文摘

管理人类脂肪干细胞再生治疗(对asc)代表一个有前途的治疗骨科损伤。虽然对asc可以很容易地隔绝liposuction-derived脂肪组织,大多数临床应用程序可能需要在体外文化扩张的这些细胞使用nonxenogeneic组件。在这项研究中,血小板releasate是使用一种新型的快速生成凝血酶活化方法(tPR)。对asc生长在媒体补充tPR扩散速度远远超过对asc生长在媒体补充10%胎牛血清。细胞还保留的能力区分chondrogenic,脂肪形成的,成骨的血统。显示的tPR培养对asc BMP-4表达升高(5.7±0.97倍增加),BMP-2(4.7±1.3)倍增加和减少的表达PDGF-B(4.0±1.4倍减少)和FGF-2(33±9.0倍减少)。没有显著的变化表达TGF -β和VEGF。这种模式的基因表达是一致的在不同的同种异体tPR样本和不同ASC线。使用同种异体迅速激活对asc tPR文化与细胞产量增加和相关基因表达谱定义成为一个有吸引力的选择细胞扩张之前,细胞治疗骨科应用程序。

1。介绍

考虑到他们的治疗潜力,缓解的隔离,有广泛的兴趣使用人类脂肪干细胞(对asc)治疗各种肌肉骨骼和关节疾病(1- - - - - -3]。这些细胞可以很容易地与皮下脂肪组织,它们可以分化成脂肪细胞,骨细胞,软骨细胞,和tenocytes,他们分泌多种生长因子,可以帮助组织修复(4- - - - - -6]。

标准隔离协议涉及酶消化lipoaspirates隔离间质血管分数(SVF) [4]。SVF是异质的细胞的集合,其中只有一小部分(约1 - 5%)是对asc [7,8]。尽管数量有限的可以直接从lipoaspirate孤立也随后SVF塑料贴壁细胞的培养可以产生大量对asc。

人类的初步研究表明,SVF注射有能力治疗软骨和骨缺损,同时保持一个优秀的安全性(9- - - - - -12]。然而,考虑到有限数量的对asc SVF,文化扩大了细胞的使用可能会达到最佳的治疗效果。事实上,试点研究与培养对asc和骨髓基质干细胞治疗骨和关节疾病取得了可喜的成果(13- - - - - -17]。

结果,识别安全、可靠和健壮的细胞培养协议不妨碍这些细胞的治疗潜力仍然是一个重要的因素来优化之前ASC治疗骨科疾病变得普遍。在基础研究、胎牛血清(的边后卫)是常用的媒体对asc培养补充,但是,考虑到变化的边后卫准备和潜在的异种的污染,对培养细胞的边后卫替代品是至关重要的为特定的临床应用(18,19]。

先前的研究已经表明,thrombin-activated血小板releasate (tPR)和血小板溶解产物(PL)是有效的边后卫替代品培养间充质干细胞(msc)都被证明增加msc在文化的增长率18,19]。增加增长时,两个准备包含不同子集的生长因子和小分子由于不同的礼仪,他们准备20.]。而PL准备解放的全部内容血小板和含有聚集的血小板膜,凝血酶激活触发器的生长因子释放,模仿什么发生在活的有机体内在伤口愈合和组织修复(18]。因此,tPR准备可能的治疗优势PL准备。

激活后,血小板释放多种生长因子可以影响ASC生长和分化包括血小板衍生生长因子B (PDGF-B)、胰岛素样生长因子- 1 (igf - 1)、转化生长因子β(及),血管内皮生长因子(VEGF)和基本的纤维母细胞生长因子(FGF-2) [21]。然而,随着血小板计数和血小板分泌生长因子水平因人而异(22,23),目前尚不清楚如何使用tPR通常适用的ASC文化将在临床设置。为了解决这个问题,有必要研究影响各种tPR预备对增长和基因表达不同的ASC线。

