文摘

成人干细胞在疾病或可编程细胞蕴含着巨大的希望需要更换损坏或非功能细胞。我们最近表明,外周血单核细胞可以分化在体外进入细胞类似于专门的细胞如肝细胞和胰腺β细胞。在表型转换,单核细胞表达下调单核细胞/巨噬细胞分化标记,表明部分去分化,部分重组收购可塑性状态以及各种标记的多能性的表达和有丝分裂的恢复。Upregulation干细胞标记和有丝分裂活动的文化展示了通过自分泌生产控制/激活素的分泌和转化生长因子(TGF -β)。这些重组单核细胞衍生品被称为“可编程细胞单核细胞的起源”(PCMO)。当前的努力集中在建立文化条件,增加可塑性和扩散的潜力PCMO为了能够生成大量的血液细胞适合自体和同种异体疗法。

1。介绍

成人干细胞或可编程细胞代表一个有前途的替代胚胎干细胞在再生医学和组织工程(1]。虽然不被认为是一个经典的成人干细胞,单核细胞已被证明能够获取干细胞的属性(2- - - - - -5]。外周血单核细胞有一些实用的优势超过其他类型的成人干细胞/祖细胞时用于临床用途:(1)可以从身体易接近的检索室low-invasive程序或作为废物发生在献血;(2)他们可以容易维护文化;(3)他们有一个低风险的致瘤性由于其有限的增殖能力和缺乏端粒酶逆转录酶(hTERT) [6];(4)都可以应用于患者自体和同种异体设置,无需免疫抑制。自体移植的细胞材料可能只是来自成年干细胞数量如骨骨髓来源干细胞或从人类胚胎干细胞产生的体细胞核转移或从细胞和多能干细胞(iPS)。然而,所有这些潜在的细胞来源受到生物、经济、和/或道德缺陷(7]。

严重的缺点使用单核细胞数量有限的血液循环和低扩散的潜力在体外。用于移植的目的,有必要增加细胞产量在体外扩张。另一个障碍是单核细胞不同分化潜力成专门的细胞类型,在很大程度上是donor-dependent。临床相关,条件优化对生产大量的细胞从一个单一的捐赠者。因此,主要目标是提高细胞的增殖潜力在文化,同时保持甚至提高他们对所需的细胞类型分化潜能。在这篇文章中,我们概述分子事件在去分化阶段,例如,当细胞获取干细胞的特征,并讨论各种策略,展示期间承诺增加细胞数量在体外文化。

2。巨噬细胞表型和功能异质性和单核细胞可塑性

循环单核细胞是一个非常多才多艺的祖细胞,产生不同的细胞类型。它生成造血干细胞通过常见的髓系祖(CMP)和粒细胞和单核细胞祖代表成单核细胞的前体的人群。成单核细胞是致力于成为最早的形式从骨髓单核细胞和他们的后代者移民到外周血。不招募炎性病变时,外周血单核细胞能够接受成熟成几种类型的tissue-resident巨噬细胞(了8休息等)组织巨噬细胞、枯氏细胞、朗格汉斯细胞的皮肤,树突细胞,小胶质细胞,破骨细胞,内皮细胞。当适当的刺激,单核细胞迁移到网站的炎症和渗出液流通组织,获得的特征激活巨噬细胞炎性表型。在急性炎症反应,这通常需要生产的炎性细胞因子,抗微生物氧化自由基,tissue-debriding蛋白酶,和吞噬活性升高。一旦清除炎性碎片伤口,巨噬细胞有助于伤口决议的过程中,促进血管生成,矩阵生产和细胞增殖。这功能切换到一个或者激活、抗炎和regeneration-promoting表型似乎是由凋亡细胞的吞噬作用,受各种tissue-derived细胞因子、激素和代谢产物9]。在某些癌,巨噬细胞可以招募到这个组织采取特定的表型,最终促进肿瘤进展。这些肿瘤相关巨噬细胞(tam)长期极化展览活动,支持肿瘤的生长和转移,抑制了适应性免疫反应,因此类似于一个或者激活类型(9]。单核细胞/巨噬细胞的功能可塑性如何生成目前是一个有争议的问题(9]。

