文摘

目的。CD133⁺干细胞再生医学的巨大潜力。然而,低保留受伤组织和大量细胞死亡减少有利影响。为了解决这些问题,我们打算开发一个适当的细胞病毒的系统工程。材料和方法。人类CD133的修改⁺干细胞与磁polyplexes携带微rna研究的效率,安全,针对潜力。结果。microRNA摄取率高(~ 80 - 90%)是实现而不影响CD133⁺干细胞的特性。修改后的细胞可以磁引导。结论。我们开发了一个安全、高效CD133的协议⁺干细胞修改。我们的工作可能成为基础提高干细胞治疗的效果以及与磁共振成像的监控。

1。介绍

干细胞的移植的恢复受损组织再生医学是一个有前途的战略。成体干细胞承担相当大的潜力,因为他们是容易从患者或健康的捐赠者,不会带来伦理冲突1]。其中,细胞表达高度保守的跨膜CD133抗原(prominin-1)代表一个异构干细胞和祖细胞群能够分化成造血的内皮,肌原性的血统2- - - - - -4]。我们和其他人已经表明,他们的再生潜力主要是基于cytoprotective效应及其对新血管形成过程通过差异化的新血管形成和激活proangiogenic信号通过旁分泌机制(5- - - - - -8]。这些细胞的高治疗相关性反映在30多个临床试验批准使用成人CD133 (ClinicalTrials.gov)⁺干细胞治疗各种退化性疾病。例如,非常有前景的结果已报告治疗慢性缺血性心肌病。增加了左心室射血分数(LVEF) 5 - 6%后心肌内的应用程序导致的批准第III期临床研究领域的CD133研究[9- - - - - -13]。然而,尽管快速翻译从基础研究到临床应用广泛的干细胞临床应用仍受到低保留感兴趣的器官和巨大的初始细胞死亡6,14,15]。工程前的细胞移植可以解决所有提到的挑战。为了实现这一目标,安全、高效的开发方式,CD133修改相关改善它们的属性是必需的。

治疗性细胞的保留在感兴趣的网站是一个基本前提条件的一种有效治疗(16]。然而,高灌注器官,如大脑和心脏,90 - 99%的移植细胞通常是失去了在第一次1 - 2 h,独立的细胞类型和应用路线17- - - - - -27]。为了克服这个巨大的冲刷,磁性氧化铁标记干细胞的目标可以应用作为一个创新的策略,加强直接保留,因此提高长期的移植和功能效益(28- - - - - -32]。此外,细胞磁标记可以跟踪和监控使用磁共振成像(MRI) (33小说]或成像形态磁性粒子成像(MPI) [34,35]。

干细胞疗法的另一个主要的限制是大规模移植后细胞死亡由于敌对,目标组织的炎性环境(36]。几个策略也已经被开发出来,以提高移植细胞的生存,包括由缺氧预处理,热休克,或细胞因子治疗37,38]。此外,它已经成功地在各种研究证明凋亡小分子核糖核酸(大鹏)抑制细胞凋亡在体外和增加细胞移植后移植在活的有机体内(39]。大鹏已经被证明是重要的干细胞的命运和行为转化控制器,避免了风险稳定整合到基因组的40]。因此,这些小分子的理想候选细胞工程旨在改善生存。

目前,核酸交付到很难使转染主要干细胞是几乎完全基于重组病毒是迄今为止最有效的工具14,41]。然而,无法控制的基因表达,致病性、免疫原性和插入突变的病毒载体仍然广泛临床翻译的主要障碍41,42]。因此,安全的必要性基因传递方法的发展导致各种病毒的系统是不致病的,nonimmunogenic,不限于传递遗传物质的大小(43]。

如今,表面(PEI)是一种最有效的聚合物米尔交付,促进核酸防止退化,细胞吸收,细胞内释放44]。miR-PEI结构实现的第一个临床试验证明其高生物相容性(45]。在我们组,一个向量设计,由生物素化的裴绑定到streptavidin-coated氧化铁磁性纳米粒子(基于)(图1)。之前进行试验期间,该组织致力于调整向量效率和安全性。在这些研究中,它已经表明,pDNA和米尔可以有效地传递和处理在人类间充质干细胞(hMSCs) [46,47]。

