人脐带血衍生CD133⁺/ c-kit⁺林/^-细胞具有分化成间充质干细胞和产物内皮细胞的双向能力

抽象的

最近的证据表明，来自骨髓和脐带血的单核细胞(MNCs)可以分化为间充质干细胞(MSCs)或外生内皮细胞(OECs)。然而，关于跨国公司是否具有多能分化成MSCs或OECs的能力，或者是由细胞系决定的MSCs或OECs的前体的混合物，存在争议。在这里,使用CD133⁺/ c-kit⁺林/^-使用磁性电池分选从人脐带血液中分离的单核细胞（CKL-细胞），其特征在于MNC分化的效力。我们首先发现，通过细胞对细胞接触诱导了用分化为OECs或MSCs的病原体或MSCs的条件培养基培养的CKL细胞和这种分化。当我们在OEC-或MSC条件培养基上培养单一CKL-细胞时，细胞分别在形态学上分化为形态学，并分别分化为OEC-或MSC样细胞。此外，我们确认从CKL-细胞分化的OEC或MSCs具有在基质素中形成毛细管样结构，并分化成骨细胞，软骨细胞和脂肪细胞。最后，使用微阵列分析，我们确定了可能涉及CKL-细胞分化命运的OECS或MSC的特定因素。这些结果表明，脐带血血液衍生的CKL-细胞具有至少对MSC或OEC的混合性分化能力。

1.介绍

干细胞是科学研究的当前焦点，由于其可塑性和丰富的自我更新能力，并能分化成一个或多个承诺的后代，包括功能齐全的成熟细胞[1］.干细胞可以分为许多细胞类型，例如心肌细胞，血管细胞，神经元和肝细胞，两者体外和体内．因此，再生医学成为心肌梗塞、血管疾病、运动神经元疾病、神经退行性疾病、肝脏疾病等退行性疾病的潜在治疗方法[2-7.］.根据其来源分类，干细胞可以是胚胎干细胞，组织特异性干细胞，间充质干细胞（MSCs）或诱导的多能干细胞。由于胚胎干细胞的使用因伦理问题而受到限制，因此特异性干细胞，MSC和诱导多能干细胞是组织工程的主要细胞类型。

脐带血液干细胞可以分化为内皮细胞或MSCs体外和体内并改善运作不佳的器官[8.-10］.有两种类型的从人外周血，内皮祖细胞和生长的内皮细胞（嗅鞘细胞），培养的内皮细胞的显示出相当的血管生成能力[11］.OECs具有过度的潜力，可能潜在地通过与内皮祖细胞移植进行移植的血管生成疗法[12那13］.虽然MSCs能够分化为不同结缔组织谱系的细胞，如骨、软骨和脂肪组织[10[衍生自人脐带血为MSCs或OECs的干细胞的区分的机制尚不完全理解。

为了确定脐带血衍生的单核细胞（MNC）是否具有将含有MSC或OEC分化的能力，或者是含有MSC或OECs的细胞谱系确定祖细胞的细胞的混合物，我们表征了CD133的分化效力⁺/ c-kit⁺林^-使用磁性活性细胞分选从人脐带血液中分离的MNCs（CKL-细胞）。当在MSC或OEC条件培养基上培养CK1-细胞时，它们优选分别分别分析到MSC或OEC中。具有OECS或MSCs的CKL-细胞的直接共培养还诱导它们分化为OECs或MSCs，其能够在基质胶中形成毛细管样结构或分化成骨细胞，软骨细胞或脂肪细胞。此外，使用微阵列分析，我们确定了可以指导CKL-细胞的细胞命运的OECS和MSC的特定因素。

2。材料和方法

2.1。学习人口和样品收集

在2008年6月至2008年3月至2008年3月期间，在妊娠37-41周的叙述中仅由剖宫产分部进行的交付。在胎儿驱逐后递送时获得用于CK1细胞分离的脐带血。在研究之外，不包括与膜过早破裂，胎儿畸形，染色体异常，多重妊娠，先兆，高血压或肾病或内分泌疾病的怀孕。通过患者的同意进行了研究目的的测验和使用医疗记录。本研究由延世大学医院审查委员会批准（4-2005-0186）。

