人类则在神经系统疾病中的应用:从基础研究到临床应用

文摘

原则上,诱导多能干细胞)的细胞则是产生体细胞重编程和获得无限自我更新能力和分化成不同的细胞谱系的能力。人类有绝对优势的细胞则在人类胚胎干细胞(ESCs)和在疾病动物模型建模、药物筛选、细胞替代疗法。因为高桥和山中在2007年第一次描述了,可以生成的细胞则从人类逆转录病毒转导成年体细胞的四个转录因子,Oct3/4, Sox2, Klf4,原癌基因,疾病的特定iPSC行如雨后春笋般在世界范围内像竹笋春雨后,使iPSC最热门的现代科学和快速移动的话题里。万能的狂热已经传遍临床医学的主要分支,涉及神经病学、血液学、心脏病学、内分泌学、肝脏病学,眼科学,等等。在这篇文章中,我们将关注人类万能干细胞在疾病的临床应用建模、药物筛选、细胞替代治疗神经系统疾病。

1。介绍

原则上,诱导多能干细胞)的细胞则是来自人类体细胞重编程并获得无限自我更新能力和分化成不同的细胞谱系的能力。人类有绝对优势的细胞则在人类胚胎干细胞(ESCs)。一方面,作为一个无限治疗来源,人类则克服ESCs的人类所面临的伦理问题,为人类成年体细胞组织比胚胎组织更容易在技术上和符合伦理道德的行为。另一方面,如病人衍生干细胞,人类则可以更好地概括疾病表型和病理过程没有动物模型中存在的种间差异。因为高桥和山中在2007年第一次描述了,可以生成的细胞则从成人体细胞的逆转录病毒转导四个转录因子Oct3/4 Sox2, Klf, Klf4,原癌基因(1,2)、疾病特定人类行如雨后春笋般在世界范围内的细胞则喜欢吃竹笋春雨后,使细胞则成为最热门的现代科学和最快的移动领域。万能的狂热已经传遍临床医学的主要分支,包括神经学(3- - - - - -6],血液学[7,8心脏病学),(9,10),内分泌学(11,12],肝脏病学[13],眼科[14,15),等等。这里我们将关注人类万能干细胞在神经系统疾病的临床应用建模、药物筛选和细胞替代疗法(图1)。

2。整体疾病建模策略和挑战

第一个策略将直接改变患者体细胞万能。只要有访问患者体细胞组织,一种疾病特定iPSC线可以获得使用合适的编程方法,是否它是一个neurogenetic障碍,定义遗传原因或没有定义的零星的疾病遗传的原因。最新的,神经系统疾病模型使用此策略包括脆性X综合征(FXS) [6],Rett综合症[16],唐氏综合症[17],帕金森病(PD) [4,18- - - - - -22),阿尔茨海默病(5,23- - - - - -27),和精神分裂症(SCZH) [28,29日]。重大的进展已经由使用此iPSC基础策略虽然在非常初期的阶段。例如,一些神经系统疾病表型已经透露,如缺突触、神经成熟不足,异常反应氧化压力,和线粒体赤字,这将提供洞察新的疗法或药物筛选策略(目标19- - - - - -21,23,28,30.- - - - - -33]。然而,承诺和简单,这一战略还面临很多挑战。首先,iPSC模型不是一个平等代替ESC模型。例如,FXS-ESCs的研究表明,FMR1 unmethylated和表达水平接近正常(34]。相比之下,FMR1重新编程的细胞则从体细胞FXS病人保持沉默的6]。进一步阐明这个矛盾,生物研究关注ESC和iPSC的区别是必要的。很可能一些关键的致病机制和ESCs的细胞则躲在微妙的区别。另一个挑战是不同患者之间的差异或不同克隆来自同一个病人。对于某些疾病如SCZH,很难确定观察到的表型是否真的疾病相关或仅仅由于特定的遗传背景。因此,而不是比较单一iPSC线从一个病人和一个控制,它是必不可少的生成一组疾病相关iPSC线和控制不同病人和正常人克服偏见归因于个人iPSC线变化。最后但并非最不重要的,仍然有很多技术局限性晚发性疾病如帕金森病模型。PD相关表型的表现需要环境刺激,progerin、加速等病理过程。因此,这将是很大的帮助来定义与年龄相关的标记可用于监控诱导衰老过程模拟十年久老化过程在几个月35]。

