表征的神经源性牙髓干细胞的潜力无血清培养系统在韩国帝王/条件:体外和体内评价

文摘

神经干细胞(nsc)的高效能分化为神经元和神经胶质细胞替代受损细胞的旁分泌作用的再生和remyelination主机轴突。牙髓是已知有可能分化成neural-like细胞;因此,牙髓可能作为自体神经修复的细胞来源。在这项研究中,我们有选择性地扩大了从人类牙髓干细胞在最初的文化在韩国帝王和无血清条件下使用NSC媒体。初始步骤的主要文化,人类牙髓是根据文化媒体分为两组:10%胎牛血清的媒介集团(的边后卫组)和NSC培养基组(NSC组)。NSC组相对于的边后卫,NSC标记的表达和白血病抑制因子的浓度,神经生长因子,和干细胞因子高,尽管他们的表达水平低于人类的胎儿NSC。NSC组幸存的移植细胞在正常大脑和脊髓受伤的老鼠和表达巢蛋白和Sox2。在韩国帝王和无血清条件下,人类牙科pulp-derived自体干细胞可能用于临床细胞治疗修复受损神经组织。

1。介绍

干细胞疗法使用神经干细胞(nsc)被认为是一个最有前途的治疗策略的损伤中枢和周围神经系统(1,2]。内源性nsc已知存在于成年人的大脑甚至在脊髓;不幸的是,他们的中风或脊髓损伤后神经再生的能力在成人非常有限,因为它们很难刺激在活的有机体内微环境(2,3]。外生nsc从胚胎或胎儿已被证明是有效的神经再生(4,5)还有免疫、伦理和政治问题(6]。最近开发的诱导多能干细胞(万能)和直接重新编程nsc [7- - - - - -9)也有病毒整合的潜在风险,肿瘤形成,基因组不稳定性仍然障碍临床翻译(10]。其他担忧干细胞的临床应用,有动物组件(如胎牛血清(的边后卫)可以导致传播病原体的风险和对接受者的免疫反应11,12]。

成各种细胞类型,包括内皮细胞、成纤维细胞、间充质干细胞(msc),和神经细胞是牙髓中包含从成人和婴儿容易获取的。在牙髓干细胞(即。,dental pulp stem cells: DPSCs) have a high potential for proliferation and differentiation into neural-like cells and as such might be a good source for neural regeneration [13]。先前的研究事实上已经证明成功的人类牙齿pulp-derived干细胞分化成neural-like细胞在两种在体外和在活的有机体内条件(14- - - - - -17),和其他的研究,此外,发现neural-like细胞能有效促进功能改善啮齿动物神经损伤模型(18,19]。

本研究的目的是建立一个方法来隔离和扩大从人类牙髓干细胞在韩国帝王和无血清条件下以及调查这些细胞是否表达关键神经基因移植后大鼠的神经组织。

2。材料和方法

2.1。DPSC隔离和文化

本研究机构审查委员会批准Dankook在韩国大学口腔医院(批准号H-1304/005/003)。正常的第三臼齿提取和收集从三个健康的病人(22日至23日岁)。一个口腔外科医生轻轻分开的牙髓牙周韧带和牙龈组织没有污染,从而减少它的孵化成小块混合胶原酶I型为1小时/ dispase解决方案。大骨料和碎片被通过细胞通过一个70年μM过滤器。获得的单个细胞同样分为两组:对照组和实验组。在对照组(的边后卫组),细胞悬浮培养的边后卫媒体:杜尔贝科的修改鹰的中/火腿的F12培养基(DMEM / F12)补充了青霉素、链霉素的边后卫10%和1% (P / S,所有从英杰公司)。在实验组(NSC组)、细胞培养在NSC媒体:DMEM / F12补充1%的P / S, 20 ng / mL碱性纤维母细胞生长因子(bFGF、研发系统),20 ng / mL表皮生长因子(EGF、研发系统),N2(表达载体),和B27(表达载体),在韩国帝王和无血清条件下。两组的细胞,的边后卫和NSC在通过使用5供以后分析。两个控制细胞系细胞代谢活动进行比较和定量实时聚合酶链反应(存在)分析:从骨髓msc (BM-MSCs,从写明ATCC)是在DMEM / F12培养基培养补充10%的边后卫,1% P / S,和人类胎儿脑源性nsc (hNSCs)(从曹教授),在DMEM / F12培养基培养补充1%的P / S, bFGF (20 ng / mL)、白血病抑制因子(10 ng / mL,σ),和N2。