巨噬细胞的功能异质性可能取决于sublineages功能的分化,或者巨噬细胞是细胞功能塑料,有能力改变他们的功能活动逐步在应对变化的信号生成的微环境(功能可塑性的假设)。单核细胞/巨噬细胞的功能可塑性和再生潜力可能比以前所认为的是什么大得多。一些人工培养的细胞群,来自循环单核细胞有能力分化成nonphagocytic多能干细胞的细胞如多能干细胞(已经)2],MOMC [3,5),CD14 +(KDR +子集10],PCMO [4,11,12]。

3所示。单核细胞分化的潜力PCMO和分子证据作为潜在的干细胞

最近,我们已经开发出一种协议从单核细胞诱导在体外文化一个明显更多的塑料导,我们命名为“可编程细胞单核细胞的起源”(PCMO)。4-6-day后这些细胞与巨噬细胞集落刺激因子(csf)治疗,interleukin-3 (IL-3),和人类血清暴露后受到适当的感应媒体分化成细胞内皮特色,软骨细胞、成骨细胞、骨细胞制备(手稿)。杨和同事的研究建议原位成骨分化和骨形成的移植人类PBMNCs [13]。之前我们还展示了PCMO生成从人类外周血或血液或非人灵长类的脾可以转化成胰岛素生产细胞(4]。然而,我们的重点是PCMO-derived hepatocyte-like细胞(所谓的NeoHepatocytes),表达各种肝细胞标记和展览hepatocyte-specific代谢功能在体外和在活的有机体内(4,11]。有趣的是,NeoHepatocytes能够改善生存在急性肝衰竭大鼠模型14)和monocyte-derived hepatocyte-like细胞甚至显示承诺在与乙型肝炎病毒有关的失代偿肝硬化的治疗15]。单核细胞/巨噬细胞表型的更一般的损失将是赞成去分化的过程,并将支持我们的论点,PCMO代表已恢复到一个更原始的祖细胞更少限制分化潜能。符合这一点,这是发现,在应对特定培养条件单核细胞沉默monopoietic标记基因PRDMI和ICSBP同时保持lineage-specific转录因子的表达PU.1(4]。更丰富的模式Kruppel-like因子4 (Klf4)、单核细胞的核转录因子巨噬细胞分化是表达monocyte-restricted和stage-specific模式在骨髓形成和促进炎症性单核细胞分化[16]。Klf4单核细胞迅速沉默后接触PCMO文化条件和转录水平仍低,直到6天之后他们成了察觉。其他与专业有关的标记功能,例如,那些参与传感和杀死入侵微生物如CD14、toll样受体(通常2、4、7和9),和两个子单元的活性氧产生NAD (P) H氧化酶(Nox4和),分别下调虽然具有不同的动力学6]。表达式通常和Nox4显著下降在转录水平在6天的文化,而表达未在mRNA水平但似乎表达下调蛋白质含量在PCMO介质(从第二天开始6]。标记的列表在单核细胞中表达下调PCMO转换表提供1。

3.1。多能性的表达和激活标记在PCMO生成

尽管证据确凿的广泛的单核细胞分化潜能,令人惊讶的是鲜为人知的机制允许他们保持一个未提交的前驱状态。因此,我们想知道ESCs的表型可塑性的机制也在PCMO操作。在这方面,我们提供证据的信使rna和蛋白质水平PCMO共有几个标记等的ESCs OCT4(也称为POU5f,包括OCT4A,多能性相关的同种型)和NANOG6]。蛋白质可以作为活化剂的自我更新和多潜能基因和基因家族的压抑者,承诺。有趣的是,内生OCT4和NANOG基因似乎被再次激活动力学对应与灵敏度的时间模式向hepatocytic分化(6]。其他基因涉及维护PCMO包括自我更新和多潜能生长和分化因子3(GDF3),DPPA3/斯特拉/PGC7,ABCG2,Connexin-43,NCAM,DNMT3b,UTF,BMP2,CRIPTO/TDGF1,钙粘蛋白,CD105。等基因SOX2,GABRB3,节点,左撇子B,hTERT在PCMO负面。数据显示,关键的多能性监管机构(例如,OCT4和NANOG)和多能性网络的其他因素,如Myc(见表1),在PCMO重新激活,可能控制塑料的行为。事实上,PCMO似乎像在某些方面部分重组细胞系(17),它们激活基因干细胞更新和维护相关(例如,MYC)和多能性(OCT4,NANOG)。这些结果表明,在适当的生长因子环境循环单核细胞,至少部分,没有外源重组引入多能性因素。