在这项研究中,我们发展一个有效的策略基于magnet-bead米尔交付到高度临床相关的细胞类型,CD133⁺干细胞。首先,我们已经表明,优化转染复合物适合足够米尔交付到骨髓(BM)派生CD133⁺干细胞而不影响干细胞标记表达式和造血的分化能力。此外,我们表明,修改后的细胞可以磁引导在体外。这两个成果一起形成一个进一步的临床前测试的前提条件。

2。材料和方法

2.1。BM标本

BM得到通知捐助者给他们书面同意使用他们的样本研究根据《赫尔辛基宣言》。这项研究是罗斯托克大学的伦理委员会批准于2010年和2015年重新(注册号2010 23)。胸骨BM吸入物得到从接受冠状动脉旁路移植术的患者的心脏手术(德国罗斯托克大学医院)。为了防止凝血,肝素钠(250。/毫升BM)(德国Ratiopharm GmbH)使用。

2.2。CD133⁺细胞隔离

单核细胞(跨国公司)被分层隔离病人派生BM Pancoll人类分离解决方案(德国锅生物技术GmbH)和随后的密度梯度离心法。CD133⁺使用mac CD133细胞磁富集MicroBead工具包(Miltenyi研究GmbH,德国)后,制造商的指示。为进一步的实验,只有CD133⁺细胞分数与可行性和纯度(干细胞表面标记物的表达)高于80%。

2.3。分析解决可行性和CD133的表达干细胞表面标记⁺细胞

细胞生存能力和干细胞表面标记表达式被流式细胞术分析0 h, 18 h和24 h后隔离。染色,样本处理以下抗体:anti-CD34-FITC(克隆:AC136) anti-CD133/2-PE(克隆:293 c3),同形像控制老鼠免疫球蛋白g 2 b-pe (Miltenyi研究GmbH), anti-CD45-APC-H7(克隆:2 d1)和7-AAD (BD生物科学,德国)。减少非特定的绑定,货代阻塞试剂(Miltenyi研究GmbH)是补充道。在4°C孵化了10分钟后,样本测量与LSR-II流式细胞分析仪(BD生物科学)和数据分析与FACSDiva意识到软件(BD生物科学)。评价,布尔控制策略是安排在ISHAGE CD34指南⁺细胞分析(48在下列顺序:(1)步骤1:选择的细胞群(图S1A,在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/7152761)。(2)步骤2:选择CD45⁺细胞(图印地)。(3)步骤3:选择可行的CD45⁺细胞(图就是S1C)。(4)第四步:选择可行的CD45⁺/ CD34⁺细胞(图S1D)。(5)第五步:选择可行的CD45⁺/ CD34⁺/ CD133⁺细胞(图S1E)。

计算细胞生存能力和表面标记完整性是基于以下方程:

2.4。形成Polyplexes和转染

在转染,Cy3™dye-labeled Pre-miR负控制# 1(美国Ambion)交付给检查吸收效率,细胞毒性和磁定位。Pre-miR™microrna的前体分子负控制# 1(美国Ambion)是用于流式细胞术闸门控制,克隆形成单位(CFU)化验,表面标志物表达分析和细胞内可视化的复合物。大鹏都是双链RNA分子设计模拟内源性成熟的microrna。

为了确保有效的绑定streptavidin-coated基于,分子量的支裴25 kDA(美国Sigma-Aldrich)生物素化的使用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin(热费希尔科学GmbH是一家德国)根据制造商的指示和先前的报道49]。微小的变化是在溶剂(水而不是DMSO)和净化法:凝胶排阻层析法与PD-10脱盐列(英国通用电气医疗集团)是用来代替透析所描述的其他地方(50]。胺组的最终浓度是衡量茚三酮测定(2%茚三酮试剂,Sigma-Aldrich)和生物素酰化程度决定更易与生物素/更易与裴皮尔斯在傻瓜化验使用生物素定量工具(热科学)。