2.2。神经分化DPSCs

神经分化,塑料film-surfaced盖玻片放在24-well板和涂覆层粘连蛋白、纤粘连蛋白在4°C涂层后一夜之间我和第四型胶原(所有10个μ在室温下g / mL) 1 h (RT)。细胞通道5的边后卫和NSC集团被播种在2×10⁴在DMEM / F12培养基培养细胞/好,补充1%的P / S, N2, B27,维甲酸(100海里),声波刺猬(100 ng / mL),脑源性神经营养因子(10 ng / mL), glial-cell-derived神经营养因子(10 ng / mL)和胰岛素样生长因子- 1 (10 ng / mL)与N 2周,随后补充⁶2′-O-dibutyryladenosine 3′, 5′环一磷酸(dbcAMP 1毫米)和forskolin (10μ米)1星期。

2.3。MTT试验

确定细胞代谢活动,3 (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)进行分析。细胞的边后卫NSC团体或BM-MSCs被播种在2×10³浓度在96孔板培养1至5天在适当的媒体。然后,细胞溶解有100μL DMSO小时潜伏期后MTT(0.5毫克/毫升),用分光光度计测量(OD 570海里,Bio-Rad实验室)。的值被表示为褶皱的变化。分析了在三个独立的实验中使用三个不同的井在每个时间点。

2.4。总RNA隔离

细胞被播种在2×10⁶浓度在100毫米培养板,然后细胞溶解在试剂盒(英杰公司)三天后。与氯仿提取总RNA,用异丙醇沉淀,在75%乙醇洗,溶解在核糖核酸酶和DNase-free蒸馏水(表达载体)。RNA浓度量化了紫外分光光度法(NanoDrop技术)在260海里。总RNA提取后存储在−80°C。

2.5。存在分析

互补DNA(互补)合成了20 80 ng的RNAμL逆转录反应使用高容量RNA-to-cDNA工具包(应用生物系统公司)。的边后卫和国家安全委员会组织的存在(每个)进行StepOnePlus(应用生物系统公司)使用SYBR®绿色PCR反应混合液(应用生物系统公司)包含每个引物0.5毫米和2μ在20 L的模板μL的最终体积。正向和反向引物的序列表中列出1。放大的一式三份的反应条件进行如下:5分钟在95°C,在94°C 25-32周期为30秒,在成本则高达55 -°C 1分钟,1分钟和72°C。每个基因的表达水平是归一化到18 s核糖体RNA。


基因	序列

克莱斯勒	F: 5′agc CAA GAG CCC TGG太极拳TAT-3′
	R: 5′-TGG gg TTC CGT TTG CTG AGT-3′

纤连蛋白	F: 5′cag TGG GAG ACC TCG AGA AG-3′
	R: 5′- CAA AGA CTA CAA GGC太极拳CT-3′

Map2	F: 5′- AAC有条件现金援助TTG AGA ACA CGA CA-3′
	R: 5′TCT TTC CGT柠檬酸TCT GCC a - 3′

Mash1	F: 5′cca GTT GTA CTT CAG CAC颈- 3′
	R: 5′tgc CAC TTT GAG TTT GGA颈- 3′

NCAD	F: 5′aca GTG GCC ACC TAC AAA GG-3′
	接待员:5′- GTA ATA GTT GGG GTA插科打诨CC-3′

NCAM	F: 5′cag CCA GCA手枪TAC AAT GC-3′
	R: 5′-TGG CTG GGA ACA ATA太极拳AC-3′

巢蛋白	F: 5′ctg GAG CAG GAG AAA CAG三大′
	R: 5′-TGG GAG CAA AGA太极拳亚美大陆煤层气有限公司AC-3′

NeuroD1	F: 5′- CCA CGG ATC AAT CTT CTC AG-3′
	R: 5′猫手枪GTG AAT GGC答CG-3′

Olig2	F: 5′ggt亚美大陆煤层气有限公司TGC GCA ATG CTA AGC TGT-3′
	R: 5′tac AAA GCC CAG TTT GCA ACG CAG-3′