鉴于使用早期通过细胞的好处在医务室那一把减少自体治疗之间的时间收获脂肪组织和患者治疗和减少污染的可能性和自发的转换在早期通过细胞培养程序研究将最相关的临床使用。

在目前的研究中,我们产生了各种各样的同种异体tPR准备通过一种新型的快速凝血酶激活协议。我们调查了影响这些同种异体tPR准备在早期通过对asc通过调查(1)tPR的能力迅速产生大量对asc胜任治疗使用和(2)固有的可变性不同的同种异体tPR预备对这些早期的通道细胞。我们检查了tPR对增长率的影响,形态、基因表达,对asc和分化能力来确定对asc tPR的适用性短期培养用于骨科治疗。

2。方法

ASC隔离。对asc是隔绝抽脂送气收获从皮下脂肪组织网站的主题做整形手术在三一运动医学和性能中心诊所。使用的研究协议是方济会修士斯托本维尔大学的机构审查委员会批准。对asc隔离,lipoaspirate样本反复清洗注射器使用哈佛商学院。洗后,脂肪组织与0.1%胶原酶消化(I型;沃辛顿)37°C水浴与温和搅拌1小时。摘要随后离心5分钟在500 g丸间质血管分数(SVF)。SVF resuspended在哈佛商学院和通过40-micron过滤器。SVF repelleted是使离心5分钟在500 g。适当增长的细胞被resuspended媒体和现场有核细胞数在Nexcelom Cellometer使用AO /π染料。

血小板隔离和快速的凝血酶激活。血小板分离从健康成年人外周血捐助者使用收获SmartPrep系统。APC-60版本被用来准备5 - 10毫升的富血小板血浆(PRP) /捐赠者。血小板计数的四个样本由库尔特计数器(贝克曼库尔特)如下:样本、样品、样品和示例。快速生成thrombin-activated血小板releasate (tPR), 5毫升0.5毫升的浓缩血小板被激活的凝血酶(Recothrom, 1000国际单位/毫升)2 - 3分钟在室温下与温和的风潮。活化的血小板被立即离心机在10000 g和上层的孤立和储存在−80°C到使用。在使用之前,tPR温暖到室温,离心机在10000 g去除任何残留的凝血碎片,和直接添加到培养基如下所述。肝素是不添加到增长媒体在先前的研究18)(1)肝素被称为降低对asc[细胞生长的18),(2)我们没有观察凝胶或血栓形成在细胞培养期间与我们快速激活tPR。

细胞培养。新孤立SVF镀细胞密度4000住有核细胞/厘米²在25厘米²烧瓶。这些通道0 (P0)细胞在DMEM / F12媒体(GIBCO)补充tPR的边后卫10%或10%。细胞培养10天与媒体是改了两次。10天,细胞使胰蛋白酶化,计算使用Nexcelom Cellometer愿景CBA血细胞计数系统,和播种密度4000细胞/厘米²在DMEM / F12媒体补充血小板releasate的边后卫10%或10%。这些P1细胞培养4天与媒体改变了2天。

Immunophenotyping。通道2对asc tPR培养为特征的表达以下标记:CD34(单程粘附分子),CD73 (ecto-5′核酸酶),和CD90 (THY-1)。细胞分离使用胰蛋白酶,HBBS洗,染色使用特定FITC-conjugated单克隆抗体或isotype-matched控制(BioLegend)。分析在Nexcelom Cellometer愿景CBA血细胞计数系统。培养间充质干细胞是阳性CD73 CD90和CD34是负面的。

实时聚合酶链反应。通道1细胞接触后使胰蛋白酶化表示培养条件和总RNA提取使用BioRad总阿鲁姆RNA准备装备和列DNase消化消除基因组DNA。数量和质量的总RNA制备测定使用Nanoquant板Tecan 2000分光光度计。RNA从每个样本(~ 0.2毫克)使用iScript reverse-transcribed RT (Bio-Rad)。为定量实时聚合酶链反应,反应进行使用SYBR绿色PCR试剂盒(BioRad)和乔丹迷你热循环(BioRad)。所有的反应都是使用验证引物对购买的http://RealTimePrimers.com/。rt - pcr反应都是在复制和控制进行rt - pcr反应使用模板进行了模拟reversed-transcribed(无逆转录酶)。控制反应证实基因组DNA已被有效地移除。ΔΔCq方法(BioRad)被用来计算相对基因表达基因使用GAPDH和RP13L作为参考。以前的工作已经确定了这些参考基因稳定表达对asc氯化钙后激活PRP的边后卫文化(24]。