链霉亲和素MagneSphere®顺磁性粒子(Promega公司(美国)透过0.45μm Millex-HV PVDF注射器过滤器单元(EMD密理博公司(美国)将更大的聚集和粒子。生物素化的裴和过滤和基于存储在4°C到使用。

polyplexes的形成、米尔和裴在相同体积的5%葡萄糖溶液稀释(德国议员生物医学)适量准备不同摩尔比的裴氮和米尔磷酸(N / P比值)。剧烈的混合后,米尔/裴的解决方案是孵化RT 30分钟。

为了形成磁polyplexes,基于被孵化的超声波浴20分钟之前每次使用去除形成集群。准备的这种方式,和基于混合与先前准备miR /裴复合物在不同浓度的解决方案是孵化在RT 30分钟。

新孤立的5×10⁴CD133⁺转染的细胞被播种24-well板和准备miR /裴或miR / PEI /立即加入了MNP复合物。孵化后18 h在37°C和5%的公司₂杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM锅生物技术GmbH)补充1%的青霉素和链霉素(PAA实验室GmbH,德国)和2%胎牛血清(潘的边后卫,生物技术GmbH),细胞被直接用于测量或新鲜媒介提供的。为了进一步优化CD133的文化条件⁺细胞,在一组测试中,StemSpan™H3000培养基(干细胞技术有限公司、加拿大)补充StemSpan CC100(干细胞技术有限公司)是用于孵化(见图8)。

2.5。转染复合物的吸收效率和细胞毒性

量化的吸收效率和不同转染的细胞毒性复杂的配方,CD133⁺转染后细胞染色18 h 10分钟在4°C /病死®可确定的近红外线死细胞染色工具包(美国分子探针)和固定4%甲醛溶液(FA)(默克Schuchardt OHG,德国)。样品测定与LSR-II与FACSDiva流式细胞分析仪和数据分析软件。代表控制策略如图S2。

转染CD133的定性分析⁺转染后细胞进行了18 h基于Cy3-labeled米尔。为此,细胞被洗一次2%的边后卫在磷酸缓冲盐(PBS,潘生物技术GmbH)为了消除noninternalized粒子和固定4% FA 20分钟。之后,细胞被旋转到盖玻片和PBS再次清洗。然后,盖玻片是安装Fluoroshield™包含DAPI (Sigma-Aldrich)显微镜幻灯片。准备样品受到激光扫描共焦显微镜(40 x油浸)tile-scan模式以获得更大的地区为1062.33μ米×1062.33μm。此外,为了确保完全内化Cy3信号进行了分析,两天记录约7μ米深度。

2.6。磁定位

验证磁和CD133细胞执行目标⁺在优化条件下细胞转染(20 pmol米尔;N / P比值7.5;3和5μg / mL和基于)。18 h转染后细胞转移到12-well板和磁场应用局部使用磁板(OZ生物科学、法国;磁场强度70 - 250 mT和50 - 130 T / m,分别地。(51])。孵化后24小时37°C和5%的公司₂在该地区,细胞数()和(磁铁被显微观察统计使用LSM 780 ELYRA与禅宗2011软件系统和图像文件进行分析(德国卡尔蔡司显微镜GmbH)和ImageJ 1.48(美国国家卫生研究院)。磁靶向比率计算)除以获得细胞数量的两个地区(+米/−米)。

2.7。磁粉光谱学定义磁加载CD133⁺细胞

细胞样品修改条件下定义为最佳转染和磁性细胞指导进行了磁粉光谱学(MPS)量化CD133的磁铁装入⁺细胞与米尔/ PEI / MNP复合物。议员是一个敏感的磁检测方法,允许特定的量化的磁性纳米铁含量不受细胞或悬浮介质(52,53]。孵化后18 h, untransfected(控制)和转染CD133⁺收集细胞,用2%的边后卫在PBS。随后,细胞样品约5×10⁵细胞在PBS resuspended,固定为4% FA,转移到0.2毫升管由商业议员测量设备(力量Biospin,德国)操作在一个磁场= 25吨和频率= 25 kHz。这个设备确定样品的非线性动态磁矩(奇数)谐波的更高。的铁量化样本是由三次谐波议员光谱的对应的归一化MNP的参照样本已知的铁量(3.2μ和2.5 g仅供和基于参考μg的CD133微参考)之前所述54]。第五个比第三次谐波作为特征指纹识别中的磁性纳米颗粒类型样本。