Pax6	F: 5′atg TGT GAG TAA AAT TCT GGG CA-3′
	R: 3′gct TAC AAC TTC TGG AGT公司治理文化TA-3′

Sox1	F: 5′aat TTT ATT TTC GGC GTT GC-3′
	R: 5′-TGG GCT CTG TCT CTT AAA TTT GT-3′

Sox2	F: 5′ccc AGC AGA CTT CAC ATG条t - 3′
	R: 5′有条件现金援助CCC ATT太极拳CTC GTT TT-3′

波形蛋白	F: 5′gag AAC TTT GCC GTT棉酚GC-3′
	接待员:5′- CTA ACG GTG手枪GTC CTT CG 3′

18 s rRNA	F: 5′cgg CTA猫CCA gg AA-3′
	R: 5′gct GGA ATT ACC GCG GCT-3′

克莱斯勒:doublecortin;Map2:微管相关蛋白2;NeuroD1:神经元分化1;NCAD:神经钙粘蛋白;NCAM:神经细胞粘附分子;Olig2:少突细胞转录因子2;Pax6:成对蛋白质6盒;袜:Y-box决定性别的地区。

2.6。Fluorescence-Activated细胞排序(流式细胞仪)分析

流式细胞仪分析细胞进行播种在2×10⁶浓度在100毫米盘经过3天的文化。的边后卫NSC的介质中,细胞染色1小时的抗体(列在表规定2)和适当的同形像控制按照制造商的指示。洗后两次磷酸盐(PBS),分析了细胞使用FACSCalibur和CellQuest软件(BD生物科学)。


抗体	稀释	应用程序	公司

CD95	1:100	流式细胞仪	BD生物科学
CD105	1:100	流式细胞仪	BD生物科学
CD54	1:100	流式细胞仪	BD生物科学
CD56	1:100	流式细胞仪,如果	BD生物科学
巢蛋白	1:200	如果	微孔
Pax6	1:500	如果	Covance
Sox2	1:200	如果	微孔
βIII-Tubulin	1:1000	如果	Covance

流式细胞仪:fluorescence-activated细胞排序;如果:免疫荧光染色;Pax6:成对蛋白质6盒;性别决定地区Y-box Sox2: 2。

2.7。多路复用浮在表面的细胞因子测定

为一个细胞因子试验的目的,2×10⁴细胞的边后卫或NSC组()被播种在24-well板0.2毫升DMEM-F12补充1%的青霉素和链霉素(P / S)媒体和个人术后24小时取出上层的文化。Cell-supernatant样品50μL是结合涂布珠子使用MILLIPLEX™地图包(微孔)和分析。DMEM-F12补充1%的P / S是用于控制和作为标准样品的稀释剂。孵化和清洗实例之后,珠子从井resuspended在125年μL Luminex装置的电池。收购门是7500年和13500年之间的双重歧视;样本容量为75μL, 100事件/地区。获得值浓度,原始数据(平均荧光强度)从所有的珠子组合测试分析了使用主丛QT3.0量化软件(MiraiBio Inc .)。

2.8。在活的有机体内移植

调查下的细胞生存能力在活的有机体内条件下,细胞被移植到新生儿的大脑(2天,),脊髓受伤(12周,老鼠)Sprague-Dawley (SD)。所有的动物保健和手术机构批准的动物保健和使用委员会Dankook大学在韩国(批准文号dku - 12 - 019)和符合指南。挫伤损伤是应用于T9脊髓水平使用无限的地平线撞击器(ih - 400、精密系统和仪表)如前所述[20.]。两组的细胞,NSC或介质的边后卫细胞(5×10⁵细胞在5μL (PBS)移植到大脑皮层区域,然后NSC介质细胞被移植到脊髓受伤的中心在9天后挫伤损伤率为1μL / min用汉密尔顿注射器(汉密尔顿公司)。环孢霉素A (Cipol Inj™,庄Kun Dang制药公司)是皮下接种10毫克公斤⁻¹一天⁻¹直到动物被牺牲了。