细胞分化。脂肪细胞和骨细胞分化,通道2对asc生长在tPR收获和播种密度的5000细胞/厘米²在6-well菜肴。confluency后细胞达到百分之六十,分化媒体补充道。脂肪细胞的分化媒体包括标准媒体补充1μ地塞米松,0.5毫米isobutylmethylxanthine, 100年μ20 m消炎痛,μg / mL胰岛素。三个星期后,细胞使用油红O染色胞内脂质积累的一项指标。

骨细胞分化,StemPro骨生成媒体(GIBCO)使用和改变了每三天。21天之后,文化是用茜素红染色,染料中的钙沉积鲜艳的橙红色。

软骨细胞分化,micromass文化生成的离心法对asc通道2,resuspending标准增长媒体的浓度细胞/毫升。10μL液滴被播种的井24-well板和高湿度下孵化12 - 15小时。micromass后形成和附加到0.5毫升的温暖StemPro软骨形成媒体(GIBCO)补充道。媒体被改变了每三天。21天之后,micromass颗粒冲洗一次与哈佛商学院和固定4%甲醛溶液30分钟。颗粒又冲洗和阿尔新蓝染30分钟了。1%的解决方案准备在0.1 N盐酸。颗粒冲洗三次,0.1 N HCl一旦dH₂o .蓝染色显示由软骨细胞蛋白多糖的合成。

3所示。结果

3.1。形态

新孤立P0对asc和P1在DMEM培养媒体补充tPR的边后卫10%或10%。对ASC培养两种条件下显示ASC纤维母细胞形态学特点,虽然tPR培养细胞更小更spindle-like形状(图1)。这个细胞形态学改变是一致的在所有四个同种异体准备tPR,维护通过多个段落。

除了形态学的变化,细胞培养在tPR显示减少的粘附到培养皿之前报道(18]。细胞生长在tPR脱离的塑料盘2 - 4分钟内胰蛋白酶的发病,而的边后卫培养细胞需要更长的潜伏期时间,5 - 8分钟,完全分离。

3.2。增长速度

我们检查了早期对asc通过培养时的增长率10% tPR。电镀后100000有核细胞从SVF T25烧瓶,tPR治疗细胞扩散速度比的边后卫补充细胞。经过十天的增长,tPR补充细胞产生了4.5倍(图2(一个))。虽然有一些变化影响的大小(3 - 7.5倍增加),所有四个同种异体tPR预备P0对asc的产量增加。

检查是否这个变化可以归因于不同的ASC细胞系或不同的tPR预备,我们检查了增长的使用各种组合ASC线(A1-A5)和公关预备(P1-P4)(图2 (b))。

P0收益率的变化似乎归因于不同的脂肪组织样本。例如,脂肪组织样本A4给了非常相似的细胞产生两种不同的公关预备处理时,P3和P4(图2 (b))。类似的模式也与脂肪组织样本A5(图2 (b))。

对asc P1时也显示更高的增长率培养tPR为10%。镀从最初的100000个细胞,四天在10% tPR产生大约2.5倍的细胞做了10%的边后卫文化(图3(一个))。细胞产量非常一致的跨不同的ASC (A1-A5)和不同的同种异体tPR准备(P1-P4)所有七种不同文化之间的组合产生了1.0×10⁶和1.5×10⁶细胞(图3 (b))。

基于对asc P0和P1增长率在tPR看到这里,1毫升的胶原酶消化脂肪组织我们发现一般产量约400000有核细胞生成对asc在14天。

3.3。分化能力

对asc的分化潜能生长在tPR测试来确定这些细胞保持沿着成骨的能力区分,chondrogenic,标准下脂肪形成的血统在体外区分的条件。

使用通道2对asc tPR培养,我们证明了早期段落tPR补充媒体没有影响对asc的分化潜能。成骨分化是由富含钙的沉积验证矩阵用茜素红染色。去验证了脂质空泡的形成使用油红O染色(图4)。最后,chondrogenic分化在高密度micromass文化中得到证实。这些micromass文化阿尔新蓝染色阳性,这是一种特别的高硫酸软骨蛋白聚糖的矩阵(图4)。

