微观和宏观结构PLGA /明胶支架促进早期人类间充质干细胞在体外的心原性的承诺

文摘

该生物材料支架在大多数组织工程策略起着关键作用。其表面性质,缩微成像、退化和机械特性不仅影响组织的生成构建体外,而且其体内功能。心肌组织工程的面积仍然面临着巨大的困难和挑战在生物活性支架的设计,使成分变化以适应进化的心肌结构的分化。我们旨在验证如果组织人工支架可以独自挑起对干细胞的行为产生影响。为了这个目的,我们制作的微结构人工高分子结构的PLGA /明胶模仿各向异性心肌的结构和力学性能。我们发现PLGA /明胶支架提升附着力,伸长,命令处理,早期人类间充质干细胞心肌承诺表明这些构造与干细胞能够相声精确和控制方式。同时,该生物材料降解动力学呈现PLGA /明胶结构非常有吸引力的心肌再生方法。

1。介绍

在组织工程的典范,一个三维平台称为支架对细胞增殖至关重要,生长和分化,最终生成功能组织(1,2]。

一般来说,支架在组织工程必须满足一系列广泛的需求,同时使它很难获得适合临床使用的功能结构。

如果组织再生心肌、难以控制的工程脚手架模仿复杂组织组织甚至更大。心脏组织的结构组件排列在微(心肌纤维)和纳米级(纤维,观察);然而,尚不清楚这是最重要的地形初始刺激激活体内复杂的过程,会导致工程的心脏组织。

许多努力都致力于发展纳米-支架能够繁殖,微型、生化和中尺度水平,机械,和心脏细胞外基质(ECM)的结构特征。在这方面,金等人证明了设计组织结构和功能的变化高度敏感的地貌在纳米级水平(3]。这是观察到的水凝胶纳米制造基于挂钩丙烯酸可以制成调节新生大鼠心室细胞的排列和指导心脏各向异性结构和功能(3- - - - - -5]。此外,各种基板与微米模式研究了心肌细胞直接到各向异性组织的心脏组织结构(使用不同的微细加工技术6- - - - - -8]。Engelmayr jr .)等人优先显示,移植的形成和新生儿的老鼠心脏细胞排列更紧密地和机械性能类似成年大鼠右心室心肌(9]。

除了使用差异化的心脏细胞,大多数相关的再生方法是工程支架对干细胞的影响。人类间充质干细胞(hMSCs)可以从骨髓容易收获的愿望。由于其高的自我更新能力和优秀的体外分化潜力,hMSCs适合再生医学(10]。复杂的分子和功能msc与环境的相互作用是广泛研究,但没有完全理解。身体微环境的特点已经显示在不同的组织包括ECM刚度调节MSC的命运(11与纳米特性[],交互12,各向异性13),微型图象(14,15]。其他物理特性可能会影响心脏干细胞的组织工程的关键方法包括支架降解特性。体内的事实上,在视图的方法,建立了最佳支架降解率的角度与再生/愈合过程是基本的重要性。

高分子生物材料用PLGA提供重要的优势包括生物相容性,生物降解,可以通过不同的解放军和PGA调制部分内容,,一旦携带毒品,准确控制释放动力学的可能性达到足够的管理(16]。此外,PLGA已批准数在人类和生物医学应用作为支架材料在组织工程17]。即使在心血管领域使用不是主要探索,然而PLGA支架,主要在形式的纳米纤维通过电纺的,广泛研究在骨科的应用程序(18- - - - - -22]。携带TGF - PLGA结构β被证明影响msc成骨细胞和软骨细胞的生长和分化行为(23,24]。此外,PLGA支架结合SDF1 -α研究了评价干细胞招聘和炎症反应改善关键的组织反应在支架植入(25]。另一项研究表明,纳米,微观结构实际上电纺无纺布PLGA-based支架提供了灵活性和指导心脏细胞增长(26)和最近一个omentum-wrapped PLGA补丁播种与大鼠msc移植到心外膜的梗死区展示有益对心室重构和心功能的影响27]。明胶是一种最常用的天然材料重新创建本地心肌微环境(28]。在过去,纯凝胶支架已经申请体外和体内心脏组织再生29日]。最近,micromolded明胶水凝胶已经证明来支持长期的文化改造老鼠和人类心脏组织30.]。此外,进行I期临床试验使用明胶水凝胶的结合嵌入式和人类cardiac-derived干细胞碱性纤维母细胞生长因子(bFGF),即使有必要深化后续评估治疗疗效[31日]。此外,最近的一项研究进行gelatin-based水凝胶中加入金纳米棒建议他们可能使用心脏补丁与优越的电气和机械性能32]。

在之前的纸我们演示了支架的能力基于聚(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) /明胶(PHBHV /明胶)诱导干细胞承诺心脏表型由于物化之间最优协同作用,机械和结构特点33]。

在本文中,我们评估hMSC行为与类似的支架缩微成像和人工生物特性但不同的关注所使用的合成聚合物,聚(DL-lactide-co-glycolide) (PLGA)和混合过程。此外,修改在宏观尺度上,通过生产双层组织支架安装,为了增加的厚度,同时保持表面微观结构,创建一个更健壮的和自适应的构造受损组织的程度和将来使用它作为特定药物的释放的水库。PLGA /明胶支架是准备和在许多方面包括各向异性特征,分子间相互作用,降解过程,以便更好地调查他们的调解能力cardioinductivity针对实现一个高效的心脏补丁。

在这里,我们表明,微观结构PLGA /明胶支架有一个快速降解动力学,同时保持生物力学刺激引起的缩微成像,并提供一个合适的矩阵hMSC附着力,组织增长,早期心脏的承诺。