2.9。免疫荧光染色

细胞被固定在4%多聚甲醛(PFA) 30分钟在RT和PBS洗3次。老鼠大脑灌注和细胞移植后1周。移除大脑和脊髓的组织被后缀,沉浸,然后嵌入,于是冠状切片的脑组织和脊髓组织的矢状切片连续执行。准备的细胞和组织样本孵化与初级抗体列在表中2。孵化后,幻灯片和PBS洗和孵化fluorescent-dye-conjugated二级抗体染色和4′,6-diamidino-2′-phenylindole盐酸盐(DAPI染色)。图片使用共焦显微镜拍摄(卡尔蔡司Inc .)。

2.10。统计分析

统计分析使用PASW统计18(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。Shapiro-Wilk测试进行了揭示了正态分布的定量数据从MTT试验,存在,细胞因子分析在体外研究,列文的测试进行了方差的同质性的褶皱变化从MTT试验。根据结果,双向重复测量方差分析(细胞类型和时间点)进行比较的褶皱变化MTT测定的边后卫和NSC团体和BM-MSC控制,和个人的比较是在每个时间点通过与韦尔奇单向方差分析统计和Games-Howell事后测试。一个独立的以及进行比较的数据中存在与细胞因子测定的边后卫和国家安全委员会组织。值小于0.05被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。形态学和细胞代谢活动的DPSCs在不同介质条件下培养

人牙髓细胞首先通过为的边后卫组1周,2周后NSC组隔离(图1(一))。虽然第一使NSC组的细胞需要更多的时间比的边后卫介质细胞(图1 (b)),我们可以获得许多强烈NSC媒体条件下增殖细胞(数字1 (b)和1 (c))。在通道3的边后卫介质细胞表现出粗糙表面呈形态学夷为平地,而NSC介质细胞表现出表面光滑凸形状(图1 (b));non-pulp-tissue-derived细胞,例如,从牙周韧带和齿龈,然而,没有生长在NSC媒体(图2)。MTT测定显示,NSC中细胞的代谢活动相似的边后卫介质细胞最初的5天文化时期除了第三天,明显高于人类BM-MSCs(图1 (c))。这些数据显示,值得注意的是,高度增殖的细胞可以从人类牙髓无血清NSC媒介获得从最初的文化舞台。

(一)

(b)

(c)

图1

战略推导从牙髓神经干细胞的细胞提取人类第三磨牙。(a)实验方案的分类胎牛血清(的边后卫)和神经干细胞(NSC)组。(b)之间的比较主要细胞扩张和形态学的边后卫和NSC介质细胞。比例尺= 100μm。(c) MTT试验测量细胞代谢活动的边后卫介质细胞,NSC介质细胞通道5,人类从骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)。误差线代表意味着从三个独立实验的标准偏差从一个捐赠(的边后卫和NSC组)或一个细胞(BM)。双向重复测量方差分析(Greenhouse-Geisser)揭示了重要的影响,细胞组、和天×细胞组交互()。星号()显示显著差异与BM-MSC相比在每个时间点根据单向方差分析和Games-Howell事后测试()。

3.2。比较标记表达式的边后卫NSC的介质中,细胞之间

NSC的存在显示标记,包括doublecortin(克莱斯勒),微管相关蛋白2 (Map2) Mash1,神经细胞粘附分子(NCAM,也称为CD56)、巢蛋白、神经元分化1 (NeuroD1),配对盒蛋白6 (Pax6)决定性别的地区Y-box 1 (Sox1) Sox2, NSC和胶质细胞标记包括少突细胞转录因子2 (Olig2)、波形蛋白,这是一个标记NSC和MSC,都表示在NSC组显著高于的边后卫,而纤连蛋白,被称为一个MSC标记,表示在NSC组显著低于的边后卫组(图3)。和个人表达模式的边后卫和NSC组补充图所示,在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/6921097的表达模式BM-MSC和胎儿脑源性nsc(补充图),大多数的NSC标记的表达水平在NSC组似乎低于人类的胎儿脑源性NSC。