2.8。细胞转染复合物的可视化

复合物的可视化,Pre-miR microrna的前体分子负控制# 1 (Ambion)贴上Cy5™染料使用标签^®microrna的标签工具包(Mirus生物有限责任公司,美国)推荐的制造商的指示。提供冗余的染料被使用净化列。Cy5-labeled米尔最终浓度测量spectrophotometrically NanoDrop nd - 1000年(美国热科学)和样本存储在−20°C免受光直到进一步使用。

贝聿铭是染色使用FluoReporter®俄勒冈州绿色®488蛋白标签工具包(分子探针)根据制造商的协议。因此,裴混合1 M碳酸氢钠溶液和孵化1 h和俄勒冈州绿色原液在DMSO(10毫克/毫升)。未反应的染料被通过凝胶排阻层析法使用PD-10脱盐列(英国通用电气医疗集团)。488 -茚三酮测定中定义的标记裴浓度是储存在4°C和整除进一步保护。

基于彩色使用阿565染料结合生物素(ATTO-TEC GmbH,韦伯就已经在席根,德国)。为此,阿565染料和基于(1:比1000 w / w)涨跌互现与米尔/裴复合物和孵化准备同时在黑暗中30分钟。

监测细胞内分布的复合物,5×10⁴CD133⁺之前与荧光标记细胞转染复合物在优化条件(20 pmol米尔;N / P比值7.5;3μg / mL和基于)。18 h转染后,样品准备了显微镜如上所述。

首先,为了评估所有交付的胞内定位向量部分,共焦激光扫描显微镜(LSM)是使用ELYRA执行LSM 780系统。禅宗软件(卡尔蔡司显微镜GmbH)被应用于图像处理。

此外,miR / PEI / MNP的本地化研究更详细的使用三维结构照明显微镜(SIM)。色成像是使用100 x 1.46 alpha Plan-Apochromat执行目标(油浸):405年,488年,561年,并为激发波长633纳米的激光线。如果原始数据获得的两天一个16位的深度在3角,3阶段,平均4;23μ网格是申请405激光线,34μm - 488, 42岁μm - 561、51μm - 633。这些如果原始数据集计算重构禅宗软件(卡尔蔡司显微镜GmbH)。给出最终的图像对齐的结果获得最大预测每个通道单独创建。

2.9。造血的CFU (CFU-H)测定

为了监控造血的分化能力miR-modified CD133⁺细胞,CFU-H进行化验。18 h与Pre-miR转染后负控制# 1 microrna的前体分子,细胞和MethoCult H4434经典(干细胞的技术)和1×10³每35毫米盘细胞被播种。形成的殖民地被识别和统计评估后14 d孵化在37°C和5%的公司₂。根据制造商建议,所有样品都是在重复检查。

2.10。统计分析

使用学生的统计分析以及与SigmaPlot 11.0 (Systat软件GmbH,德国)。所有值都呈现平均值±标准平均误差(SEM)。值和(),(),(∗∗∗;)被认为是具有统计学意义。对于每一个实验中,不同的BM捐助者()使用。

3所示。结果

3.1。优化miR /裴转染复合物

为了优化CD133的转染⁺细胞,不同成分的米尔/裴四种不同组成的复合物米尔数量(10年,20年,30、40 pmol / 5×10⁴细胞)和三种不同的N / P比值(2.5、5和7.5)进行测试的吸收效率和细胞毒性(图2)。在所有测量,untransfected细胞担任内部控制代表孤立的细胞毒性效应和培养过程。

复合物与最小的米尔数量(10 pmol)显示,摄取率最低(Cy3 ~ 20至60%不等⁺细胞)和一个小增加细胞毒性坏死细胞(~ 40%)相比,控制死细胞(~ 25%)。正如所料,配合物组成的高米尔数量导致显著增加(~ 95% Cy3吸收⁺细胞,40 pmol米尔;N / P 7.5)但也导致增加细胞毒性效应(40 ~ 80%死细胞,pmol米尔;N / P 7.5)因为裴大量被要求更高。因此,复合体由20 pmol CD133的米尔被认为是最佳的转染⁺细胞代表之间的平衡吸收的增加率(Cy3 ~ 75 - 90%⁺细胞)和受损细胞的生存。