除了维持正常的ASC分化潜力,通过2对ASC tPR培养显示一个immunophenotype与间充质干细胞一致。这些细胞有强烈的积极表达CD70 CD93,这两个MSC细胞表面标记,而消极CD34造血干细胞标志(图5)。

3.4。基因表达

为了检查tPR文化对基因表达的影响对asc, rt - pcr分析上执行一组生长和分化相关的基因。P1细胞已经~ 80%融合进行了测试和四个独立的tPR样本。六个基因测试骨形成蛋白2 (BMP-2),骨形成蛋白4 (BMP-4)、转化生长因子(及),血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子B (PDGF-B),碱性纤维母细胞生长因子(FGF-2)。

BMP-2的表达(倍增加)和BMP-4 (倍增加)是调节在ASC文化中生长在tPR当PDGF-B的表达(倍减少)和FGF-2 (倍减少)在tPR表达下调。一致的变化被认为在这四个因素在所有四个tPR预备,及和VEGF的表达对asc没有明显改变的文化在tPR(图6)。

而变化的大小在不同样本的基因表达变化,基因表达变化的方向是一致的在所有的各种tPR预备和ASC作为BMP-4图说明7。

4所示。讨论

培养对asc的扩张将是一个关键的一步在各种干细胞疗法,以及特定的文化环境可能会影响治疗结果。鉴于潜在的异种的污染,各种人性化的边后卫选择已报告包括使用人类tPR (18- - - - - -20.,26]。

细胞增殖的增加使用tPR看到是一致的与其他报告,检查对asc培养各种制剂的血小板的反应溶解产物(PL)或tPR (18- - - - - -20.,26]。而PL和tPR对ASC发展也有类似的作用,tPR似乎是更可取的选择的原因。首先,凝血酶激活的血小板模仿在愈合过程中血小板的正常的生理反应在活的有机体内和可以做非常迅速(3-5-minute激活时间)在这里描述的方法。其次,更容易区分血小板和血小板因子富裕的上层清液比单独生成的膜碎片在血小板裂解(18]。

虽然tPR已被证明是有效地增加细胞增殖,对tPR对asc预备对变量的影响不同。先前的研究通常集中血小板来自多个源生产tPR和没有看着可变性之间个人准备工作(18,26,27]。PL的案例中,一个先前的研究调查了使用不同的PL变量对经济增长影响的准备工作由冻结/解冻协议,发现所有PL预备增加细胞增殖但不同程度(28]。

我们已经表明,四种不同的同种异体tPR预备,所有产生的一种新型的快速凝血酶活化过程中,表现出对asc一致的影响。这四个不同的tPR预备血小板浓度范围在5.6 - -10.0×10⁵/μl .尽管这些血小板浓度的差异,所有四个tPR预备有非常相似的影响对asc的行为。这些影响包括增加细胞增殖、分化潜力的维护,细胞形态学的改变,和一致的基因表达改变。

不同的tPR预备有非常相似的对ASC线的生长的影响。这段期间尤为明显,细胞产量范围从1到150万细胞后四天的文化从最初播种100000细胞。有趣的是,没有增长率与血小板的数量之间的相关性在各种tPR预备。然而,由于个体间的血小板质量变化(22,23],难怪没有直接相关性增强血小板数量和增长。

p0的生长有显著的变化,但这种变化也没有与血小板水平tPR样本。P0收益率的变化看到最有可能源于固有的可变性对asc的孤立的从不同的脂肪组织样本。支持在ASC预科3中,可以看到,显示非常相似的P0收益率在两个不同的tPR预备。几乎相同的模式被认为与ASC准备4。

对asc的促进增殖作用在tPR已经深入研究,少即是已知的关于tPR对基因表达的影响。据我们所知,只有一个先前的研究检验了基因表达后对asc tPR接触(27]。本研究使用了一个芯片分析,发现102个基因表达水平改变的。他们发现的基因被改变,主要分化和细胞粘附相关基因,显示重叠与先前的研究发现基因改变对asc和bmsc培养在人类血清或抗血小板溶菌产物(29日,30.]。