2。材料和方法

2.1。准备和物理化学/力学特性的PLGA /明胶支架

2.1.1。试剂

保利(DL-lactide-co-glycolide)(西格玛奥德里奇,丙交酯:乙交酯(50:50),分子量是40 - 75 kDa),明胶从猪的皮肤(西格玛奥德里奇),Milli-Q水(微孔),二氯甲烷(DCM)和丙酮(ACT)四氢呋喃(四氢呋喃)(Carlo Erba Reagenti,意大利)。

2.1.2。制备的人工混合

基于PLGA的人工混合凝胶是通过控制溶剂铸造获得从水/行为/ DCM三元混合。详细,明胶添加到解决方案的一个预定义的体积的PLGA (10%) DCM和行动来获取不同的复合PLGA /明胶(90/10,80/20,75/25,70/30 w / w)。先后组成PLGA /明胶70/30将选择,主要力学性能的基础上,特别是低刚度(图2 (c))。

2.1.3。制备ECM-Like多孔人工支架

人工混合被传播到硅模具通过软光刻技术如前所报道(33];模具表面呈现一个缩微成像一个预定义的几何模拟心肌解剖组织(34]。每一层是为了拥有通道尺寸为500μm×100μ60米的深度μ70米,由一组浮雕μm和30μ30米或者和交叉的浮雕μm。传播人工混合后经历了缓慢和控制铸件最后温柔地分离了模具的材料获得微观结构单层。双分子层的制备,整除的明胶的解决方案是同质的沉积在一层从侧面没有蛀牙和浮雕。第二个微观结构层组装离开缩微成像自由的一面。最后一层是固定的平淡和快速压铸。,金属压铸模具在矩形资料准备拥有相同的支架表面的大小。模具加热的最高温度是50°C和定位在双分子层的边缘。

2.1.4。支架特性

形态分析是在非盟气急败坏的样品通过扫描电子显微镜(SEM、Jeol地产5600年,日本)。化学分析是由红外光谱化学成像(珀金埃尔默聚光灯下300年,美国):衰减全反射(ATR)的碎片支架进行抽样技术,使用化学成像允许评估部件的材料的分布,获得化学和相关地图可视化的分布、光谱图像在传输和获取μATR模式(光谱分辨率是4厘米⁻¹空间分辨率为100×100μ300米)使用红外成像系统关注的焦点(珀金埃尔默)。通过触摸ATR光谱收集目标样本和收集样本的光谱产生的表层。聚光灯下软件用于收购也用于光谱进行预处理;动态力学分析是由DMA(美国珀金埃尔默DMA8000),同时使用抗拉测试来评估应力-应变曲线,弹性模量和屈服强度,应变扫描分析评估储能模量(E′)和损耗模量(E^”)的微观结构材料在干燥条件下,对微结构支架应变扫描分析在干燥和潮湿的条件进行了37°C应用平行和垂直方向的应变对微观结构对齐。初步降解测试进行不同的支架组成MilliQ水37°C在早期评估降解动力学。在选定的支架形式的双分子层,退化分析六个月在三个不同的媒体:MilliQ水,磷酸缓冲盐(PBS、pH值7.4σ),和杜尔贝科的修改鹰介质(美国生活技术DMEM)。降解样品进行了扫描电镜、红外光谱和凝胶渗透色谱法(GPC、珀金埃尔默、美国)分析;SEM分析允许评估如何支架降解后形态学改变;傅立叶变换红外光谱评估样品的化学成分的变化;最后,GPC分子量降低量化和多分散性指数的变化PLGA的PLGA /明胶矩阵获得降解动力学配置文件。GPC分析,珀金埃尔默泵,由ResiPore装备(美国安捷伦科技)列,紫外线和RI探测器,使用;内部流动相是由四氢呋喃(1毫升/分钟);在室温下进行了分析; results were obtained based on a calibration curve obtained with polystyrene narrow standards. Moreover, pH of degradation media was monitored during time using pH-meter (CRISON, basic 20).

2.2。细胞培养和文化

hMSCs得到Lonza集团(Walkersville博士)。细胞被流式细胞术检测纯度使用一组细胞表面标记:CD105, CD29、CD44, CD90、CD166 CD34、CD45、HLA-DR(都来自Miltenyi,德国)如前所述[33]。hMSC分化潜力为骨细胞或脂肪细胞谱系被评估为描述(35]。hMSCs用于实验在章节3 - 7所示。根据实验和支架层组成,5×10之间³和20×10³细胞悬浮在50μL DMEM(技术)补充10%胎牛血清(的边后卫,Euroclone,意大利),2毫米谷酰胺,卡那霉素1%,1%丙酮酸钠,1%不重要的氨基酸,0.1%β巯基乙醇(美国都来自Gibco,马里兰州)和播种滴表面的PLGA /明胶支架放置在24-well盘子。3人力资源后所必需的细胞粘附,500年μL的完全培养基添加覆盖了支架和样品保存在5%公司的氛围₂95%的空气在37°C湿润孵化器。支架上的细胞种子保存在文化长达两周,媒介是每三天更换一次。二维控制条件下,4×10³细胞/厘米²被播种在24-well盘子和收获80%的融合。

2.3。粘附和增殖化验

细胞粘附是24小时后评估文化使用代谢测定CellTiter-Blue(美国Promega)如前所述33]。

2.4。细胞形态学和一致性分析

细胞形态学、细胞骨架组织和脚手架殖民被免疫荧光分析。Cellularized支架被固定为4% paraformaldheyde (PFA Sigma-Aldrich) 30分钟,permeabilized 0.1% Triton x - 100 (Sigma-Aldrich) 15分钟和屏蔽6%牛血清白蛋白(BSA Sigma-Aldrich)和2.5%正常山羊血清(门店,Sigma-Aldrich) 1小时,和沾染了红色phalloidin 1: 200 (Sigma-Aldrich) 30分钟,赫斯特33342年1:10000 (Sigma-Aldrich) 10分钟,分别。安装后Mowiol(美国Calbiochem) cellularized支架进行了分析,共焦显微镜(TCS-SPE、徕卡微系统、德国)和非线性光学多通道相干Anti-Stokes喇曼散射(汽车)/双光子激发荧光显微镜(TPEF)(见下文)。