2.2。分离和培养CKL-细胞

我们从人脐带血中分离内皮祖细胞。通过重力流动从带有附着的脐带的新鲜胎盘收集血液样品（〜50ml）。用密度梯度离心在Biocoll（Biochrom，Berlin，German）的密度梯度离心30分钟以400×g分离MNC，并在磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Biochrom）中洗涤三次。用抗CD133 / C-kit / Lin通过阳性和阴性选择纯化CKL-细胞^-microbeads (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Germany)使用磁性电池分选设备(Miltenyi Biotec)。简单地说，将脐带血跨国公司与抗cd133微珠孵育，通过细胞清洗去除无结合抗体。根据制造商的说明，用抗cd133微珠孵育的细胞进行阳性选择。CD133+片段与anti-C-kit微珠孵育，进行敏感阳性选择。为了耗尽CD133+/C-kit+馏分中的Lin+细胞，细胞与抗Lin微珠孵育并应用于柱上。冲洗并收集未结合的细胞。这部分是CD133+/C-kit+/Lin−。通过荧光活化细胞分选分析，纯度为>98%。CKL−细胞在内皮基础培养基2 (Clonetics, Cell Systems, St. Katharinen, Germany)中接种于涂有人纤连蛋白(Sigma, St. Louis, MO)的6孔板。在培养基中加入内皮生长培养基2 (EGM-2; Clonetics, Cell Systems) containing fetal bovine serum, human VEGF-A, human fibroblast growth factor-B, human epidermal growth factor, IGF1, and ascorbic acid in appropriate amounts. CKL− cell identification was determined by staining cells with phycoerythrin- (PE-) conjugated human antibodies CD133-PE and C-kit-PE (BD Biosciences, Bedford, MA).

2.3。CKL-细胞分化测定

ckl-细胞（5×10^5.将细胞/孔）在6孔板上接种并在OEC-或MSC条件培养基中培养（100％EGM-2（对照），12.5％调理培养基+ 87.5％EGM-2，25％条件培养基+ 75％EGM-2，或50％条件培养基+ 50％EGM-2）。培养基每2天改变。将分化的日子定义为从播种时观察到差异化菌落的第一天。对每个样品进行至少三个测定。

CKL-细胞与绿色荧光蛋白（GFP-）转染的OECs或MSCs共有共同化。在文化中3天后，GFP^-OECS或MSCs开始出现在GFP中⁺近年或msc。绿色荧光蛋白^-通过免疫荧光染色对Ve-CAD抗体和α-平滑肌肌动蛋白的免疫荧光染色（α-SMA）分别。

在培养5天后，收获CKL细胞，在细胞培养基中稀释至约1个细胞/ 100 μL，并在96孔细胞培养板中回复。24小时后，将培养基变为OEC-或MSC条件培养基（50％）。在第4天，定义分化细胞并在24孔中进一步膨胀，直至细胞数足以进行免疫染色分析。对每个样品进行至少三个测定。

２.４.半定量rt - pcr分析

总RNA从CKL-细胞，嗅鞘细胞，并用TRIzol试剂的MSC获得。RNA样品（0.5-5 μ克）用于RT-PCR。Briefly, target RNA was converted to cDNA by treatment with 200 units of reverse transcriptase and 500 ng oligo(dT) primer in 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂那10 mM dithiothreitol, and 1 mM dNTPs for 1 h at 42°C. The reaction was quenched by heating for 15 min at 70°C. OneμC cDNA混合物的L用于PCR扩增。PCR反应含有50mM KCl，10mM Tris-HCl（pH8.3），1.5mM MgCl₂，0.2 mm dntps，2.5单位Taq.DNA聚合酶，0.1μM的引物。在模型PTC-200热循环器中进行放大，条件如下:94°C变性5 min，第一个循环30 s, 55°C退火30 s, 72°C延伸30 s, 28个重复循环。最后的伸展步骤在72°C下进行10分钟。每个实验都有四个重复。所使用的引物见补充材料中的补充表S1http://dx.doi.org/10.1155/2016/7162160．

2.5。CKL-细胞，嗅鞘细胞，间充质干和免疫荧光染色

将细胞固定在4％多聚甲醛中20分钟，透明于0.1％Triton X-100 / PBS，然后用含有5％正常山羊血清的PBS和0.05％Tween-20组成的阻断溶液预孵育。然后将细胞在一抗[小鼠抗CD133，抗C-kit，抗VWF，抗CDH5（Ve-Cadherin）中孵育2小时，抗CDH5（Ve-Cadherin），抗 -α-sma或防PDGFRβ(BD pharingen, San Diego, CA)]。用FITC/ tritc标记的抗人二抗(Vector Laboratories, Burlingame, CA)观察反应。所有样品用荧光显微镜(Olympus, Tokyo, Japan)观察。