图3

比较标记表达式之间的边后卫集团(的边后卫,白色的酒吧)和国家安全委员会(NSC,黑色bar)在通道5。中存在的测量应用NSC或神经元标记(克莱斯勒、Map2 Mash1, NCAD, NCAM、巢蛋白,NeuroD1, Olig2, Pax6, Sox1,和Sox2), MSC标记(纤连蛋白),NSC和MSC标记(波形蛋白)的边后卫和国家安全委员会组织。结果显示相对于表达式的边后卫中通过计算使用ΔΔCT和2 -细胞(ΔΔCT)方法和规范化18 s核糖体RNA的表达,和标准偏差的误差线代表意味着从三个捐助者在每组()。星号()显示显著差异相比,根据独立的边后卫组以及()。

接下来,NSC, MSC-specific表面标记流式细胞仪进行了分析。NSC组、CD15——CD54、CD56、CD95和CD133-positive细胞比例远高于的边后卫。相比之下,MSC标记CD105的表达水平在优越的边后卫组相比,NSC组。造血干细胞标记CD34、CD45、与此同时,在表达负面的边后卫和NSC介质细胞(图4(一))。作为显示在图4 (b),采用结果Pax6符合存在的边后卫和国家安全委员会的数据组,尽管巢蛋白在两组同样的染色。这些数据表明,细胞无血清培养系统在韩国帝王,NSC媒体主要文化的初始步骤显示更高的NSC FBS-containing媒体特性与细胞培养。

(一)

(b)

图4

流式细胞仪分析和immunocytofluorescence的边后卫和国家安全委员会组织。(a)表达的表面标记的边后卫和NSC团体在通道5通过流式细胞仪分析。NSC标记(CD15 CD29、CD54 CD56、和CD95), MSC标记(CD105)和造血标记(CD34、CD45和CD133)的边后卫和NSC介质细胞。(b) Immunocytofluorescence发现的边后卫和NSC介质细胞通道5。这些细胞被沾Pax6、巢蛋白和CD56。比例尺= 100μm。

3.3。细胞因子分泌的边后卫和NSC介质和神经分化

目前多路浮在表面的人类细胞因子测定的因素进行了识别的边后卫和NSC介质细胞分泌。NSC的细胞上清液组,NSC的自我更新和分化的细胞因子参与,如白血病抑制因子(生活),神经生长因子(神经生长因子),和干细胞因子(SCF) [21),是更明显(比的边后卫组);与此同时,细胞因子主要参与炎症,如白细胞介素- 6 (il - 6)、IL-9,集落刺激因子(gm - csf), growth-regulated致癌基因α(GROα)和肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子-α)[22),是更丰富()(图5(一个))。

(一)

(b)

图5

生长因子、cytokine-secretion能力和神经分化能力。(a)多路复用上层清液中细胞因子测定的边后卫集团(的边后卫,白色的酒吧)和国家安全委员会(NSC,黑人酒吧)通道5。误差线代表的标准差的意思从三个捐助者在每组()。星号()显示显著差异相比,根据独立的边后卫组以及()。(b) Immunocytofluorescence发现的边后卫和NSC在抓捕过程中细胞分化neural-like细胞。βIII-Tubulin阳性细胞染色在红色,和核复染色进行与DAPI(蓝色)。白色的比例尺条= 100μm;黄色栏= 50μm。

进一步的神经分化潜力的边后卫和NSC介质细胞了,结束β3周后检查III-tubulin-positive细胞神经分化(图5 (b))。神经分化之前,没有明确βIII-tubulin-positive细胞被发现的边后卫或NSC组(补充图)。三周后分化过程,我们发现βIII-tubulin-positive细胞是可见的边后卫和安全委员会组织;然而,阳性细胞的数量在NSC组高于的边后卫组(图5 (b))。获得的数据表明,NSC介质细胞分泌多种生长因子和茎cell-niche-related细胞因子在更高的水平比的边后卫介质细胞,从而展示,通过体现双极和多极形态,他们的神经分化的潜能。