细胞排列和伸长评估在2、4、8、15天的文化与2μm Calcein-AM (Sigma-Aldrich)。Cellularized支架是沾染了2μM Calcein-AM染色和共焦显微镜分析(德国卡尔蔡司激光扫描系统LSM 510)。三维重建得到伊万里瓷器7.6.1 (Bitplane科学解决方案、瑞士)。hMSC意味着细胞长度进行了分析使用ImageJ®ROI测量工具(Rasband,至此ImageJ,美国国立卫生研究院、美国、http://rsb.info.nih.gov/ij/,1997 - 2012)。2 d控制文化评估细胞长度测量参考均值的共焦图像hMSCs 24-well盘子,培养3天的时候达到最大伸长。

采用多通道汽车/ TPEF显微镜实现如先前所述纸(36),PLGA /明胶支架3 d成像与hMSCs同时使用汽车和TPEF技术,分别。汽车信号测量检测,在716 nm和770 nm之间的光谱范围,而在epidetection TPEF信号在510 nm和570 nm之间的光谱范围。激光能量在生物样品是由中性密度滤光轮的变量。水油浸物镜(奥林巴斯LUMPLFLN 60 xw NA = 1, W.D. = 2毫米)被用来激发光束聚焦在样品和收集TPEF信号,而空气物镜(奥林巴斯UPLSAPO 20 x客观NA = 0.75)是用于收集汽车信号。PLGA /明胶支架结构成像使用汽车,寻找碳氢键伸展拉曼模式约2940厘米⁻¹,调优最新泵和斯托克斯梁920.5和1262.1 nm,分别生成汽车信号波长约724.4纳米。相同的泵浦光为920.5 nm被用来激发Calcein-AM TPEF细胞成像。示例(支架+细胞)由汽车和TPEF同时成像,收集41图像在不同Z位置间隔2.5μ100的总厚度μm。每个图像是卡尔曼平均6倍。查看器插件在斐济37允许三维样本图像重建。

2.5。互补脱氧核糖核酸合成RNA提取,定量逆转录酶聚合酶链反应(qPCR)

Cellularized支架被溶解在试剂盒试剂(技术)和提取的总RNA (totRNA)是根据制造商的指示。基因组DNA污染被DnaseI治疗(美国Ambion)。一微克totRNA与随机retrotranscribed六聚物引物使用高容量逆转录工具包(美国应用生物系统公司)按照制造商的建议。目标基因的表达水平进行评估与赛博绿色科技在7500年ABI棱镜快速实时PCR系统(应用生物系统公司)使用25 ng cDNA作为模板和150μ每个引物(表中列出的M1)。

对所有扩增子融化曲线分析。为每个目标基因,褶皱的变化表达水平之间cellularized支架和2 d控制文化评估方法使用Pol2r作为参考基因和匹配2 d控制文化校准器。

2.6。Cardiomyogenesis免疫荧光分析

经过15天的文化都2 d控制细胞和细胞的支架分离使用0.25% EDTA trypsin-1毫米(技术)和在250 rpm cytospinned 6分钟。细胞被固定为4% PFA, permeabilized Triton x - 100, 0.1%和1小时封锁在10%的边后卫,孵化与anti-c-kit(1: 200)和anti-GATA-4(1: 100)抗体(美国从圣克鲁兹)紧随其后的是一个anti-rabbit二级抗体(1:1000)(Sigma-Aldrich);细胞核染色了赫斯特33342 (Sigma-Aldrich) 1: 1000。盖玻片是安装Mowiol和分析了共焦显微镜(TCS-SPE,徕卡微系统)。

2.7。统计分析

所有的结果都表示为平均值±标准平均误差(S.E.M.)。统计上显著的任意两组之间的差异决定使用成对的学生的t以及和差异被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。PLGA /明胶心肌支架制备和表征

3.1.1。Nonmicrostructured PLGA /明胶材料

在初步研究nonmicrostructured PLGA /明胶系统在不同成分退化之前和之后都经历了形态分析在水里。表面的SEM图像具有代表性PLGA /明胶70/30之前和之后的15天的退化是在数据报告1(一)和1(b)。

可以观察一个实质性的变化;从最初的密集形态的示例显示了一个均匀和分散孔隙度连通孔隙介质的直径50 - 100μm。这些毛孔可以合理的形成归因于明胶组件的解散,离开材料,结构形式为蛀牙之前由蛋白质内含物。类似的结果为样本在不同PLGA /明胶成分(数据未显示);毛孔支架结构的存在可以被认为是一个重要方面,支持细胞殖民。

红外光谱化学成像分析证实了夹杂物的存在在PGLA /凝胶结构。代表化学分析的PLGA /明胶70/30报道在图1。样品的化学地图、傅立叶变换红外光谱,相关性对明胶光谱(数字地图1(c),1(e)1(我)突出一个明确的合成和生物组件之间的相分离;明胶似乎形式不同的球状夹杂物在聚合物基体,明显的3 d相关地图(图1(我))。特别是,在图1(e)表面的光谱在两个不同的点指出的存在不同的化学成分;事实上凝胶的特性吸附特性(酰胺我1664厘米⁻¹在1542厘米和二酰胺⁻¹)只出现在一个光谱区而在另一个只有吸附峰的PLGA明显。相反,化学降解后地图(图15天1(d))显示了蛋白质的表面完全没有组件,从没有指出凝胶吸附峰光谱(图1(f))在不同区域,确认后15天接触水凝胶是完全从样本中删除。数据1(g)和1(h)显示纯凝胶和PLGA光谱,分别。