2.6。成骨测定

汇合的MSC 10天在DMEM低葡萄糖培养基中，用10％胎牛血清，1X GPS，和成骨补充培养（1 μm dexamethasone，10毫米β磷酸甘油和60 μM抗坏血acid-2-phosphate)。von Kossa染色观察骨细胞分化情况。

2.7。软骨形成分析

将MSCs悬浮液转移到15ml聚丙烯离心管(50万细胞/管)中，轻轻离心。结果的微球在DMEM高糖培养基中静态培养，添加1x GPS和软骨生成补充剂(1x胰岛素-转铁蛋白-硒，1μ地塞米松,100μM抗坏血酸-2-磷酸，和10ng / ml TGF-β1）。14天后，将颗粒固定在4％缓冲福尔马林中，过夜，嵌入石蜡，并分成（7 μm）。通过Safranin-O染色评估进入软骨细胞的分化。

2.8。脂肪发生分析

汇合MPC在DMEM低葡萄糖培养基中培养10天，具有10％FBS，1x GPS和脂肪生成补充剂（5 μg / ml胰岛素，1 μM地塞米松，0.5mM异丁基甲基黄嘌呤和60 μ吲哚美辛)。油红O染色检测脂肪细胞分化情况。

2.9。寡核苷酸微阵列

总RNA（10 μG）杂交至Hg-U133A 2.0微阵列（54675人基因; Affymetrix，Santa Clara，CA），用于制造商的样品制备和微阵列加工。使用MicroArray Suite 5.0版（Affymetrix）和Genplex V2.4软件（Istech Inc.，韩国，朝鲜民共和国）分析表达数据。

2.10。统计分析

数据显示为平均值±标准错误（SE）。使用单向分析的差异进行统计比较，然后进行Tukey的Hoc测试。

结果

3.1。将人脐带血的CKL-细胞分化为OECs或MSCs

使用密度梯度将MnC级分与脐带血分离，并将CKL-MNC分选并纯化（图1（a））。CKL-细胞的细胞表型，通过RT-PCR证实和免疫染色CD133和c-kit（图1（b））。后在嗅鞘细胞或MSC分化的培养条件下10天后，CKL-细胞自发分化为嗅鞘细胞或MSC通过细胞形态和的谱系特异性标志物的表达（图所证实1（c）和1（d））。

３．２．CKL−细胞具有取决于环境因素的多系分化潜能

为了研究环境是否调节CKL-细胞分化，CK1-细胞与GFP + OEC或MSC共同化。具有GFP和具有RFP的GFP和CKL细胞的OEC或MSC的双重标记是理想的实验模型;然而，GFP或RFP感染进入CKL-细胞诱导来自板块的CKL-细胞的显着分离，我们无法继续进行实验。因此，我们只用GFP-慢病毒标记了OEC或MSC，并通过非标记的CKL细胞与非标记的CKL细胞进行了共同化。CKL-细胞分化为与细胞特异性标记的免疫荧光染色证实的相同细胞谱系的细胞作为细胞，如图所示2（a）和2（b））。这些结果表明，本地环境确定CKL-细胞的分化规范。

接下来，以剂量依赖性方式在OEC-或MSC条件培养基上培养CKL-细胞，以评估可溶性因子对分化的影响。与对照条件相比，在调节培养基上培养的CKL细胞中，在调节培养基培养的CKL细胞中显着降低了达到分化的长度，表明OECS或MSCs产生的可溶性因子加速CKL-细胞分化（图3（a）和3（b））。此外，GFP + CKL-细胞与OECS或MSCs分化为OECs或MSCs，如通过Ve-Cadherin的免疫荧光染色确认α-sma分别（数字3（c）和3（d））。

ckl-细胞没有增殖体外培养条件。因此，为了进一步确定CKL-细胞是否具有分化成多种谱系依赖于环境线索的电势或与朝向嗅鞘细胞或MSC，单个GFP +细胞CKL-上OEC-或中培养monolineage分化潜能的细胞的混合物MSC条件培养基（图4.（a）和4.（C））。在第4天，93.2％的培养在OEC条件培养基上培养的细胞和97.4％在MSC条件培养基上培养的细胞分别显示出OEC和MSC表型（图4.(e))。通过VE-cadherin或VE-cadherin免疫荧光染色证实GFP+ OECs或MSCs的分化表型α-sma分别（数字4.（乐队4.(d))。众所周知，慢病毒与宿主细胞基因组整合并维持较长时间。因此，许多研究人员使用GFP -慢病毒进行细胞追踪。然而，细胞在多次传代过程中会失去慢病毒的GFP -荧光。在我们的实验中，分化的GFP+单细胞被扩增，直到细胞数量足够免疫染色，在此过程中部分细胞失去了GFP。因此，在GFP阳性细胞中也存在一些GFP阴性细胞(图)4.（乐队4.(d))。