3.2。MiR / PEI / MNP复合物适合CD133⁺干细胞转染

实现磁性目标的可能性,之前选择polyplexes (20 pmol米尔;5 N / P比值2.5,7.5)辅以基于6个不同浓度(0,1,2,3,4,5μ克每毫升的准备miR /裴混合物)。基于对吸收效率的影响以及细胞毒性进行了分析通过流式细胞术和共焦显微镜(图3)。再次,untransfected细胞担任内部控制。

miR / PEI /接种率MNP复合体没有显著不同于各自miR /裴复合物(0和基于),而提高N / P比值(2.5、5和7.5)导致增加吸收效率(~ 40% ~ 60% ~ 80% Cy3⁺细胞,分别地。)(图3 (b))。代表图像说明标记的胞内本地化miR-Cy3及其摄取率高时一个复杂的配方20 pmol米尔N / P比值7.5加上3μg / mL和基于应用(图)3(一个))。此外,没有明显的细胞毒性的变化测定之间的控制(%死细胞)和转染细胞坏死细胞(介于~ 25和35%)(图3 (c))。在之后的实验中,磁性复合物组成20 pmol米尔和N / P比值5和7.5加上3和5μ使用g / mL和基于对他们的摄取率最高、低细胞毒性比控制。

3.3。MiR / PEI / MNP-Modified CD133⁺干细胞可以通过磁场有效地引导

探讨磁场对细胞转染的指导和优化miR / PEI / MNP复合物,吸引本地应用好板下24 h(图4(一))。

untransfected细胞,细胞几乎相同的数字被发现在这两个领域(有或没有磁铁(图)4 (c))。这些结果表明,mac CD133微磁靶向细胞单独并不充分。相反,细胞转染与磁性复合物组成20 pmol米尔和N / P比值5和7.5加上3和5μg / mL和基于显示更高的细胞数量在磁铁(+磁铁)的面积比在该地区没有磁铁(−磁铁)。相应地,转染细胞显示大幅度提高磁定位率(1.6和2.6之间的比率)比untransfected细胞(的比例)(图4 (b))。此外,转染复合物与N / P比值7.5导致更高的目标比率(和3和5μg / mL和基于)与N / P比值比复合体5 (和3和5μg / mL和基于)。因此,复合体由20 pmol米尔和N / P比值7.5加上3或5μg / mL和基于目标被认为是最适合的转染细胞磁场和被用于进一步的实验。

3.4。细胞内铁浓度

条件定义为最佳的转染和磁性细胞指导、胞内铁的数量已经量化使用磁粉光谱(MPS)。因此,我们观察到的细胞吸收pg铁每个细胞可以与我们的协议来实现细胞转染miR / PEI / MNP复合物。重要的是,相应的值的范围%允许一个独特的识别成功实验miR / PEI / MNP复合物,避免假阳性信号来自磁性细胞隔离珠子。议员允许这种歧视是因为untransfected以及转染细胞样本产生信号值27 - 30%的范围内,可以认为专门配用于微CD133细胞隔离。

3.5。细胞转染复合物的可视化

细胞内检测的优化转染复合物,CD133⁺干细胞转染有标记miR / PEI / MNP复合物。转染后细胞复杂的分析吸收18 h和共焦显微镜允许结束,所有向量部分充分传递到细胞(图S3)。这另外流式细胞术结果验证:当应用适当的洗涤步骤,复合物的表面被删除,而细胞内吸收被分析。

为了监测具有较高分辨率的矢量分布,模拟了(横向分辨率高达100共焦相比,200 - 500 nm)。因此,我们观察到18 h后转染miR / PEI / MNP复合物主要是发现在细胞质中。所有向量部分是位于细胞核周围的地区没有明显的差异(图5)。贝聿铭的信号总是colocalised MNP和米尔。形成结构100 - 400 nm大小位于其他焦平面相对于原子核的录音两天了。

3.6。miR / PEI / MNP复合物对细胞生存能力和没有负面影响表面标记模式

评价转染的影响和随后的18 h培养时间对细胞生存能力和表面标记模式,流式细胞仪进行了测量和布尔控制策略是适应ISHAGE CD34指南⁺细胞。如之前所述,参数定义为最优为目标的方法被用于此目的,untransfected细胞担任内部控制。