在图1(j),二阶导数光谱获得的化学地图PLGA /明胶70/30,明胶夹杂物水平,报道。反褶积的酰胺乐队让我确定改性明胶构象,显示可以联系到山峰的存在β词构象(1667厘米⁻¹),α螺旋(1651厘米⁻¹),和无序形式(1627厘米⁻¹)[38]。已经报道、傅立叶变换红外光谱纯凝胶材料表现出高可变性的乐队相对于酰胺我反褶积(1670 - 1665厘米⁻¹为β词的结构和1635 - 1620厘米⁻¹无序段)。特别重要的是效果的PLGA明胶,由增加的百分比α螺旋结构水平的人工材料。

Monoaxial测试进行了应变控制下,应用变量位移从0.001毫米/分钟到30%的总变形对初始样本的长度。所有PLGA /明胶系统分析达成实施总变形30%没有骨折(图2)。

人工生物材料表现出弹性模量(E′= 0.78 - -1.20 MPa)低于纯PLGA材料(E′= 2.50 MPa)和更符合最终的应用程序(图2(一个))。使用循环变形动态测试程序进行了通过应用十中的应变值在1赫兹的频率范围0.1% - -30%,2分钟;中平均动态模评估。纯PLGA的储能模量在0.13 MPa - 4.00 MPa(图2 (b)),而PLGA /明胶70/30提供了一个较低的刚度与储能模量在0.23 - -1.42 MPa(图的范围2 (c))。

更详细的分析是进行人工材料在水溶液在第一段退化。pH值下降表明酸形成副产品是显而易见的。纯PLGA的pH值下降很明显由于其快速降解动力学导致可观的副产品在测试时间。减肥的人工生物材料评价和时间(图3(一个))。

结果显示一个相当快速降解动力学纯PLGA达到约55%的减肥后42天而人工生物系统由于凝胶的存在提供了一个更快的动力学的快速释放系统。人工生物系统显示更高的降解动力学在前15天之后纯合成聚合物的遵循了同样的趋势值成正比明胶的人工系统。GPC分析的结果对于体重平均分子量(米_w)确认的影响明胶降解动力学(图上的内容3 (b))。随着凝胶量增加,降解动力学更快速。这可以归因于这一事实,凝胶含量的增加,大量的球状聚合分散成PLGA基质明胶。随后解散的蛋白质聚集在水孵化多孔,然后使这些系统更能吸收水量增加降解率随之增加。数字平均分子量的值(米_n在20天)显著减少的分析而先后减少出现比较明显(图3 (c))。关于多分散性指数(PDI)结果的趋势随着时间的推移,显示的值明显增加7至20天的测试直到返回值略高于那些在接下来的日子里(图上的首字母3 (d))。

在这些结果的基础上它可以假设退化散装,主要减少的20天米_w注册和体重测量。此外还PDI显示值增加到20天一个重要指示米_n减少。随后,一把锋利的米_w减少损失和PDI的暗示表面降解机制。

3.1.2。微结构PLGA /明胶Mono -和双层支架

示意图和SEM图像的部分系统PLGA /明胶70/30双分子层的形式,通过两个microfabricated单层膜的沉积,在数据报告4(一)和4(b)。

外部表面缩微成像提供了定义良好的矩形单元概要文件和粗线与高精度的模具复制。机械测试使用应变扫描方法进行样品在干燥状态和后浸泡在浴缸中。测试由设置在纵向和横向方向伸长考虑各向异性结构的样本。在数据4(c)和4(d)的值E′microfabricated PLGA /明胶单层和双层系统显示。

力学行为反映了明显的各向异性结构。的值E′获得测试在纵向方向,进行关于缩微成像,高于以横向方向。这种差异是注册在干燥状态和之后都浸在水里,这表明各向异性行为在体内生理条件下也能保持。此外,在潮湿条件下弹性模量的值低于测量值在干燥状态,显示更大的兼容性与心肌组织的力学特性刚度。mono -和双层系统显示机械特性符合本地的各向异性和心肌E′值,特别是在潮湿的条件下样品刚度往往变得更加与人类心肌测量舒张末(0.2 - -0.5 MPa)呈现支架适合心脏应用程序(33]。

微结构PLGA /明胶70/30系统,单层和双层,受到退化分析三个不同的媒体:MilliQ水,PBS,培养基(DMEM)。的分析进行了6个月的时间,在固定的时间;评估孵化介质的pH值、体重测量,和形态分析的样本被降解。在图5(一个)的退化,pH值测量了在不同时期三个不同孵化媒体所示。

测量至少重复三次,每个样本在不同时期的分析;在水中的pH值测量在60天内完成自材料几乎完全失去了它的原始结构。从图可以看出明显和快速降低pH值在水中后发生降解,而缓冲溶液的pH值测量值(PBS或DMEM)减少更多的适度;这个结果证实nonmicrostructured材料的结果。在图5 (b)减肥的结果分析样本PLGA /明胶经过7天的培养在三个不同的媒体报道。人工生物系统获得的值相比纯PLGA系统。可以注意水和PBS纯PLGA的重量损失高于注册的人工生物系统;相反检测中没有发现区别纯PLGA与PLGA /凝胶DMEM孵化后,提供证据表明,明胶是强烈的释放减少培养基。

因此,更高的稳定系统的PLGA /明胶培养基可以观察到,一个条件更类似于生理,与其他两个媒体相比,减肥和百分比值较低的pH值不低于6即使完全退化。

比较系统的扫描电镜图像与培养基接触(图之后6(一))在不同降解时间,可以观察到后7天内表面结构几乎不变,15天后一些疏在场,虽然整体biomatrix是保存完好的表面结构。在30天内出现重大变化的结构变形是显而易见的。它是重要的,然而,要注意维护缩微成像,救济和空腔尺寸没有明显的变化。30天后,矩阵进行结构的崩溃,但重要的是,倾向于保持原始几何的印记。