第二种策略会产生人源化动物与人类细胞则通过新生儿注射小鼠大脑(36)和人类鼠嵌合体(37,38),这是一个传统但道德争议的战略技术。据报道,未分化的人类的ESCs直接注射到老鼠胎儿的大脑心室可以集成到老鼠大脑,形成人类神经元和神经胶质39]。类似的研究进一步支持,干细胞注射,ESCs人类或人类ESC / iPSC衍生品,有巨大的潜力在细胞替代疗法(40- - - - - -42]。例如,据报道,运动康复与人类神经祖细胞移植来说(NPC)脊髓人免疫缺陷小鼠(42]。尽管这些现象的潜在机制保持神秘,这种建模策略仍然是研究涉及细胞替代疗法的基础。值得注意的是,更少的证据表明产生人源化动物直接注入的细胞则43),这可能是由于很难控制体内分化的细胞则准确地说,暗示iPSC派生NPC细胞替代疗法将是一个更好的选择。

第三的战略是建立三维(3 d)结构化的体外模型,可以模拟人类的体内平衡生动。目前二维(2 d)文化系统平台最常被使用。然而,这些2 d系统不能模拟体内微妙结构化环境。相反,3 d文化系统可以模拟复杂的体内环境在体外通过模仿高度有组织的cytoarchitectural特性。首先,三维培养系统可以实现不同细胞类型的划分。不同的细胞会驻留在组织室模拟建筑特色的组织领域(44,45]。此外,基于划分的细胞,使用特殊的生物材料,可以创建浓度梯度,研究人员可以更好地控制的生化物质对特定的细胞类型,模拟信号提示体内的交付。例如,利用3 d微型图象文化系统,研究人员可以通过调节突触分布浓度梯度的神经营养因子和细胞层的位置。可以看出协同神经生长因子/ B27梯度可能增加皮质神经元的突触密度通过刺激经济增长,这将是被同质B27分布,而细胞层的位置会影响突触的空间分布46]。最后,它不应该被忽视,万能的组合和精密加工技术也为组织工程具有巨大的潜力。移植的人类iPSC派生人大nanofibrous管状支架导致神经再生是一个典型的例子47]。一句话,三维培养系统不仅能给我们高度有组织的体外模型研究也使我们更精确地控制细胞微环境。

最后但并非最不重要的是新开发的令人兴奋的技术,迷你的大脑。2013年,奥地利科学家兰卡斯特等人报道成功的一代脑瀑样,称为迷你的大脑,在培养皿中培养人类iPSC调整3 d文化系统。基本上,它由多个离散,尽管相互依存的胚胎的大脑区域。尽管缺乏精致的开发体内的组织和结构,如完整的皮质纹理,这个模型代表一个大跃进对建模最复杂的组织,人类的大脑。一方面,大脑瀑样可达4毫米的规模和能在体外生长只要10个月使用生物反应器与简化的协议。另一方面,他们更接近胚胎的大脑相比生成通过传统协议(48]。更重要的是,他们可以概括人类大脑皮层发展功能,小鼠模型无法实现,这称为“特征祖区与充裕的外放射状胶质组织干细胞。“研究人员进一步利用这个方法来建模一个发育障碍,头小畸型。有趣的是,这种人类iPSC派生迷你大脑可以模仿严重的表型,不能体现在带有相同的突变小鼠模型49]。总的来说,很希望在不久的将来越来越多的大脑神经系统疾病会有相应的迷你模型来研究。和机制现在保持神秘,特别是那些涉及神经发育疾病,可以公布。

3所示。药物筛选策略和挑战

一般来说,主流的制药管道是低效和昂贵的,而超过90%的药物在临床试验中测试未能批准(50]。此外,那些打击化合物选择通过非人类iPSC平台,并不是每一个候选人是有效的对人类,和最重要的一个原因是缺乏忠诚的疾病模型。由于病人派生细胞则可以更好地模拟真实的疾病机制,它是合理的假设基于病人派生万能高吞吐量的屏幕将会是一个更好的药物筛选的策略。例如,在这项研究中使用的人类iPSC派生的多巴胺能神经元来评估候选人PD治疗药剂,44岁的化合物被啮齿动物系统,只有16个证明治疗效果在人类PD模型(18),这表明人类赋予的优越的特异性细胞则为基础平台。建立高效的药物屏幕平台,两个问题是必不可少的:万能的大规模生产或派生的神经细胞的细胞则以及体外读数的定义适用于高通量分析(43]。一个很好的例子是最近药物筛选的化合物可以恢复FMRP FXS人大的表达式。适应相关的实验要做大规模,研究者首先诱导FXS iPSC人大这是容易操作,可以迅速在单层生长。接下来,FMRP翻译水平定义为读出一个敏感和定量TR-FRET-based FMRP化验了FMRP的将由一对FMRP抗体,检测到一个标记供体与受体染色染料和其他标记。简单地说,人大第一次播种到1536孔板,紧随其后的是刺激的化学库包括1280种药品。细胞后细胞溶解和孵化一双FMRP抗体。荧光信号由积极井FMRP恢复将检测并分析了板的读者。通过这种方式,确定了6支安打和4人经二次qPCR化验(51]。类似的筛选平台也被应用于其他神经系统疾病,如家族性神经异常(52)和脊髓性肌萎缩(SMA) I型(53]。综上所述,这种筛选策略更节省时间,更便宜的比那些传统的生产方式。