3.4。在活的有机体内的边后卫NSC的介质中,细胞移植到大鼠中枢神经系统

NSC移植后一周中细胞移植细胞存活在大脑和脊髓受伤,也成功地表达了NSC标记(图6)。道NSC介质细胞表达Sox2, costained与巢蛋白(图6(一)人类细胞核(图)或6 (b));然而,它们的染色强度低于Sox2-positive宿主细胞(图6)。我们也被移植的边后卫中老鼠的大脑细胞在正常新生儿和移植细胞存活与少量移植网站移植后1周内(补充图)。这些数据反映了NSC中细胞的生存有利的迹象和大鼠中枢神经系统内的集成。

(一)

(b)

图6

Immunohistofluorescence发现新生儿的大脑受伤(a)和(b)的大鼠脊髓组织NSC中细胞的移植后1周。组织是沾染了人类细胞核(HN,绿色,(a) (F)和(b) (b);GFAP、红(a) (G)和(b) (G);巢蛋白,绿色,(a) (B)和(B) (F);红,Sox2 (a) (C)和(b) (C)),和核复染色进行与DAPI(蓝色)。(a)(罪犯),(a) (F-H), (b)(罪犯),和(b) (F-H)显示放大图像的黄线框(a) (a) (a) (E), (b) (a)和(b) (E)图像,分别。白色的比例尺条= 100μm;黄色栏= 20μm。

4所示。讨论

牙髓,这是颅神经嵴细胞种类软组织产生在牙齿发育过程中,包含了异构人群如成牙质细胞、纤维母细胞,外膜细胞,神经细胞以及坚持成人牙髓干细胞利基(23]。培养DPSCs,大多数研究利用animal-serum-containing媒体获得足够的细胞主要培养期间,甚至神经再生研究[14,17]。然而,血清比NSC更适合MSC增长;此外,动物血清带来安全风险的可能性朊病毒等病原体的传播,病毒,和人畜共患病。同样,动物血清蛋白可以诱导免疫原性反应,这可能拒绝即使自体移植细胞(12]。根据这些因素,建立xeno-free文化系统所需的任何细胞的治疗策略。在目前的研究中,为了排除动物组件和抑制MSC的扩张或在牙髓成纤维细胞,我们严格避免使用合成,人类或其他动物源血清对干细胞的扩张。尽管许多成功的研究已经调查DPSC属性,目前的调查,据我们所知,是第一个进行神经干细胞样细胞的选择性扩张从人类牙髓没有任何接触的动物血清的主要文化的初始步骤,这种方法从临床应用安全角度来说是非常有利的。尽管先前的研究显示在无血清培养基DPSCs的扩张能力,10%的细胞培养-fbs-supplemented介质在第一天之前在无血清培养基培养(23]。

在此,我们假设干细胞可以扩展在异构的牙髓细胞无血清NSC媒体主要文化的第一步。在目前的研究因此,两个不同的文化环境,媒体和国家安全委员会的边后卫媒体,应用于牙髓已经被划分的三个独立的捐助者。结果表明,细胞被大大扩展了NSC媒体至少到第十,但还需要进一步的研究来确定确切作用在神经修复NSC媒体。明显不过,我们发现没有细胞从其他牙齿牙周韧带等组织或gingival-derived血清NSC媒体组织,然而,animal-serum-containing媒体,细胞,在相关的先前的研究已经证明,扩展(图2)[24,25]。这些牙髓和其他牙科组织之间的差异可能是由于细胞类型的多样性;当然,牙髓的结果告诉我们,而不是其他oral-origin组织,有利于获得响应细胞神经基底条件下。在进一步的结果,而国家安全委员会中细胞缓慢扩大的主要文化的初始步骤,他们获得了高速增长后适应能力在体外文化系统。在第五段,我们调查,通过流式细胞仪分析细胞表面标记是否表示不同的边后卫和NSC介质细胞。表面标记作为各种必不可少的化合物和受体细胞增殖和分化等代谢过程。我们的数据显示,事实上,大量DPSCs表达了MSC标记时在10% -fbs-supplemented培养基培养;然而,NSC标记是表示当他们扩大居多的国家安全委员会中,即使CD29-positive种群各自组是相同的。这些标记模式同时存在和免疫荧光结果所示,流式细胞仪的数据。总的来说,这些数据支持的假设neuroectodermal起源人类DPSCs呈现的典型资料NSC标记基因和蛋白表达可以有选择地扩大在韩国帝王和血清NSC媒体。