在图6 (b)后,SEM图像样本的PLGA /明胶降解PBS报告;更快速侵蚀后的矩阵与PBS以DMEM相比是很明显的。在第一形象,指的是样品在PBS的7天之后,已经有了一些明显的疏密度的表面在DMEM类似疏15天的潜伏期后开始出现。结构经历了崩溃后15天,30天内损失的图像显示的结构由片段取代矩阵本身。最后,获得的图像的PLGA /明胶系统接触后再蒸馏的水(图6 (c)),可以确定更快速降解动力学比biomatrices接触培养基相同。如果在7天内结构仍然完好无损,15天后扫描电镜图片显示了一个两层的结构似乎渗透虽然缩微成像仍明显。最后,在30天内,矩阵是变形和概要文件的行更不规则。

3.2。干细胞生长和对齐在PLGA /明胶心肌支架

hMSCs从事这项工作是检测CD105, CD29、CD44, CD90、和存在和消极CD34、CD45、HLA-DR,确认他们的纯洁;其分化潜力到骨细胞和脂肪细胞谱系也证实(数据未显示)。hMSCs培养在微结构PLGA /明胶支架,和细胞形态和生存能力监控多达15天使用Calcein-AM染色文化。

进行生物相容性的初步研究,支架与不同的PLGA /明胶的比例,表现出积极的干细胞的行为(数据未显示)。然而,PLGA /明胶70/30成分被选为其体外拉伸测试后最好的力学行为。

这些生物相容性实验被进行单层和双层支架,基于PLGA /明胶70/30比率,获得类似的结果,因为这个原因结果记录通过代表图像的两种类型的支架。在最初几个小时从细胞播种的一些细胞开始伸展,使支架内相互平行车道。这种行为很明显从汽车/ TPEF 3 d重建细胞以绿色显示,而支架是蓝色的(图成像7(一)一个代表重建)。

之后,在第一个24小时,所有的细胞都采用了拉伸形态和排列以类似的方式相互平行本机心肌细胞组织(图7 (b))。这个形态构象是保持,直到一天15(图7 (b)(图)以及一个保存细胞骨架组织7 (c))。3 d重建记录活细胞在支架厚度的能力已经在早期的时间(24小时)(图7 (d))。

量化hMSC粘附和生长支架,CellTiter-Blue化验。高百分比的附着力已经登记在单层和双层组织支架(5.3±43.2%±10.7和43.3%,职责)。扩散分析表明,细胞能够增殖PLGA /明胶支架在第四天,成倍增加为1.58±0.08,之后,细胞没有任何进一步明显增长类型的支架(图7 (e)和数据未显示)。尽管逮捕、增殖细胞似乎维持一个最佳的生存能力对整个文化的时间(图7 (b))和具体分析的细胞伸长证实hMSCs达成伸长与2 d控制文化在第二天,然后白天出现进一步伸展(图87 (f)虽然没有统计学意义的方式。这些结果表明,hMSCs培养组织PLGA /明胶支架实现良好的附着力和脚手架殖民,维护整个文化。

3.3。Cardioinductivity的PLGA /明胶心肌支架

评估是否微结构支架上的文化影响基因表达在hMSCs qPCR执行对选定的基因被认为与具备干细胞(工具包)或早期cardiomyogenesis (Gata4 Mef2c)和他们的表达是评估相比,二维控制文化。具备干细胞标记物的表达工具强烈downmodulated已经2天在hMSCs培养单层组织支架(对应于−4.47±0.09)。另一方面,早期心脏中特定的转录因子,Mef2c前upmodulated (对应1.88±0.26 2天)虽然Gata4转录水平的增加,其表达式中无法在2 d控制文化,开始明显发现后15天(对应6.33±0.43)(图8(一个))。

然后,我们评估如果mRNA转录水平的增加是重要的足以推动特定组织家族蛋白表达。如图8 (b),15天后文化在微结构支架hMSCs显示具备干细胞标记物的表达降低c - kit如果相比,相同的细胞在2 d文化中,虽然早期心脏转录因子的表达GATA-4收购,确认qPCR结果。然而,这些支架的静态文化不相关联的有条纹的心脏收缩的组织蛋白,从而排除了诱导这些细胞的完整sarcomeric重排。

的能力,这些结果显示PLGA /明胶微结构支架直接初始hMSC血统对cardiomyogenesis规范,已经很早的时候,在没有任何外界刺激。

4所示。讨论

我们制作的微结构人工高分子结构的PLGA /明胶模仿各向异性心肌的结构和力学性能。PLGA /明胶支架提升附着力,下令处置和早期心肌的承诺hMSCs仅表明这些结构,没有任何外部的刺激,可以用干细胞相声精确和控制的方式。我们的体外降解试验表明良好的和控制生物材料降解动力学表明使用PLGA /明胶构建可行的心肌的修复。在文献中报道,PLGA支架能吸收区域心室壁应力,防止心肌梗塞前PLGA退化(27]。

在本文中,我们表明,hMSCs培养组织PLGA /明胶支架展览大量逮捕在早期(4天内)和这个同事cardiomyogenic分化过程的开始。强调获得差异化是很重要的,虽然在初始水平,心脏表型的hMSCs生化或机电的完全没有刺激和由于只有刺激引起的内在形态和支架的物理化学性质,仍然是一个重要的挑战和创新的方面。这种行为已经观察到的系统PHBHV /明胶(33],方差,我们之前显示hMSCs培养PHBHV /明胶支架携带类似的微结构扩散时间更长时间和开始分化过程之后才15天(33]。有几种可能性来解释这种不同的细胞行为PHBHV至PLGA-based支架包括分子聚合组件之间的交互,力学性能,主要降解机制。观察到的差异可能是由于聚合物支架的组成。第一个关键要素是合成聚合物之间的分子间相互作用和明胶的构象变化导致生物组件从随机线圈collagen-like结构(33,39,40]。我乐队的酰胺反褶积的研究红外光谱化学成像显示了乐队的α三重螺旋,螺旋β表结构。然而,对于系统的基于PLGA乐队有关的流行α对螺旋结构β观察表。这些特定的构象变化的蛋白质组件,由分子间相互作用与PLGA,在接口与细胞可能导致ECM的微分表达蛋白质,因此可能刺激早期干细胞分化过程(41]。除了乐队走向低频率比系统观察PHBHV /明胶表明更大容量的PLGA-based系统形成氢键,增加材料的整体界面表面亲水性降低能源结构。定制修改的表面能和化学构造可以引出特定绑定的博览会网站能够调节分化过程(42]。

