线细胞在灵长类动物ES细胞介质(ReproCELL),直到~ 50%汇合的,然后运送到我们实验室在大阪国立医院。hiPSC克隆是对前两天神经诱导培养。

2.2。神经诱导hiPSCs

两个神经感应方法被用于这项研究:EBFM [19,20.)和EB的形成方法使用双SMAD抑制剂(dSMADi) [14,16]。每个hiPSC克隆神经感应同时使用这两种方法。

EBFM, hiPSCs服用10μM y - 27632(岩石抑制剂)1 h在37°C,然后分离使用1毫克/毫升胶原酶IV(技术)和浮动到gelatin-coated菜删除SNL馈线细胞。30分钟后,浮动EBs被转移到培养皿中含DMEM / F12淘汰赛(D6421,σ),20%血清替代(KSR,生活技术),0.1毫米不必要的氨基酸(NEAA,生活技术),2毫米谷酰胺(技术),0.1毫米2-Mercaptoethanol(我,生活技术),antibiotic-antimycotic(技术)和10μy - 27632(0)。第二天(第一天),介质取代5% KSR-containing媒介与媒介变化,进一步培养30天每两天。

dSMADi hiPSCs处理10μM y - 27632 1 h在37°C,然后分离胰蛋白酶/ EDTA生成单细胞悬浮体和悬浮在两种介质类型:KSR-based介质[DMEM / F12 KSR (D6421) 20%, 0.1毫米我,10μM SB - 431542(某人,σ),和2μM Dorsomorphin和光)(DSM, kouichi]和B27N2-based介质[DMEM / F12 (D8062)和15毫米玫瑰,B27 5%, 5% N2补充(N2,生活技术),10μ某人,2μM DSM, 10 ng / mL bFGF]。媒体都补充了30μy - 27632第一3天。完全分离的细胞被播种到超低附件96 -孔板(PrimeSurface®96 -嗯,住友电木)在9000个细胞/嗯,离心机在700转3分钟(quick-aggregation)和养殖有限公司5%₂孵化器O 5或20%₂。因此,dSMADi神经诱导进行了使用四个条件:KSR O / 20%₂O KSR / 5%₂B27N2/20% O₂和B27N2/5% O₂。14天的细胞培养每日更换一半的花中新鲜培养基。14天,骨料分离机械,在培养皿中培养有限公司5%₂孵化器与20%阿₂生成hNPCs的第一通道。Neurospheres生成第二通道的npc对Accutase完全分离细胞™(创新细胞技术),然后培养参与烧瓶内。如果hNPCs附加到文化船只在早期的段落,我们使用超低附件菜(PrimeSurface住友电木)建立hNPCs neurospheres。

2.3。维护hNPCs

在1×10 hNPCs被播种⁵细胞/毫升和培养作为浮动neurospheres hNPC介质[DMEM / F12 (D8062)和15毫米玫瑰,B27 2%, 20 ng / mL EGF (PeproTech), 20 ng / mL FGF2 (PeproTech), 10 ng / mL白血病抑制因子(微孔),和5μg / mL肝素(Sigma-Aldrich)]。

2.4。定量逆转录-聚合酶链反应(定量rt - pcr),

总RNA提取使用RNeasy MinElute清洁工具(试剂盒)和互补dna合成使用PrimeScript®RT大师混合(豆类Bio)根据制造商的规格。定量PCR分析使用gene-specific引物(表S4),执行权力SYBR®绿色PCR大师混合,和7300年的实时PCR系统(应用生物系统公司)。基因表达水平表示为δCt值归一化GAPDH(23]。

2.5。神经总大小的测量

相差8井/条件的图像捕获每一个克隆(每个条件是一个代表图像如图S3)。预计的神经区域总量测定使用ImageJ [24]。总大小作为一个球体体积计算使用投影面积的圆直径确定[25]。

2.6。体外神经元分化

为了避免扰乱自然形成的利基,neurospheres并不分离。完整的neurospheres被转移到船舶涂层与基底膜基质生长因子减少™(稀释1:30,BD生物科学)和培养Neurobasal介质B27(生命技术)含2%和1%谷酰胺为2周(22]。