3.2。TGF -β/激活素信号和多能性标志物表达的增强

在胚胎干细胞、维护和退出的未分化的阶段主要是由成员TGF -β/苯丙酸诺龙家人pluripotency-associated转录因子的生长因子通过监管OCT4和NANOG18,19]。也有证据表明TGF -的作用β具备干细胞/ activin-related因素调节单核细胞/ PCMO。我们展示了最近TGF -β及其受体,TGF -βII型受体的激活素受体激酶5 (ALK5),在PCMO表示。此外,我们发现TGF -β分泌PCMO到上层清液由ELISA,文化水平的TGF -β1在单核细胞转换PCMO下降。(相比之下,激活素水平上层清液为)文化增加直到第四天的文化。有趣的是,不仅PCMO表达受体的激活素配体也ActRIIA ALK4,这两种文化的调节,直到第四天,建议增强反应的细胞激活素刺激(自分泌)。互惠的自分泌信号TGF -β和苯丙酸诺龙的文化被证明证实c端磷酸化/激活Smad3, ALK5的主要目标,文化的拒绝,直到第四天,虽然激活Smad2, ALK4的主要目标,玫瑰在同一时间内。我们确认敏感性PCMO激活素信号通过证明重组激活素(A、B和AB)诱导Smad2 c端磷酸化的但不是Smad3。

3.3。表观遗传变异在PCMO一代

组蛋白的甲基化起着关键作用的基因表达的表观遗传调控在哺乳动物的发展。一般来说,基因转录与trimethylation Lys-4的组蛋白H3 (me-H3 (K4)) (20.),而许多沉默基因与H3 (K27) trimethylation [21]。有趣的是,两者的感应NANOG和OCT4伴随着瞬态变化表明转录组蛋白修改(重新)激活(6]。在未分化的细胞OCT4子包装包含标记的核小体的活性染色质,即高度乙酰化组蛋白H3在Lys-9 Lys-14, me-H3 (K4) [22]。我们注意到一个瞬态全球me-H3 (K4) PCMO文化密切反映的时间进程OCT4转录活动。的甲基化OCT4子仍然很高PCMO代不同阶段期间,亚硫酸氢所显示的转换和焦磷酸测序在特定CpG岛OCT4远端增强器(6),这表明子脱甲基作用的潜在机制OCT4归纳。初步数据表明,治疗PCMO 5-azacytidine可以增加他们的可塑性。我们目前正在研究是否这反映的upregulation pluripotency-determining基因。

4所示。培养条件有利于单核细胞的干细胞特性

我们正在追求的三种策略来增强PCMO假设下的干细胞特征更多的干细胞的祖将影响表型的分化所需的细胞类型:(1)避免激活/分化刺激(促炎的代理和细菌组件)这可能预防适当的去分化的单核细胞,(2)比较PCMO PCMO可塑性和增殖活动的暂停和附着生长的条件下,和(3)增强PCMO可塑性/多能性标记表达式由苯丙酸诺龙调制和TGF -β信号。

4.1。避免激活/分化刺激可能阻止单核细胞的去分化

为了防止激活炎性巨噬细胞,它似乎强制消耗中任何潜在的促炎因子,细胞的细菌组件,或外国抗原导致激活单核细胞的免疫反应。我们的数据清楚地表明,自体血清的使用减少了初始巨噬细胞活化在随后PCMO文化和提高产量和分化NeoHepatocytes的函数。自体的方法也可能是有用的其他干细胞制备过程中细胞的激活在一代应当保持到最低限度。

4.2。比较PCMO PCMO暂停和附着生长条件下的塑性

坚持基本外周血单核细胞分化成巨噬细胞是至关重要的。另一方面,PCMO发展必须附有保持状态德分化。保持细胞德分化的状态,这是理论上的逻辑在悬架,以防止文化分化成巨噬细胞的发生。从暂停附着增长伴随着细胞形态学的变化(4)也影响蛋白质参与细胞粘附和细胞骨架的监管等在β肌动蛋白和钙粘蛋白(增加)4-6-day文化时期(6]。在一起,这些数据表明,单核细胞在转换PCMO经历部分德分化。干细胞标记基因的表达OCT4和NANOG高附着的悬浮细胞。

的比较结果有区别的NeoHepatocytes起源于附着和暂停PCMO,显示不同的结果。悬浮细胞导致NeoHepatocytes CYP1A1/2水平较高的,CYP2D6、和UDPG和更高的尿素代谢,而较高的附着PCMO导致NeoHepatocytes SRB-1和葡萄糖代谢。这些hepatocyte-specific化验可能表明一个独立的监管PCMO可塑性和扩散。