另一个考虑是,分子间相互作用发生的人工生物系统改善力学行为对纯合成聚合物的刚度的降低。即使刚度矩阵进行干细胞的直接影响到一个特定的谱系尚未评估,许多研究已经证明,修补材料的力学性能基本在支持细胞分化和传播(11]。心脏补丁的弹性应与本机心室壁(43]。然而,基于天然聚合物支架拥有过低杨氏模量,虽然纯合成支架,表现出更高的刚度,可以诱导细胞的去分化(26,44]。一项有趣的研究指的是一系列的PCL的可能影响基板具有相同化学但变刚度(1 - 133 MPa)心肌细胞的行为。PCL支架与杨氏模量(0.91 - -1.53 MPa)被发现诱导成熟心肌细胞与增强机电耦合,而硬PCL支架为49.67 MPa诱导不成熟的心脏基因的表达像nkx - 2.545]。我们在这里提出了一种人工脚手架在中尺度与复杂的物理化学和结构属性导致应力-应变曲线明显不同于那些可以获得密度和化学同质样本(46]。此外,微观结构,而不是PLGA /明胶支架显示较低的储能模量和应力应变比在30%,如果PHBHV /明胶支架相比,更接近本机心脏组织(47]。另外的PLGA /明胶结构保持各向异性力学性能已经显示PHBHV /明胶支架纵向方向的储能模量的值高于沿横向方向,反映了心肌组织的各向异性。干细胞播种在PLGA /明胶支架可能因此获得重要的机械刺激,将有助于他们早些时候cardiomyogenic分化。

最后,干细胞的行为可以强烈影响支架降解动力学。微观结构,而不是PLGA /明胶支架显示快速发布矩阵形成的凝胶孔隙度适合更快速殖民后干细胞相同的细胞收到初始cardioinductive刺激。这刺激的分子相互作用和协同的微观结构保持即使侵蚀和溶蚀已经先进的过程就是明证GPC和SEM的结果。需要注意的另一个方面是,虽然整体退化的材料是由明胶的存在加速的,从的角度来看pH值,明胶的存在降低pH值降低避免酸中毒的过程可以被激活从而影响细胞行为。干细胞的机制应对材料固有的特点是高度复杂和多元。很可能退化副产品在早期阶段的存在有助于触发特定干细胞的信号环境。即使降解产物含有酸性功能,一些作者(48)注意到,他们能够诱导平滑肌细胞的有丝分裂和分化。此外,暴露的羧基和羟基源自PLGA酯水解可以激活绑定的细胞粘附蛋白这反过来可能会增加细胞粘附。无毒浓度降解的副产品导致细胞增殖和快速减少人类成骨细胞的细胞分化,尽管这种效应导致有害的对于骨科应用程序,为我们的系统和应用程序可能证实了触发分化过程中降解产物的影响(49]。此外,制造人工生物系统的组织形式使支架(mono -或双分子层)在降解过程中更稳定的pH值和表面形貌,尤其是在接触DMEM对水或PBS。这个结果可能被视为积极的考虑,培养基是一个环境更接近真正的一个。此外,早期的hMSCs心原性的承诺是一个优势特别是考虑到的快速降解PLGA-based系统移植片的融合与本地心肌发生在更短的时间快速新组织的再生。

我们还表明,hMSCs播种在PLGA /明胶支架加强Mef2c基因表达在早期文化的时间(2天),这个表达式在以后维护(3 - 15天)规模,并关联到一个重要的增长Gata4基因表达。Mef2c是一个重要的转录因子在早期心脏分化阶段也起着基本的作用在后来分化的步骤通过调节Gata4表达式。事实上,心脏前体缺乏Mef2c维持Gata4表达式只在早期分化阶段;然后细胞失去Gata4这损失预防功能的心肌细胞形成50,51]。此外,反过来新兵Mef2c Gata4是Gata4共激活剂在心肌细胞和他们一起合作来激活其他心脏启动子(52,53]。我们目前的数据符合之前的发现,同时支持严格的这两个基因之间的相关性和Gata4 Mef2c的积极的监管效果。

5。结论

微结构PLGA /明胶支架形式的单链不饱和脂肪或是双层模拟各向异性结构和机械性能的心肌产生和被发现促进粘附,长期生存能力,并下令hMSCs处置。hMSCs培养在PLGA /明胶支架展出大量逮捕在早期,这是与cardiomyogenic分化过程的开始。体外降解试验表明良好的和控制生物材料降解动力学表明使用PLGA /明胶构建一个可行的心肌的修复。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

研究导致这些结果已收到资金从P.O.R. F.E.S.R.,2007/2013 of the Regione Piemonte “bando 2008 Piattaforme Innovative Biotecnologie,” under grant agreement no. 14557, and from Mi.S.E.-ICE-CRUI, 2010.