2.7。采用免疫染色

细胞被固定在4%多聚甲醛和用PBS。固定样本然后堵塞10%正常山羊血清与反孵化β三世微管蛋白抗体(克隆TuJ1, Babco)一夜之间在4°C。样本然后孵化alexafluor - 488共轭山羊anti-mouse免疫球蛋白(分子探针,生活技术)在室温下1 h。彩色样本研究了共焦激光扫描显微镜。所有与matched-isotype染色过程进行控制(22]。

2.8。神经突的分析

β三世tubulin-positive探明在四个区域检测到适当的阈值,然后使用ImageJ场大病24]。总神经突的长度是通过计算确定积极的像素(26]。

2.9。统计分析

获得的基因表达水平显著差异定量rt - pcr分析使用Steel-Dwass非参数测试或韦尔奇的多重比较以及。显著差异在神经总大小也分析了Steel-Dwass比较测试。显著差异的总神经突的长度被Dunnett的测试分析。详情见图传说。

3所示。结果与讨论

有许多变化在神经感应方法,虽然有共识SMAD抑制的必要性。确定hiPSC克隆来自不同的体细胞组织可以分化成hNPCs没有特定的神经感应方法(图1(一)),我们检查了21 hiPSC克隆于CiRA(表S1)。这些hiPSC克隆来自三个不同的组织:HDFs, CB, PBMN细胞(表S1)。

所有的hiPSCs表现出典型的未分化hESC-like形态(图S1A)。定量rt - pcr显示一致的高水平表达的克隆多能性标记基因Oct4,NANOG,LIN28A但非常低水平的分化标记基因SOX17(内胚层),T(中胚层),SOX1和PAX6(神经)前神经感应(图1 (b)和图印地)。

两个主要的方法诱导的神经分化为/ hiPSCs EB formation-based方法(EBFM)和EB形成双重SMAD抑制剂(dSMADi)。我们控制了骨料粒度dSMADi方法使用quick-aggregation过程(16),检查四个附加条件使用这种方法通过评估组合两个培养基和两种不同的含氧量。在EBFM方法中,我们使用一个低浓度(5%)的基因敲除血清替代(KSR) [19,20.)限制BMP-like活动(27),该组织反对KSR神经感应和存在。

我们接受21 hiPSC克隆(图五个不同的神经诱导过程1(一))。评估神经诱导效率使用dSMADi,我们hiPSCs基因表达的水平相比,一天30 EBFM-derived EBs,和天14 dSMADi-derived骨料,通过定量rt - pcr(图1 (b),图印地图就是S1C,图S2)。二元箱形图显示,多能性标记基因,Oct4和NANOG,强烈和统一下调14 dSMADi-derived总量而不是每天30 EBFM-derived EBs,表现出更多的变量表达式中克隆(图1 (b)和图就是S1C)。有趣的是,dSMADi治疗还另一个多能性的差别导致了轻微的对这些标记基因,LIN28A(图1 (b))。

一天30 EBs没有统一表达内胚层标志基因SOX17中胚层标记基因T,或神经标记基因SOX1和PAX6并列为nonneural、神经或三个胚芽layer-containing EBs(图S1D)。相比之下,几乎所有的第14天dSMADi-derived骨料展出的upregulation神经标记基因但不是nonneural标记基因(图1 (b))。这些发现表明,虽然EBFM-derived EBs表现出细胞谱系的可变性(只有6克隆向专门的神经分化血统),dSMADi-derived总量表现出更少的克隆变异,其中几乎所有接受神经血统感应不论体细胞组织起源和分化协议(超过90%的克隆对神经分化血统)。以后,我们将参考第14天dSMADi总量作为神经聚集。