显著减少的可行性untransfected CD133⁺细胞% (0 h控制)% (18 h控制)观察(图6)。这代表18 h培养后细胞死亡时间最有可能导致的次优内容DMEM培养基选择转染体系的建立。同时,之间没有显著差异在生存能力是决定控制和细胞转染20 pmol米尔,N / P 7.5, 0、3、5μg / mL和基于18 h后活细胞(~ 70%),说明所选的转染设置本身并不影响细胞的生存能力。

值得注意的是,没有明显的变化在细胞表面标记模式(CD45、CD34和CD133)观察18 h后培养时间(% 0 h控制,% 18 h控制)。此外,分析细胞转染20 pmol米尔,N / P 7.5, 0、3、5μg / mL和基于(%,%,%)显示控制时间点相比无显著差异,表明干细胞的保存特征。

3.7。修改CD133⁺干细胞保留其造血的分化潜能

BM派生CD133⁺细胞被熊多能干细胞分化的潜能。为了解决一个潜在的影响我们的转染系统造血的分化能力,CFU-H试验是利用。untransfected细胞(控制)和细胞的比较与优化修改miR /裴和miR / PEI / MNP复合物(20 pmol米尔;N / P比值7.5;0、3和5μL /毫升和基于)无显著差异的形成CFU-granulocyte,红细胞、巨噬细胞、巨核细胞(CFU-GEMM) CFU-granulocyte,巨噬细胞(CFU-GM) Burst-forming unit-erythroid (BFU-E)和CFU-erythroid (CFU-E)(图7 (e))。此外,转染细胞没有形成的菌落形态异常(数字7(一)- - - - - -7 (d))。这些结果清楚地表明转染在优化条件下对造血的分化没有影响CD133的潜力⁺细胞。

3.8。修改CD133⁺细胞维持细胞生存能力和表面标记模式支持Cytokine-Supplemented培养基

在最初的转染的设置中,18 h是满足转染细胞生存能力但是当DMEM培养基用于培养的影响。因此,我们进一步测试了不同培养基适合于造血干细胞(hsc) (StemSpan补充StemSpan CC100)为了在临床上应用优化转染系统更相关的场景(图8)。我们发现,这个更复杂的媒介不损害系统的高转染效率:%,% 20 pmol米尔,N / P 7.5加上3和5μ分别g / mL和基于StemSpan vs%,在DMEM %。然而,在StemSpan,细胞生存能力却无动于衷18 h和24 h后相比,转染0 h,而死细胞在DMEM减少~ 25%经过18 h。此外,CD133的培养⁺StemSpan没有造成细胞干细胞表面标记物的表达变化(CD45、CD34和CD133)孵化18 h和24小时后的控制以及转染细胞。

4所示。讨论

几个阶段,I和II,临床研究表明,CD133⁺干细胞应用治疗各种疾病(如肝脏疾病,严重的肢体缺血,肌萎缩性脊髓侧索硬化、脊髓损伤、脑瘫、慢性缺血性心肌病和白血病)是安全的和可行的10,55- - - - - -65年]。然而,尽管大量的收集临床资料,在试验的好处是不一致的和小的。这突显出细胞的迫切需要进一步优化改善临床结果。

因此,我们开发了一个病毒的多功能转染系统可能成为基础提高新鲜孤立的人类CD133的属性⁺干细胞创新疗法。这个多功能系统能够有效的米尔交付(~ 80%),没有明显的细胞毒性效应。此外,该系统确保磁指导感兴趣的网站。同时,我们证明了我们的系统有影响对干细胞标记表达式和造血的分化能力的细胞。

大鹏引入干细胞可以通过转录后的基因调控提高细胞存活率和移植(39,40,66年- - - - - -68年]。此外,米尔介导细胞CD133的修改可以用于编程⁺干细胞在特定的细胞类型。最近,这是表明,mir - 146 a, mir - 150, mir - 451促进CD133的分化⁺分别干细胞t-lymphoid和红细胞血统(69年,70年]。这可能成为有价值的生产人造血液避免化疗后的同种异体的输血或血液疾病的治疗(69年]。然而,在所有这些研究中,米尔的virus-based交付到CD133⁺使用干细胞。然而,临床翻译的病毒仍受到安全问题包括潜在的免疫原性和插入突变(68年]。