监管的环境适合干细胞的存活和分化、旁分泌作用是重要的。先前的研究分析了细胞因子释放的DPSCs在骨的/牙原性的分化[26)或secretomes条件培养基从人类脱落乳牙干细胞(27];然而,没有研究NSC-related secretomes DPSCs。在当前的研究中,因为分泌细胞因子与自我更新和组织修复和免疫调节因素重要的干细胞移植,我们评估已知细胞因子分泌的nsc,影响神经活动28- - - - - -30.]。结果,细胞因子分泌的NSC非常NSC媒介的上层清液中包含的细胞,表明neuroregenerative活动与旁分泌作用的可能性。我们另外证实神经分化潜能(图5 (b)),在活的有机体内实验中,作为一个先天的研究,揭示了生存能力牙科pulp-derived NSC介质细胞在大鼠中枢神经系统内,特别是正常大脑和脊髓受伤(图6)。然而,NSC中NSC标记细胞的表达水平,所示存在,免疫组织化学,似乎低于内源性神经干细胞,并进一步在活的有机体内需要研究来阐明人类的潜在效用DPSC-derived NSC介质细胞促进功能恢复中枢神经系统病变。

综上所述,我们的调查和结果似乎证实了假设人类牙髓组织中干细胞数量适用于neuroregenerative药。cell-isolation和文化的优化方法对于这样的应用程序,因此,。尽管如此,小数量的样品,从只有三个主题,可能会提高功率问题,和未来的研究需要说明的效能的分化为特定类型的神经细胞,治疗功能的长期的神经损伤,以及派生一个提高效率的方法,初始扩张安全应用NSC介质细胞。

5。结论

在这里,我们发现了一种新方法安全可靠的细胞从牙髓干细胞的扩张在最初的文化使用NSC媒体使用,第一次,韩国帝王和无血清培养系统。这项研究可能有助于为临床翻译铺平道路使用细胞疗法对受损神经组织的修复和再生。

相互竞争的利益

作者没有利益冲突声明。

确认

这项研究是由韩国国家研究基金会(NRF),合同2014 r1a1a3052554, 2009 - 0093829,联盟- 2015 r1a2a1a15053883 NRF - 2015 r1d1a1a02061196,和韩国卫生技术研发项目(HI14C0522)由卫生部&福利,韩国。作者感谢教授seung - woo曹(延世大学、韩国)捐赠的人类胎儿脑源性神经干细胞和胃肠道金教授金(Cha大学、韩国)的支持这个项目。

补充材料

补充图1。NSC和MSC标记的存在测量个人的边后卫(F1、F2和F3,白色的酒吧)和国家安全委员会(N1、N2和N3,黑条)在通过5组,和人类BM-MSC (BM,虚线酒吧)和人类胎儿神经干细胞(FN,冲酒吧)控制。补充图2。Immunocytofluorescence发现的边后卫和NSC介质细胞通道5就在神经元分化的过程。补充图3。Immunohistofluorescence发现老鼠大脑组织在1周post-transplantation的边后卫介质细胞。

补充数据

引用

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干细胞国际

进步和新技术对干细胞临床应用口腔检查参与组成分泌腺和他们

表征的神经源性牙髓干细胞的潜力无血清培养系统在韩国帝王/条件:在体外和在活的有机体内评估

文摘

1。介绍

2。材料和方法

2.1。DPSC隔离和文化

2.2。神经分化DPSCs

2.3。MTT试验

2.4。总RNA隔离

2.5。存在分析

2.6。Fluorescence-Activated细胞排序(流式细胞仪)分析

2.7。多路复用浮在表面的细胞因子测定

2.8。在活的有机体内移植

2.9。免疫荧光染色

2.10。统计分析

3所示。结果

3.1。形态学和细胞代谢活动的DPSCs在不同介质条件下培养

3.2。比较标记表达式的边后卫NSC的介质中,细胞之间

3.3。细胞因子分泌的边后卫和NSC介质和神经分化

3.4。在活的有机体内的边后卫NSC的介质中,细胞移植到大鼠中枢神经系统

4所示。讨论

5。结论

相互竞争的利益

确认

补充材料

引用

版权

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