我们进一步评估的影响四个dSMADi条件通过比较基因表达水平在两种类型的神经聚集派生的媒体(KSR或B27N2)和两种不同氧含量(20%或5%)(图2(一个))。尽管多能性标记基因的表达水平Oct4和神经标记基因SOX1类似在聚集培养的四个条件,这些的呢NANOG在聚集培养KSR O / 5%₂和PAX6在聚集培养KSR O / 20%₂O和KSR / 5%₂明显高于B27N2-based条件(图2(一个))。独自的氧气水平没有显著影响这些基因的表达水平。虽然我们quick-aggregation过程用于dSMADi实验消除EBFM-derived EBs的大小和形状变化观察(图S1A),我们注意到明显的神经总大小的差异四个条件(图S3)。

详细检查培养条件的影响,我们测量的大小神经聚集在7天,一天14(图2 (b))。第14天神经聚集培养在B27N2-based条件明显比那些在KSR-based培养条件在每个氧气水平,和他们也培养时明显增大20%₂阿比在5%₂在这两种类型的媒体(图2 (b)和表S2)。值得注意的是,神经聚集不生长在KSR-based条件的诱导期无论氧气水平。相比之下,B27N2,其中包含基本的纤维母细胞生长因子,神经总量的增长(图的支持2 (b))。这些发现表明,尽管四dSMADi条件有效地促进神经系感应,培养基影响基因表达和总大小,而氧气水平主要骨料粒度的影响。

接下来,我们调查是否神经聚集展出forebrain-type属性,正如前面观察lt-NES细胞和R-NSCs [8- - - - - -10]。因为的表达PAX6在KSR-derived总量高于B27N2-derived总量,我们首先前脑标记基因的表达水平相比,FOXG1和OTX1在第14天神经聚集在所有四个条件下培养。尽管没有显著差异FOXG1和OTX1表达水平之间的聚集培养在不同条件下(图3(一个)),FOXG1表达更多的变量在克隆相比OTX1表达式。因此,我们比较了FOXG1聚合来自体细胞组织中表达不同的起源(图3 (b))。值得注意的是,FOXG1表达显著低于来自PBMN克隆细胞比来自HDFs和CB细胞(图3 (b)),尽管HDF - CB克隆细胞衍生变量展出FOXG1表达式。考虑到胚胎干细胞生成前forebrain-like神经前体细胞在缺乏外部信号(28),的可变性FOXG1表达式HDF -和CB-derived克隆可能反映变量Wnt激活hiPSCs [29日]。

然而,微分的调节机制FOXG1表达式CB -和PBMN-derived克隆尚不清楚因为hiPSC克隆都是来源于中胚层组织,培养了20通道,被认为已经失去了体细胞组织表观遗传记忆(30.- - - - - -32]。考虑到所有的PBMN细胞αβT细胞在这项研究中,由于T细胞受体基因被修改(TCR)重排,相比HDF和CB细胞。基因编码t细胞受体α(交易)和t细胞受体β(交通研究)是位于染色体区域14 q11.2 7 q34,分别。FOXG1位于染色体地区14个问题。尽管交易和FOXG1相距约600万基地,一些表观遗传修饰可能还发生在监管区域吗FOXG1。FOXG1对正常corticogenesis[至关重要33];因此,PBMN-derived hiPSCs可能不是一个好来源分析正常皮质开发或疾病建模。还需要进一步的研究来阐明是否抑制Wnt信号提高了感应PBMN-derived前神经祖细胞的克隆。另一方面,我们推测,潜在的神经骨料生产制服hNPCs可能被筛查FOXG1表达式。评估这种可能性,我们分组的所有神经聚集成四类(FOXG1- /SOX1-,FOXG1中间/SOX1-,FOXG1低/SOX1-,FOXG1低/SOX1集群基于低)FOXG1和SOX1表达水平(图3 (c)和表S3)。然后我们从每个类别选择神经聚集,除了SOX1低,nonneural血统类别,为进一步扩张。值得注意的是,这些神经总量包括克隆来自三个不同组织类型(表S3)。