除了评价治疗效果的大量的化合物,人类iPSC基础平台也可以用来评估细胞类型特定的脱靶效应和毒性。例如,诱导人类万能干细胞肝细胞和心脏细胞提供了机会来评估是否真正感兴趣的化合物具有肝毒性,毒性50]。此外,通过筛选化合物细胞组成的小组iPSC线或iPSC影响细胞来自不同的病人,只有有效的对某些病人的化合物,与特定的基因档案或疾病亚型,可以确定43]。从这个意义上讲,iPSC药物筛选策略将有助于缩小目标患者群体,导致个性化医学在未来。

4所示。细胞替代策略和挑战

最令人兴奋的潜在的人类则将细胞替代疗法。造血干细胞在临床上已用于治疗疾病,如多发性骨髓瘤和白血病(54]。最近,日本科学家应用人类万能干细胞在治疗眼科疾病的患者55]。还设想,在不久的将来我们可以有人类iPSC派生的器官用于移植手术(56]。人类万能和iPSC衍生品已被证明在神经系统疾病治疗潜力包括脊髓损伤(42,57),亨廷顿病(58),和PD (59]。然而,令人兴奋的,因为这些结果,安全问题如肿瘤形成和不适当的本地化移植细胞也有相关报道。因此,真正实现细胞替代疗法在临床的设置,严格的标准应该设置为确保质量控制人类万能诊所年级。下面我们将讨论他们每个人。

4.1。Integration-Free重新编程方法

人们一直担心,病毒载体介导重组可能会引入不必要的向量片段插入iPSC基因组,这可能影响派生万能的生物学性质,甚至诱发恶性转化,呈现iPSC不安全的诊所使用。为了解决这个问题,研究人员一直致力于integration-free重组方法获得更安全的万能。一个很好的例子就是慢病毒向量加上Cre策略,通过这种方式,重组向量侧翼loxP网站将被切除Cre-recombinase转染是暂时性的(4]。但是这是劳动和时间消耗和向量DNA loxP外部的网站可能仍集成。其他方法包括piggyBac转座子(60,61年),游离向量(62年],[运载体63年],仙台向量[64年),蛋白转染(65年,66年],nucleofection [67年),和小分子交付(68年,69年]。尽管他们可以实现integration-free目的,他们共享相同的限制即重组慢病毒载体相比,效率极低。进展显著增强的iPSC生成效率由陈和金集团,transactivation Yes-associated蛋白质领域的融合转录因子定义,Oct4、Sox2, Nanog,和Klf4 (OSNK),建立一个新的重组系统OySyNyK可以迅速启动24 h内高达100倍更高的效率比传统OSNK系统[70年]。希望这些研究进展终于可以为真正的清洁和安全生产万能效率。