基于这些结果，最大为93.2％（=）CKL-细胞具有犬素分化潜力。结果，CKL-细胞有可能分为OECS和MSCs（图4.(e))。总的来说，这些结果表明CKL-细胞根据环境因素具有多重分化潜力。

3.3。从CKL-细胞嗅鞘细胞和间充质干分化的功能性表征

祖细胞是通过其克隆性和增殖潜能来定义和区分的。我们分析了来自CKL−细胞的OECs和MSCs的增殖动力学。我们首先将从CKL−细胞分化出来的单个OECs或MSCs进行培养皿，以测试它们是否会形成菌落并生长到融合。有趣的是，单个OECs或MSCs的细胞后代在生长到融合之前形成了不同大小的菌落(图)5（a）和5（b））。

接下来测试来自CKL-细胞的OEC是否可以将稀乙酰化的低密度脂蛋白（DIL-AC-LDL）掺入Matrigel中的毛细管状结构，其是内皮细胞的特征。与粘附性CKL-细胞分化的OEC的图像显示稀释剂的均匀掺入和基质素中的毛细血管状结构的形成，类似于血管内皮细胞（图6（a））。

接下来，通过在最佳条件下培养细胞来评估衍生自CKL细胞的MSCs的成静脉潜力。当在成骨条件下进行分化时，MSC的主轴形状衍生自扁平的CKL-细胞，如von Kossa染色所示（图）所示的矿化基质（图6 (b)，左侧面板）。成骨细胞的表型也通过标记基因碱性磷酸酶（ALP），骨钙素（OC），骨桥蛋白（OP），欠幅脉冲相关转录因子2的表达所证明（CBFA1：CF），和I型胶原（胶原I）（图6 (c)，左侧面板）。

此外，通过在无血清软骨培养基中，通过粒状微粉化系统检查衍生自CKL细胞的MSCs的软骨潜力。分化2周后，通过Safranin-O染色来观察硫酸化蛋白多糖的积累（图6 (b)，中间板）。诱导后14天（通过RT-PCR法检测mRNA的聚集蛋白聚糖（AGC）的表达，II型胶原（胶原II），式IX胶原（胶原IX），和Sox9的（S9），这是软骨细胞标记基因，数字6 (c)，中间板）。

最后，在成脂培养基中培养CKL−细胞，以评估MSCs成为脂肪细胞的潜力。油红O染色显示形态变化及中性脂空泡形成(图6 (b)右面板)。标记基因lipoprotein lipase (LPL)、CCAAT/enhancer-binding protein alpha (C/EBP)的表达也检测到成脂表型α），过氧化物体增殖物激活受体γ（PPARγ)、瘦素和脂肪细胞P2 (aP2)(图6 (c)右面板)。

3.4。细胞特异性分子调节CKL-细胞分化对OECs或MSCs

由于CKL-细胞分化命运由细胞培养的条件培养基确定，我们假设OECS和MSCs提供的邻静脉/内分泌因子涉及将CKL-细胞的分化引入特定谱系。为了解决这一点，我们对OECS和MSC之间的基因表达进行了比较分析，以鉴定编码可溶性因子的细胞特异性表达。在OEC中更高度表达的基因是锯齿状1（JAG1），JAG2，胎盘生长因子（PGF），内皮细胞特异性分子1（ESM1），神经突生长促进因子2（MDK），抑制βa（INHBA），生长differentiation factor-3 (GDF3), pre-B-cell colony-enhancing factor 1 (PBEF1), endothelin 1 (EDN1), interleukin 32 (IL32), heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), chemokine (C-X-C motif) ligand 1 (CXCL1), chemokine (C-C motif) ligand 2 (CCL2), CCL14, CCL15, bone morphogenetic protein 2 (BMP2), BMP4, and BMP6, whereas genes expressed more highly in MSCs were wingless-type MMTV integration site family, member 5A (WNT5A), CXCL5, vascular endothelial growth factor (VEGF), CCL20, angiopoietin 1 (ANGPT1), growth differentiation factor 5 (GDF5), and WNT5B (Figure7.）。因此，在微环境中分泌这些细胞特异的因素可能引导向特定谱系CKL-细胞分化。