促进均匀hNPCs种群的扩张,我们培养他们作为浮动neurospheres [22)而不是像lt-NES细胞附着细胞。建立了可扩展的neurospheres约6无论通过FOXG1表达水平在第14天神经聚集或体细胞组织起源(图4(一))。确认neurospheres hNPCs,神经元分化诱导使用无血清神经元分化的协议。所有的HDF - CB细胞衍生neurospheres分化β三世tubulin-positive神经元与神经突长,而只有两个五PBMN细胞衍生neurospheres接受神经元分化(数字4(一)和4 (b))。值得注意的是,所有的克隆,未能区分来自hiPSC克隆604 a3(数据4(一)和4 (b))。这些结果还表明hNPC建立独立的FOXG1表达水平的第14天神经聚集和hiPSC体细胞组织起源。FOXG1表达随增加通过lt-NES细胞(9,10]和neurospheres [22]。因此,我们假设FOXG1表达在第14天神经聚集可能会降低随着时间的推移,导致中期/ hindbrain-type祖细胞的形成。评估这一假设,我们比较地区身份标记基因的表达在第14天神经聚集和通道6 neurospheres(图4 (c))。我们发现神经聚集表示变量的水平不仅前脑标记,FOXG1和OTX1,而且每一个标记基因/后脑(中期EN1/GBX2)和脊髓(HOXC6)(图4 (c))。这些广泛的区域标记基因的表达模式与前一个报告一致的活动内生Wnt信号(34]。相比之下,通过6 neurospheres表达水平更高和更少的变量/后脑标记和中期减少水平的前脑和脊髓的标记(图4 (c))。因此,虽然一天14神经聚集展出调节前脑标记表达式,建立了hNPCs显示中期/ hindbrain-like区域属性,与先前的研究一致的(22]。

最后,我们比较了神经祖细胞基因的表达在建立hNPCs(图4 (d))。我们发现hNPCs和604年a3-derived non-hNPCs分别聚集,hNPCs表现出类似的神经祖细胞基因表达模式不管dSMADi条件和体细胞组织起源。所有的PBMN克隆高的满足我们的标准SOX1和PAX614天(图表达3 (c))。三个604年a3克隆几乎相同的属性在14天,但不同于其他克隆通道6(图4 (d))。我们不能消除的可能性第14天神经聚集包含nonneural细胞,因为基因表达分析的大部分人口,不是在单细胞水平。因此,我们应用neurosphere文化方法选择一个同质性和我们在几乎每一个成功的案例。不过,鉴于至少神经嵴细胞可以生长在我们的neurosphere条件(35优先),一些细胞群,是诱导604 a3克隆可能被选择并扩大neurosphere文化的过程。

4所示。结论

我们得出这样的结论:神经系细胞可以从大多数hiPSC克隆,不管他们的体细胞组织起源,使用双重SMAD抑制。我们发现PBMN细胞衍生hiPSC克隆没有表现出增强的前脑标志基因的表达,FOXG1,但生成的hNPCs神经元分化能力有效HDF -和CB-derived hiPSC克隆。此外,神经聚集在早期神经感应阶段表现出变量的神经区域标记基因表达模式和引起hNPCs一致表现出中期/ hindbrain-type财产和神经祖细胞基因表达了类似的水平。这些发现表明,这里描述的hNPCs可能是一个有用的细胞来源基础和制药研究旨在开发再生疗法治疗各种神经疾病。

相互竞争的利益

作者声明没有competimg利益有关的出版。

作者的贡献

Yonehiro Kanemura构思研究和写论文Hayato Fukusumi最后批准。Yonehiro Kanemura, Hayato Fukusumi Shofuda,和洋平Bamba设计实验。Hayato Fukusumi, Shofuda, Atsuyo山本,Daisuke Kanematsu,菊友手中收集和分析数据。圭佑Okita建立和分布式hiPSC克隆。Hideyuki冈Shinya Yamanaka Masaya中村,提供了重要的阅读和科学讨论。

确认

作者感谢高田Ai女士Miho住田,吉冈Ema, Yui Inazawa技术支持。作者收到Kazutoshi博士的慷慨支持高桥(CiRA,京都大学)。这项研究得到了再生医学研究中心网络实现的日本,日本科学技术振兴机构(JST)和日本医学研究和开发署(艾湄湾),也支持的部分药品研究监管协调和评估,医疗器械,再生和细胞治疗产品,从艾湄湾基因治疗产品,化妆品。

补充材料

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