达到安全、有效的方法对病毒的米尔交付到CD133⁺干细胞,我们最初测试miR /裴复杂的不同成分。贝聿铭是最有效的试剂之一,基因传递和使用在几个临床试验证明其安全性和生物相容性71年]。由于高阳离子电荷,裴与米尔形成稳定的复合物,通过内吞作用进入细胞(72年]。随后,裴促进endosomal逃脱,导致大量质子和水(质子海绵效应)导致核内体复合物释放到细胞质肿胀和中断(73年]。然而,贝聿铭的主要缺点是其潜在的细胞毒性细胞内积累后(74年]。记住这毒性问题,我们选择了配合物组成的低米尔(20 pmol / 5×10⁴细胞)和裴(N / P比值2.5 - -7.5)金额CD133⁺干细胞工程,尽管大量导致提高吸收效率(图2)。

在下一步中,米尔/裴复合物结合和基于通过biotin-streptavidin债券,使有效的磁定位在体外(图4)。此外,磁芯的存在增加了潜在的无创性磁共振成像跟踪(51]。的应用和基于是调查、多功能工具,已被用于监测、磁性药物靶向磁性流体高热,磁标记和分离的细胞(51,75年]。最近,结果表明,基于磁场的磁CD133的标签⁺干细胞改善细胞保留在现场的兴趣和增强骨骼肌和脊髓损伤的修复(76年,77年]。然而,我们已经能够证明mac CD133微磁靶向细胞单独并不充分在体外(图4)。由于这个原因,我们评估的影响,利用基于。因此,CD133⁺干细胞转染与之前选择miR /裴复合物补充与六种不同MNP数量(0,1,2,3,4,5μg / mL)(图3)。我们目前的结果没有显示出显著差异的吸收效率和细胞毒性miR / PEI / MNP复合物相比各自miR /裴复合物。这个结果与之前的研究结果相对应,没有磁性和非磁性复合物之间的差异被发现转染后新鲜CD105孤立⁺人类间充质干细胞(78年]。相比之下,贝聿铭的数量影响吸收效率:为每个MNP浓度、高NP Cy3-positive细胞的比率与更高的数字。这个观察可以解释为广泛描述事实的裴是必要的核酸交付79年- - - - - -81年]。因为我们没有发现毒性的增加复合物形成的20 pmol miR / 5×10⁴细胞,N / P比值7.5,0 - 5μg / mL和基于相比untransfected细胞(控制),这些复合物被视为最佳CD133的转染⁺细胞。

同时,然而,需要注意的是,非凡的生存能力和转染效率的变化被发现在细胞不同的捐赠者。此观察对应之前的发现我们的集团,在BM派生hMSCs用于转染(46,82年]。然而,目前尚不清楚这固有的区别患者导致个体变化和进一步的研究应考虑临床前翻译。此外,测量吸收效率Cy3 dye-labeled Pre-miR负控制# 1不允许显示米尔处理细胞内。然而,先前获得的结果,我们的团队应该考虑:最优Cy3-miR转染条件导致足够的释放和米尔效应一旦测试功能大鹏和评估qPCR [47,83年]。因此,我们假设米尔交付CD133⁺也表明一个高效的细胞转染细胞。

此外,我们旨在研究针对修改CD133的潜力⁺干细胞在体外。为此,一块磁铁在培养板。结果,显著提高大量的细胞位于在磁铁和地区没有磁铁(图4)。相比之下,untransfected细胞表现出几乎相同的细胞数量在这两个领域。这表明细胞转染与我们magnet-bead基础系统可以有效地引导培养板使用中的特定位置的磁场。因此,足够的合并铁被定义为0.155 pg细胞的议员。然而,指导在某种程度上是有限的(大约四分之一的细胞没有目标),增加了MNP数量没有改善目标比率(5μg / mL和基于)。这一观点可以用假设来解释,不属预定目标的CD133⁺干细胞包括untransfected细胞的百分比(~ 20%)和死细胞。这也可能解释降低目标比率(在1.6和1.9之间)使转染后细胞复合物显示低吸收速率(使用N / P比值5 ~ 60%)。最后,执行在体外针对实验证明修改细胞的本地化应用磁场控制的可能。这种潜在可能成为至关重要的克服初始细胞冲洗受伤的组织,因此,有利于达到更好的长期移植和功能效益在活的有机体内。然而,许多因素在内部环境可以影响细胞保留在两个正面和负面的方式;因此,未来在活的有机体内试验显然是必要的。