4.讨论

用于研究目的的茎或祖细胞的主要来源已从骨髓转移到脐带血上，这易于进入，不涉及收集的侵入性程序，可以储存更长的持续时间，并且是免疫的。虽然一旦丢弃的材料，脐带血现在被认为是茎/祖细胞移植和由于其造血和间充质成分的替代来源[14-17］.然而，脐带血样本中感兴趣的祖细胞的产量是可变的，往往不令人满意，限制了它们的治疗用途。为了克服这一障碍，更好地了解脐带血中原始细胞群是优化细胞扩张的必要条件。此外，尽管脐带血跨国公司的分化能力已被广泛研究[18-20.]，很少有人知道跨国公司是否具有多能分化成MSCs或OEC的能力，或者是具有确定MSC或OEC命运的祖细胞的混合物。

以前的研究报告说，成人外周血和脐带血CKL-跨国公司可以产生MSC和嗅鞘细胞[8.那21-26］.始终如一，我们发现从脐带血中纯化的CLK-MNC能够分为MSC和OEC，以证明的生物学体外和体内功能。CKL-MNC的分化命运很大程度上取决于MNC被共同种植的细胞类型或收集其调理培养基的细胞类型。这些发现表明，环境因素，例如来自周围细胞分泌的细胞对细胞接触或可溶性因子，引导CKL-细胞的分化。此外，为了确定CKL-MNC是否是MSC和OEC祖细胞的混合物，或者取决于OECS或MSC的多电容分化能力体内Milieu，我们在MSC或OEC衍生的条件培养基中培养单一CKL-细胞。我们发现CKL-MNCS具有生成MSC和OEC的混合能力，最有可能是由于环境因素的影响。

微环境中的各种线索，如细胞-细胞接触、机械力、可溶性因子和细胞外相互作用，都涉及到干细胞命运决定的步骤[27-30.］.然而，迄今为止，没有很好地研究有助于血小细胞谱系特异性分化的可溶性因素。如我们发现的CKL-MNC差异依赖于诸如特定细胞类型或条件培养基的存在的环境因素，我们假设在MSC或OECs中高度表达的可溶性因子基因可以确定CKL-细胞分化命运。基于基因表达分析，我们发现MSCs显示出WNT5a，CxCl5，VEGF，CCL20，Angpt1，GDF5和WnT5b的高基因表达，而OEC显示JAG1，JAG2，PGF，ESM1，MDK，INHA，GDF3的高基因表达，PBEF1，EDN1，IL32，HBEGF，CXCL1，CCL2，CCL14，CCL15，BMP2，BMP4和BMP6。同样，其他人报告了PGF的上调[31]，ESM1 [32]，gdf3 [33]，cxcl1 [34]，bmp2和bmp4 [35]在脐带血中。以前的研究还表明，MSCs分泌VEGF以促进神经元前体的分化[36那37]和CCL20调节免疫反应[38那39］.JAG1和JAG2是NOTCH配体，已知在各种器官和损伤动脉的血管生成中发挥关键作用[40-44］.此外，我们最近发现内皮基因Delta-like 1 (DLL1)和JAG1的表达与CKL−细胞的分化和血管生成功能密切相关[8.］.然而，虽然这些被发现的分泌因子的特定基因可能直接导致分化，但这些基因表达也可能是分化的结果而不是原因。因此，需要进一步研究这些分子在家族特异性分化中的作用和机制。

总之，脐带血中的CKL-MNC具有分化为MSC和OEC谱系的能力，这取决于特异性的微环境因素。该结果表明CKL-MNC是组织再生的EC和MSC的优异源。

5.结论

本研究表明，人脐带血液衍生的CKL-细胞可以分化为OECs或MSCs，并且具有多线性分化势。微环境诱导CKL-细胞的分化为OECs或MSCs或MSCs产生的可溶因子，或者MSCs加速CKL细胞分化。我们的数据揭示了CKL-MNC的巨大潜力作为组织再生的EC和MSC的优异来源。

相互竞争的利益

提交人声明没有关于本文的出版物的利益冲突。

致谢

本研究由教育部韩国国家研究基金会(NRF)基础科学研究计划(NRF 2014R1A1A2057458, NRF- 2016r1d1a1b03933337)和延世大学医学院教师科研基金(6-2016-0001,6-2014-0044)资助。

补充材料

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