引用

1. j . Leor n .兰达和s·科恩,“受伤的改造与心肌组织工程心脏,”心血管治疗的专家审查,4卷,不。2、239 - 252年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. s . Jana b . j . Tefft d . b .勺子和r·d·Simari”为组织工程心脏瓣膜支架,”Acta Biomaterialia,10卷,第2893 - 2877页,2014年。视图:谷歌学术搜索
3. D.-H。金·e·a·Lipke p . Kim et al .,“纳米级信号调节宏观心脏组织的结构和功能结构,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷107,不。2、565 - 570年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. m·m·史蒂文斯和j·h·乔治,”探索和工程细胞表面界面”,科学,卷310,不。5751年,第1138 - 1135页,2005年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. h .公园,c·坎尼扎罗g . Vunjak-Novakovic r·兰格c·a·文森提和o . c . Farokhzad“纳米制造和精密加工的功能材料,组织工程,“组织工程,13卷,不。8,1867 - 1877年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. n . Bursac k·k·帕克,s . Iravanian和l .东”两者文化控制的宏观各向异性:功能性心肌的电生理研究,模型”循环研究,卷91,不。12日,pp. e45-54, 2002年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. s . m .格帕兰c . Flaim s . n . Bhatia et al .,“各向异性stretch-induced在新生儿心室肥大细胞微型图象变形弹性体,”生物技术和生物工程,卷81,不。5,578 - 587年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. t . o . Ishii m . Shin Sueda, j . p .文森提“体外组织工程心脏移植的使用可降解支架与细胞外矩阵像地形、”胸心血管外科杂志》上,卷130,不。5,1358 - 1363年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. c·g·c·Engelmayr Jr . m . Cheng j .赌博j·t·伯伦斯坦r·兰格和l . e .释放“折叠-就像蜂窝组织工程心脏各向异性的,”自然材料,7卷,不。12日,第1010 - 1003页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. 荣格,k . m . Panchalingam r·d·Wuerth l·罗森博格和洛杉矶Behie,“大规模生产人类间充质干细胞的临床应用,”生物技术和应用生物化学卷,59号2、106 - 120年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. a . j .断森,h·l·斯威尼d·e·迪斯凯尔,“弹性矩阵指导干细胞谱系规范”细胞,卷126,不。4、677 - 689年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. e . k . f .严、s . w .彭日成和k·w·梁”合成纳米结构的人类间充质干细胞诱导分化为神经元血统,”实验细胞研究,卷313,不。9日,第1829 - 1820页,2007年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. k . Kurpinski j .楚c推出,李,“各向异性mechanosensing间充质干细胞,美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷103,不。44岁,16095 - 16100年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. m . c . y .泰h . Yu Pal et al .,“微型图象矩阵指导人类间充质干细胞向心肌谱系分化,“实验细胞研究,卷316,不。7,1159 - 1168年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. r . McBeath d . m .而言,c . m·纳尔逊·k . Bhadriraju和c . s . Chen”细胞形状、细胞骨架张力和RhoA调节干细胞谱系承诺,“细胞发育》第六卷,没有。4、483 - 495年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. n . Faisant j . Akiki f . Siepmann j . p . Benoit和j . Siepmann”类型的释放介质对药物释放的影响从PLGA-based微粒:实验和理论,“国际制药学杂志,卷314,不。2、189 - 197年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. x鑫、m·侯赛因和j·j·毛,“持续的人类间充质干细胞的分化和诱导chondrogenic和成骨的血统实际上电纺PLGA纳米纤维支架,”生物材料,28卷,不。2、316 - 325年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. c . m . Agrawal和r·b·雷”对肌肉骨骼组织工程生物可降解的高分子支架上,”生物医学材料研究杂志》上,55卷,不。2、141 - 150年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. k . a . Athanasiou g·g·尼德奥尔,c . m . Agrawal”杀菌、毒性、生物相容性和临床应用的聚乳酸/聚乙醇酸共聚物,”生物材料,17卷,不。2、93 - 102年,1996页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. W.-J。李,c . t . Laurencin e . j . Caterson r . s .老爷和f . k . Ko,“实际上电纺nanofibrous结构:一种新颖的用于组织工程的支架,”生物医学材料研究杂志》上,60卷,不。4、613 - 621年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. t . a . Telemeco c·艾尔斯g . l . Bowlin et al .,“细胞渗透调节到组织工程支架由亚微米直径的纤维由电纺的,”Acta Biomaterialia,1卷,不。4、377 - 385年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. t·g·金和t . g .公园,“仿生细胞外基质:细胞粘附RGD肽修改实际上电纺聚(D, L-lactic-co-glycolic酸)纳米纤维网状,”组织工程,12卷,不。2、221 - 233年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. 马f . b . Li Li l . et al .,“保利(lactide-co-glycolide) /纤维蛋白凝胶结构的3 d模型评价基因治疗软骨体内,”分子制药学,11卷,不。7,2062 - 2070年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. K.-I。金,美国公园,G.-I。Im,“成骨分化和血管生成与cocultured脂肪基质细胞和骨髓基质细胞,”生物材料,35卷,不。17日,第4804 - 4792页,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. p . t . Thevenot a . m . Nair j .沈p . Lotfi彭译葶。Ko, l .唐“SDF-1整合的影响α在PLGA支架干细胞招聘和炎症反应,”生物材料没有,卷。31日。14日,第4008 - 3997页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. x宗庆后,h .好,彭译葶。钟et al .,“实际上电纺fine-textured支架心脏组织结构。”生物材料,26卷,不。26日,第5338 - 5330页,2005年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. 问:周,J.-Y。周,z .郑张h, s。胡”,小说血管修补提高细胞生存和修改心室重构在大鼠心肌梗死模型中,“胸心血管外科杂志》上,卷140,不。6、1388. e3 - 1396页。2010年e3。