4.2。致瘤性

致瘤性指的能力或iPSC派生细胞形成肿瘤的细胞则被移植到宿主后,这通常是由畸胎瘤的形成倾向分析评估。迄今为止它仍然是神秘的畸胎瘤形式如何在移植设置使用同源的万能干细胞或iPSC衍生品。第一个原因是,形成了畸胎瘤细胞来源尚不清楚。一个可能的假设是,未分化的细胞则不断出现在iPSC派生的祖细胞或终末分化组织的来源是畸胎瘤启动(71年,72年]。另一个重要原因是,风险影响因素形成畸胎瘤是多功能的。第一个风险因素是逆转录病毒转基因整合。转基因的主要担忧是,非目标集成元素和干细胞项目的失调可能会导致异常的肿瘤相关基因表达(73年,74年]。此外,激活或不完整的抑制逆转录病毒转基因一直被认为是与致瘤性增加。在支持,移植的二级neurospheres从部分获得重组iPSC线到免疫缺陷突变小鼠的大脑导致强劲畸胎瘤形成由于不完全抑制转基因编码Oct4、Sox2, Klf4,原癌基因(71年]。乐观,这个问题可能会消除利用integration-free重组方法如上所述。可能发挥作用的另一个因素是体细胞组织起源。三浦集团报道,二级neurospheres从小鼠重新编程的细胞则从不同的成年小鼠组织teratoma-forming倾向的差异很大。例如,二级neurospheres源自成人尾巴尖成纤维细胞产生的细胞则显示更高的致瘤性相比生成从小鼠胚胎成纤维细胞75年]。然而,这也可能是由于这样的事实,不同的组织有不同的突变积累,表观遗传记忆,和年龄。需要更多的证据来支持这一观点。如果体细胞组织起源真的有助于致瘤性,谨慎选择原始体细胞组织重组应被视为一个主要标准在临床应用中,因为这将影响病人患有在刚开始的时候,一个侵入性手术或退出一个头发。总的来说,上面的所有证据来自老鼠。因为肿瘤的形成机制是复杂的,可能是特定的物种,从灵长类动物或人类患者需要更多的证据。

致瘤性虽然机制仍然不明,临床试验使用自体病人派生高桥集团已经开始标记的细胞则使用病人特定iPSC派生视网膜色素上皮(RPE)细胞治疗湿式的年龄相关黄斑变性。值得注意的是,在临床前研究中他们评估病人的致瘤性iPSC派生RPE使用免疫缺陷的啮齿动物。iPSC派生RPE细胞移植到65 nonobese糖尿病小鼠皮下注射到26个裸大鼠的视网膜下空间他们得出的结论是,病人iPSC派生RPE细胞的致瘤潜能是可以忽略不计,没有肿瘤被发现在接下来的6个月的监控(76年]。然而,它仍然是高风险国家,iPSC派生RPE细胞对人类安全的啮齿动物也安全。因此,严格的临床前评价和posttransplantation监测应该是强制性的,以确保临床安全。例如,灵长类动物模型将是一个更可靠的系统相比,致瘤性评估(啮齿动物模型77年]。积极选择分化细胞没有污染的未分化细胞在移植手术也可能帮助降低致瘤性的风险78年]。更基本的和理想溶液posttransplantation设置将前体药物策略或自杀基因诱导启动子控制的(79年]。通过集成一个基因编码的酶可以将药物前体毒素或自杀基因进入细胞移植,研究者和临床医生可以消除移植细胞容易通过管理相应的药物在肿瘤发生的事件正在进行(80年,81年]。然而,鉴于所有的技术方式的限制,应用这些策略在实际临床病例仍有很长的路要走。

4.3。免疫原性

另一个主要担忧万能干细胞临床移植的免疫原性。是否同源的iPSC是免疫原性仍然是有争议的。争论是由2011年的一项研究报告意外刺激免疫拒绝畸胎瘤来自同系的小鼠则。以前,人们认为同源的万能干细胞或iPSC派生细胞self-tolerant,这是一个完美的自体移植来源。然而,在这项研究中,它被指出iPSC派生畸胎瘤免疫排斥反应有显著的高于ESC派生。B6小鼠移植接受者接收同源的ESCs显示有效畸胎瘤的形成与微不足道的拒绝,而接收同源的万能干细胞移植,无论从小鼠胚胎成纤维细胞重新编程使用逆转录病毒转导或游离方法,显示出强大的免疫排斥反应的证据包括畸胎瘤形成的失败,T细胞浸润和组织损伤73年]。与本研究相比,其他两个后来的研究探索分化细胞,治疗相关,显示了相反的结果。第一项研究显示,微不足道的终末分化细胞的免疫排斥的皮肤移植和骨髓,这源于嵌合iPSC或ESC派生的老鼠82年]。其他的研究观察到没有免疫排斥的终末分化细胞则和ESCs代表三个胚芽层通过评估体外免疫原性和后移植到自体接受者(83年]。两个研究乐观地得出同样的结论,同系的万能或iPSC衍生品的安全来源细胞替代疗法。研究之间的这种差异是否由于ESCs的区别不同和万能线还未知。有趣的是,最近的一项研究表明,分化的细胞则可能导致丧失免疫原性的感应self-tolerant免疫反应(84年),这有助于解释上述差异的研究。此外,赵集团的另一个最近的研究报道微分从同源的万能干细胞分化细胞的免疫原性与人类免疫系统功能人性化的小鼠模型,在iPSC派生的平滑肌细胞是高度免疫原性而iPSC派生视网膜上皮细胞是宽容,虽然直接移植仍然是免疫原性的细胞则是他们以前的结果(85年]。迄今为止,很难形成一个假说来解释不同的现象观察到不同的学习小组由于贫穷的潜在机制的理解。然而,一致认为提高重组技术和需要了解底层机制产生临床级万能。和致瘤性类似,免疫原性评估移植前也应该是强制性的。