4.3。增强PCMO可塑性/多能性标记表达式由苯丙酸诺龙调制和TGF -β信号

我们最近发现,在PCMO代多能性标记表达式控制苯丙酸诺龙/ Smad2积极和消极TGF -β/ Smad3信号。具体地说,自分泌抑制苯丙酸诺龙——卵泡activin-binding蛋白过分生长信号的降低Smad2激活和OCT4A / NANOG upregulation。它可以得出的结论是,治疗PCMO与苯丙酸诺龙(s)将增强OCT4A / NANOG表达式和多能性。相反,自分泌抑制TGF -β信号anti-TGF -β抗体减少Smad3激活和适度增强OCT4A / NANOG表达主张TGF -β抑制作为额外或补充策略来增加PCMO具备干细胞。几个TGF -β通路抑制剂(应该不是cross-inhibit激活素信号等常用ALK4/5小分子抑制剂SB431542)是用于这一目的23]。

5。策略增强PCMO的增殖潜力

正如上面提到的,必须优化扩张和分化条件对生产大量的PCMO从一个单一的捐赠者。我们曾表明,单核细胞继续增殖(PCMO文化条件下6];然而,再次进入有丝分裂细胞的比例还较低。除了自体血清的使用提高了收益率分化NeoHepatocytes通过增加细胞数量在PCMO阶段(24),我们正在寻求其他三个策略来实现这一目标:(1)增强扩散后附着力文化,(2)coculture PCMO的淋巴细胞,和(3)的促有丝分裂的生长因子。

5.1。比较PCMO暂停和附着生长条件下扩散

相比我们的增殖活动PCMO在悬浮培养与依从性。扩散研究了免疫荧光Ki67标志着发展在细胞周期G1 - s阶段。与我们的预期相反,数据显示PCMO扩散更高的在附着生长暂停文化所透露的一个子集的外观Ki67-positive单核细胞的差别,对这些基因(25]。

5.2。增强与自体淋巴细胞增殖Coculture PCMO之后

最终目标是提高细胞的增殖潜力在飞行器PCMO文化分化潜力,进一步加强分化潜能不必牺牲自己的增殖活动。我们发现PCMO扩散在混合文化更高(PBMC与自体淋巴细胞“污染”)比在纯文化中单核细胞纯化的淘洗,表明直接信息交互或由淋巴细胞分泌的因素与PCMO增加交互扩散。为了澄清在PCMO自体淋巴细胞增殖的作用,净化单核细胞与越来越多的cocultured从同一供体淋巴细胞分离插入孔隙大小为0.4μ米,允许转让只但不是细胞(图1(一),最高)。我们的结果显示增加分数的Ki67-positive单核细胞的数量成正比cocultured淋巴细胞(淋巴细胞所表达的:单核细胞比例,图1)。mitotically活跃的增加单核细胞的差别是伴随着对这些细胞周期抑制剂在单核细胞:淋巴细胞比率大于1:1(图1 (b)),可能反映了脱抑制增长逮捕。自是引起TGF -β/ Smad3信号和TGF -β1存在于PCMO文化的上层清液(25),我们解决问题是否淋巴细胞可以抑制TGF -β活动通过监测信号的激活状态Smad3 phosphoimmunoblotting(和Smad2控制)。在cocultured单核细胞,减少磷酸化Smad3观察相对于单作单核细胞,同时激活Smad2只有轻微影响的评估相对于管家蛋白的水平α微管蛋白(图1 (c))。这些结果表明,自体淋巴细胞增强单核细胞的增殖抑制growth-inhibitory TGF -β/ Smad3 /轴。

5.3。增强扩散后的促有丝分裂的生长因子

5.3.1。EGF / HB-EGF

在早期的研究中,我们观察到激活单核细胞的细胞外signal-regulated激酶(ERK) 1 PCMO文化的活动达到顶峰在天3 - 4 (4]。因为MEK / ERK通路被激活的表皮生长因子(EGF),这是众所周知的,导致许多类型的细胞增殖及其受体在增殖细胞中(26),我们评估可能直接EGF对PCMO扩散的影响。Heparin-binding表皮生长因子(HB-EGF) - kDa糖蛋白的EGF家族,也有增殖作用和是一个强有力的许多类型的细胞分裂素(27]。据报道人类外周血单核细胞表达表皮生长因子受体(EGFR)[功能28,29日),而EGF受体c-erbB2, c-erbB3, c-erbB4尚未研究。然而,在单核细胞EGF或HB-EGF和扩散之间的联系还没有被报道。