我们选择分析六个基因与间充质干细胞增殖和分化,发现其中四个tPR的表达发生改变。这四个基因,PDGF FGF(下调)和BMP-2 BMP-4(调节),没有发现在之前的芯片研究[27]。有很多因素可能导致这种差异。第一个是之前的事实研究了P2细胞中基因表达的同时,在目前的研究中,基因表达在P1细胞检查。此外,这里采用的快速tPR准备减轻需要添加肝素,一个因素,对细胞生长有抑制作用18),文化媒体在前面的研究。最后,采用rt - pcr的灵敏度增加协议或许会发现差异,错过了在芯片分析。

因为之前的tPR研究来自于一池八捐助者(样本27),intersample tPR变异对基因表达不能确定。我们生成个人tPR准备允许我们检查intersample变异对基因表达的影响。类似于增长率的变化我们看到,我们发现基因表达的变化是一致的在所有四个tPR预备测试。

而影响这些变化对这些细胞的治疗潜力是未经检验的,一致的增加BMP-2和BMP-4表达可能有利于骨骼和软骨的修复组织。BMP-2被证明能增加msc增殖和软骨基质生产(31日,32]。同样,BMP-4被证明(1)诱导msc分化为成熟的软骨细胞,(2)加强软骨基质的生产通过刺激胶原蛋白的合成II型和aggrecan31日,33]。在骨修复的情况下,交付BMP-2已表现出增强的能力对asc分化为骨细胞,增强骨修复(34,35]。

tPR PDGF-B和FGF-2表达减少,虽然可能不是最优组织修复(31日),并不令人惊讶的大量这些生长因子通常发现在公关预备19]。事实上,中和FGF单独或结合PDGF已经证明降低PL准备的增殖作用(36]。治疗,减少PDGF和FGF表达可以抵消通过coinjection tPR培养对asc和富血小板血浆(PRP)。这种方法表明承诺在人类和动物关节软骨损伤的研究(9,37,38]。

鉴于PRP和随后的tPR预备含有多种生长因子,蛋白质,多肽,和其他相关生物小分子,它将很难识别所有的因素是重要的增长修改影响tPR看到这里和其他地方(18,21,26,27]。尽管如此,速度和易用性的同种异体tPR预备这里描述可以生产,加上他们包括有利影响细胞生长,使tPR理想文化补充对asc生成足够数量的骨科治疗。

基于对asc的增长率tPR看到这里,1 cc collagenase-digested脂肪组织可以产生3×10⁷对asc在14天。以上这个数字对asc的MSC细胞治疗剂量发现有效的软骨和骨修复在各试点研究[13- - - - - -17]。此外,该收益率可以很容易地扩大通过收获额外的脂肪组织。

最后,这里的结果表明最初的增长和扩散对asc更依赖于脂肪组织样本比tPR准备。同样,改变基因表达变化的大小取决于特定的组织样本。临床上,这一发现表明,病人的健康可能会影响经济增长的一个重要因素,增殖,细胞因子分泌,并最终对asc自体的治疗潜力。事实上,因素,如年龄、性别、身体质量指数和疾病状态可以影响病人对asc的功能和行为(39- - - - - -41]。细胞收获之前解决这些问题和治疗将在获得最好的重要功能结果对病人参与ASC-based整形治疗。

5。结论

使用同种异体迅速激活对asc tPR文化与增加细胞产生和维护相关的分化潜能。增加细胞增长将促进减少之间的时间收获脂肪组织和病人治疗和减少污染的可能性和自发的在培养过程中转换。此外,tPR培养细胞显示已定义的基因表达谱,以应对各种同种异体tPR预备包括upregulation BMP-2 BMP-4。各种各样的同种异体tPR预备的一致的影响在不同的ASC行表明,tPR培养细胞扩张是一个普遍适用的选项前细胞治疗骨科应用程序。

利益冲突

丹尼尔Kuebler目前执行支付合同为人类再生技术(HRT)工作,哪些市场placental-based再生医学产品。Michael Scarpone博士是再生疗法的去向,一群医生骨科损伤的再生医学提供程序。

确认

作者要感谢莎拉·卡普和丹尼斯·伦巴第的工作支持这个项目。作者也希望感谢方济会的科学与健康研究所的部分资助这项研究。