此外,成功应用协议3-colour标签的复杂组件和核酸交付可能适用于跟踪矢量的命运在组织细胞移植后,在进步的时候出现在活的有机体内阶段。

重要的是,我们可以证明我们的系统既不影响干细胞标记物表达水平(CD34和CD133基于ISHAGE指南)(数据6(一)和8(一个))和分化成几个造血的血统(图7)。尽管如此,初步培养条件影响细胞的生存能力。特别是,我们发现了一个显著的减少CD133 (~ 25%)⁺干细胞生存18 h后培养时间37°C和5%的公司₂在DMEM。这个观察符合先前的研究我们的集团,CD133的重大损失⁺干细胞生存72 h后隔离了,即使在4°C存储(84年]。到目前为止,许多努力一直致力于肝星状细胞的选择合适的支持介质。自洽场和Flt3L IL-11或传真照片细胞因子定义为大多数支持HSC生存、增殖,和维护在体外因此代表了基本补充各自类型的介质如StemSpan [85年,86年]。然而,很少的信息可以在适用性转染的媒介,特别是当基于阳离子聚合物的应用交付向量(87年]。因此,我们选择了简单的DMEM培养基补充的边后卫和抗生素对转染体系的建立。因此,我们已经证明了的适用性miR / PEI / MNP系统有效米尔交付以及磁性细胞定位。同时,文化条件被证明是理想的细胞生存和扩张:已经18 h后,生存能力下降到~ 70 - 75%。因此,我们已经检查了可能有效地使转染CD133⁺细胞更多的临床相关媒介补充与支持细胞因子。我们已经观察到在StemSpan H3000(韩国帝王和血清)补充StemSpan CC100适合HSC文化,转染在DMEM同样工作的效率高:Cy3-miR 80 - 90%的细胞了。重要的是,细胞生存能力以及表达干细胞表面标记18 h和24小时后仍未受影响的文化。综上所述,基于我们的数据证明,裴/ MNP米尔交付适合温柔的和安全的CD133⁺干细胞工程,为进一步临床调查。

5。结论

在这项研究中,我们开发了一个温柔的人类CD133和安全策略有效的修改⁺米尔的干细胞。这种策略是基于病毒转染系统组成的生物素化的裴绑定到streptavidin-coated氧化铁和基于设计在我们的小组。优化转染复合物适合达到米尔摄取率高(~ 80 - 90%)而不影响CD133⁺干细胞的特征。此外,使用最佳补充支持介质,转染后细胞生存能力仍不受影响。此外,我们表明,修改后的细胞可以磁引导感兴趣的网站在体外。因此,我们期望magnet-bead米尔交付系统成为一个重要工具干细胞移植前的工程可以解决一定的挑战,如非侵入性细胞在活的有机体内监测、低细胞保留最初的细胞死亡,细胞分化。

伦理批准

作者认为他们获得适当的机构审查委员会批准或遵循赫尔辛基宣言中概述的原则为所有人类实验调查。

同意

涉及人体受试者的调查取得知情同意的参与者。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

保拉·穆勒纳塔莉亚Voronina, Frauke Hausburg贡献同样这项工作。

确认

这项工作是支持的德国联邦教育和研究(FKZ 0312138和FKZ 316159),该州Mecklenburg-Western波美拉尼亚与欧盟结构基金(养养/ IVWM-B34-0030/10和/ IV-BM-B35-0010/12),和脱硫(DA1296-1)和德国心脏基金会(F / 01/12)。此外,罗伯特·大卫是DAMP-Foundation BMBF以及支持的。弗兰克Wiekhorst支持欧盟FP7研究项目“Nanomag”之下FP7 - nmp - 2013 -大- 7之下。作者要感谢玛吉特Fritsche馆长和玛德琳在干细胞隔离技术援助。

补充材料