EGF和PCMO HB-EGF增强细胞增殖,增加循环控制基因的表达(ABL, ANAPC2, CDC2、到和CDK6),增加视网膜母细胞瘤(Rb蛋白的磷酸化复审委员会ppRb),增加PCMO细胞数量与EGF刺激后或HB-EGF [30.]。EGF也提出了单核细胞表达增殖标记Ki67的数量。PCMO表达EGF受体EGFR (ERBB1)和ERBB3,和表达都在PCMO生成增加。Phosphoimmunoblotting PCMO表明EGF和HB-EGF激活MEK-1/2和浓度的方式ERK1/2 EGF的作用更突出(30.]。EGF治疗进一步的表达下降和增加NANOG指示的增强德分别分化和多能性。治疗与EGF和HB-EGF导致NeoHepatocytes改善功能参数(30.]。结果表明,添加EGF或HB-EGF PCMO分化培养基superactivates MEK / ERK信号然后增加PCMO扩散和功能分化PCMO-derived NeoHepatocytes。

5.3.2。TGF -β/苯丙酸诺龙

筛查代理刺激PCMO扩散导致的识别ALK4/5/7抑制剂SB431542 [31日作为代理,PCMO总数增加,可能通过防止TGF -的抑制细胞生长的作用βPCMO。自分泌抑制TGF -β信号通过SB431542或anti-TGF -β抗体减少Smad3激活和强烈Ki67-positive细胞的数量增加。缓解增长的抑制作用主要是TGF -减少的结果β/ Smad3,一定程度上激活素/ Smad2信号(25]。抑制TGF -β受体在PCMO文化似乎是一个合适的工具来进一步扩大PCMO为了最大化为未来的移植细胞产量的目的。然而,由于SB431542还能抑制ALK4 ALK7从而激活素信号,必须注意这个函数不是以牺牲多能性下降。更具体的TGF -抑制剂β信号需要用来避免这个问题(23]。

6。结束语

在过去的十年里,我们和其他人造成意识到单核细胞是极其多才多艺的,塑料电池,此功能可能被利用在体外利用这些细胞是干细胞的细胞再生医学。各种细胞制剂来源于外周血单核细胞表达多能性的标志已被证明/ ESCs OCT4、NANOG等,虽然他们的干细胞功能尚未明确。在更大的范围内,转录组概要文件之间的相似之处被发现的巨噬细胞和小鼠未分化的ESCs但不分化的干细胞(32]。此外,单核细胞的相似性与成体干细胞的观察也很明显有效的重组成人干细胞(神经)单核细胞可以通过异位表达的只有一个基因,即PU.1 [33]。PCMO显示等部分重组细胞系特征部分活化干细胞更新和维护相关的基因(如MYC)和一些多能性基因(OCT4和NANOG)和不完整的镇压lineage-specifying转录因子(如PU.1)。部分重组稳定细胞系的另一个特性是在pluripotency-related位点DNA甲基化。基于这些观察,它可能会进一步加强PCMO的干细胞特征,最终通过遗传互补的诱导多能性状态SOX2,沉默PU.1与小分子化合物和/或治疗PCMO修改染色质或增强多能性因素的作用。应该提到的,然而,有reexpression的可能性OCT4在单核细胞/ PCMO回应MCSF IL-3 /血清暴露并不能反映生理机制;然而,这可能导致治疗相关的细胞类型。有趣的是,我们观察到一些相似之处标记表达式之间PCMO AMAC-1等,或者激活巨噬细胞,FoxP3,语言(胡,未发表)。自M2-polarized巨噬细胞被履行组织损伤后再生功能在炎症过程中,他们不仅可能导致愈合过程通过分泌细胞因子,但也可能自己充当干细胞细胞恢复组织细胞。在这方面,根据我们的数据,自体血清降低初始PCMO巨噬细胞活化,提高产量和功能分化NeoHepatocytes(见上图),这将是有趣的比较PCMO经典激活,或者激活或不激活巨噬细胞的表达及其multipotency pluripotency-determining基因。我们相信,表型和代谢功能PCMO-derived专门的细胞类型,例如,NeoHepatocytes,不仅可以提高通过优化特异性分化的条件也更有效地提高甚至PCMO可塑性通过上述策略。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。