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. Sarig和m . MacHluf”工程为心肌再生细胞平台”,生物治疗专家意见,11卷,不。8,1055 - 1077年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. R.-K。李,t·m·邱r . d . Weisel et al .,“建设生物工程心脏移植,”胸心血管外科杂志》上,卷119,不。2、368 - 375年,2000页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. m·l·麦凯恩,a . Agarwal h·w·Nesmith, a . p . Nesmith和k·k·帕克,“Micromolded明胶水凝胶为扩展的文化改造的心脏组织,”生物材料,35卷,不。21日,第5471 - 5462页,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. m·h·雅库巴和j . Terrovitis“西皮奥墨丘利的节杖,ALCADIA:细胞疗法试验使用cardiac-derived细胞心肌梗死后患者LV功能障碍,仍在继续发展,”国际心脏病学科学和实践卷,2013年,页3 - 5,2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. a . Navaei h·赛w·克里斯坦·r·t·沙利文r . Ros和m时,“黄金nanorod-incorporated gelatin-based导电水凝胶工程心脏组织结构,“Acta Biomaterialia41卷,第146 - 133页,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. c . Cristallini e . c . Rocchietti l . Accomasso et al .,“人工构造的影响,模拟心肌结构和生物力学性质干细胞承诺对心脏血统,”生物材料,35卷,不。1,第104 - 92页,2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
34. e . Rosellini g . Vozzi n . Barbani p Giusti和c . Cristallini”三维microfabricated支架与心脏细胞外矩阵像架构,”国际期刊的人造器官,33卷,不。12日,第894 - 885页,2010年。视图:谷歌学术搜索
35. 诉Minieri s Saviozzi g . Gambarotta et al .,“持续的DNA损害过早衰老改变了人类骨髓间充质干细胞的功能特性,”细胞和分子医学杂志》上,19卷,不。4、734 - 743年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
36. l . Mortati c . Divieto和m . p .天使”汽车和宋惠乔显微镜遵循人类角膜成纤维细胞和胶原蛋白生产间充质干细胞在纤维蛋白水凝胶三维文化中,“杂志的拉曼光谱,43卷,不。5,675 - 680年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
37. j . Schindelin Arganda-Carreras,大肠毛圈绒头织物et al .,“斐济:生物图像分析的一个开源平台,“自然方法,9卷,不。7,676 - 682年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
38. 诉h . Segtnan伊萨克松t,“温度、样品和与时间有关的明胶凝胶的结构特点研究了近红外光谱,”食品凝胶,18卷,不。1、1 - 11,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
39. c . Petibois g . Gouspillou k .赫贝j。Delage, g . Deleris”类型的分析我和静脉注射胶原蛋白通过红外光谱和成像的分子调查骨骼肌肉结缔组织,”分析和分析化学,卷386,不。7 - 8,1961 - 1966年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
40. k . Gelse大肠Poschl, t . Aigner Collagens-structure、功能和生物合成,“先进的药物输送的评论,55卷,不。12日,第1546 - 1531页,2003年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
41. C.-W。Chang y黄d·布拉夫曼·t·哈根,c . Phung和s . Varghese“工程测量接口人类多能干细胞的长期扩张,”生物材料,34卷,不。4、912 - 921年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
42. w·l·墨菲,t·c·麦克德维特和a . j .断“材料干细胞监管机构,”自然材料,13卷,不。6,547 - 557年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
43. r .看到美国m . Krishnan, s . Sethuraman”生活心脏补丁:心脏再生的灵丹妙药,”生物治疗专家意见,12卷,不。12日,第1640 - 1623页,2012年。视图:谷歌学术搜索
44. h .公园,m . Radisic j . o . Lim b h . Chang和g . Vunjak-Novakovic”小说复合心脏组织工程支架,”体外细胞和发育Biology-Animal第41卷。。7,188 - 196年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
45. 的强项,s . Pagliari m . Ebara et al .,“衬底刚度调节基因表达和表型新生儿心肌细胞体外,”组织工程部分,18卷,不。17 - 18,1837 - 1848年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
46. 李x l . Cheng太阳,b . et al .,“实际上电纺人参皂苷Rg3 /聚(lactic-co-glycolic酸)纤维涂以透明质酸为修复和抑制肥厚性疤痕,“《材料化学B,1卷,不。35岁,4428 - 4437年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
47. Q.-Z。陈,s·e·哈丁:n .阿里a·r·里昂和a . r . Boccaccini”在心脏组织工程生物材料:十年的研究调查,“材料科学与工程R:报告卷,59号1 - 6,1-37,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
48. s p·希金斯,a . k .塘鹅和l·e·尼克“聚乙醇酸对猪的影响平滑肌细胞生长和分化,“《生物医学材料研究的一部分,卷67,不。1,第302 - 295页,2003。视图:谷歌学术搜索
49. f·梅耶,j . Wardale美国最好,r·卡梅伦n .拉什顿和r·布鲁克斯“乳酸和羟基乙酸的影响人类成骨细胞:一种理解PLGA参与PLGA /磷酸钙复合失败,”骨科研究期刊》的研究,30卷,不。6,864 - 871年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
50. y Hinits, l, c·沃克,j .多德c·b·摩恩和s·m·休斯“斑马鱼Mef2ca和Mef2cb是必不可少的两个第一和第二心脏心肌细胞分化领域,“发育生物学,卷369,不。2、199 - 210年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
51. c . Karamboulas g . d . Dakubo j .刘et al .,“破坏cardiomyoblasts抑制cardiomyogenesis MEF2活动”,《细胞科学,卷119,不。20日,第4321 - 4315页,2006年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
52. 莫林,f . Charron、l . Robitaille和m . nem”MEF2蛋白质GATA-dependent招聘目标启动子”,在EMBO杂志,19卷,不。9日,第2055 - 2046页,2000年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
53. e . Dodou m . p . Verzi S.-M j·p·安德森。徐,b . l .黑色“Mef2c直接目标ISL1和GATA转录因子在小鼠胚胎发育在前心领域,“发展,卷131,不。16,3931 - 3942年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2016 Caterina Cristallini等。这是一个开放的分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。