4.4。有前途的临床前试验动物模型

第一个在人类神经系统疾病的临床试验使用干细胞产品杰龙在2009年发起,针对remyelinating剥蚀轴突胸水平脊髓损伤患者与人类ESC派生的少突胶质细胞的功能型被证明是安全有效的(86年]。然而,由于财政问题,这个试验是2年后终止87年]。到目前为止,没有这样的临床试验使用iPSC产品已报告;然而,神经系统疾病的临床前数据类型支持临床试验使用iPSC产品增加,包括PD (88年],亨廷顿氏舞蹈症[89年),肌萎缩性脊髓侧索硬化症(90年],SMA (91年]。其中,PD可能是最有前途的神经退行性疾病的细胞替代疗法试验,因为它主要是由中脑多巴胺能神经元的损失造成的。作为证据的原则,移植的中脑多巴胺神经元可以覆盖不足的有效治疗。虽然多巴胺试剂已被证明是一种有效的治疗策略,它已经认识到,药物的疗效就会妥协由于副作用。在逻辑上的下一步,细胞替代疗法被科学家视为一个更好的选择,克服局限性的潜力的药物,如脱靶效应和nonphysiological交付的多巴胺(92年]。临床试验使用胎脑组织移植和ESC派生神经元对PD已经变成现实,所反映出的“TRANSEURO”和“GForce-PD倡议”计划(92年,93年]。然而,考虑到安全问题上面所讨论的,万能和iPSC衍生品基础细胞疗法仍处于临床前阶段。神经细胞产生的细胞替代疗法使用iPSC的考题在啮齿动物和非人灵长类PD模型与鼓励的结果。例如,移植后啮齿动物PD模型都显示缓解行为表型,如减少amphetamine-induced旋转且没有明显的副作用。,值得注意的是,在非人类灵长类动物猕猴猕猴PD模型,自体iPSC派生的神经细胞不仅引起电机改进还移植后存活2年没有任何免疫抑制治疗(59,88年,94年- - - - - -97年]。

令人印象深刻的临床前数据,它仍然是太匆忙的状态,临床试验使用iPSC产品准备好。成熟的移植协议PD治疗不仅要解决上述安全问题也改进最优微分协议,以确保适当的细胞身份和长期功能(98年- - - - - -One hundred.]。希望吸取教训和进步在其他疾病的临床试验使用iPSC产品可以提供一些有用的经验55,86年]。

5。结束语

让人类细胞则适用于药物筛选和细胞替代疗法,除了上面所讨论的问题,其他因素也应该考虑建立一个全面的和多方面的临床标准。在某些情况下,治疗学家可能需要使用修正基因同源的细胞移植;因此,除了致瘤性和免疫原性评估相关的重组过程,克隆iPSC线或iPSC派生细胞系基因组后修改应该进一步化验仔细隔离一个纯系以最小的突变,以确保安全。此外,更有效的方法来重组,殖民地隔离,应开发和验证实现可伸缩的和健壮的生物制造的万能,这不仅能促进药物筛选行业的发展也促进跨国家和实验室的合作。当一致的高质量和可比性的则可以由不同的机构在期望的范围内灵活地生成,它是建立一个全球存储库的时候,每个人都可以找到人类白细胞抗原(HLA)与细胞移植101年]。最后,临床医生和研究人员之间的合作的重要性不应该被忽略。监测指标,移植细胞用量,具体手术网站,和治疗窗口应该依据数据从长椅上和床头病历(图2)。尽管许多障碍有待解决,好消息是,研究人员并没有被这些困难;他们大胆的野心和最近的努力取得了美国食品和药物管理局发布的指南,名为“考虑的设计早期阶段的细胞和基因治疗临床试验产品”(102年]。

作为总结,毫无疑问人类万能干细胞研究的终极目标是提供新的见解实际患者的诊断和治疗。积累更多的知识,它是可信的,商业化的临床级万能将来会变成现实。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是支持的主要国家基础研究发展计划(973计划)(2011 cb510000)和中国国家自然科学基金(81361120404,81361120404,81361120404,81171198,81371405)。

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