文摘
派生间充质干细胞成骨分化的人类羊水(AF-MSCs)已被广泛研究在体外和在活的有机体内作为一个潜在的再生医学和组织工程的工具。虽然大多数的研究分析转录剖面的变化在分化到目前为止没有多少信息在AF-MSCs表观遗传变异分化。我们的研究的目的是评估表观遗传变化AF-MS细胞的成骨分化。孤立AF-MSCs形态学特征,证实了成骨分化细胞染色,确定由RT-qPCR碱性磷酸酶和骨桥蛋白的表达。多能性标记的基因表达水平的变化和特定的小分子核糖核酸也被评估。表观遗传变异的分析显示,水平的染色质修饰酶如Polycomb压制复杂2 (PRC2)蛋白质(EZH2和SUZ12), DNMT1, HDAC1, HDAC2 AF-MSCs成骨分化后减少。我们证明了水平的特定的染色质组蛋白标记保持活动状态(H3K4me3、H3K9Ac和其他人)增加,压抑的染色质状态的标志(H3K27me3)下降。我们的结果表明,成骨分化AF-MSCs是由各种表观遗传改变导致全球染色质重塑和为人类AF-MSCs进一步表观遗传调查提供见解。
1。介绍
派生人类羊水间充质干细胞(AF-MSCs)是一种新的再生医学和治疗的干细胞来源。AF-MSCs通过羊膜穿刺术和分析各种胎儿畸形的产前诊断和遗传疾病。羊水是包含多个细胞来源于发展中胎儿和胚胎外的组织包括胎儿皮肤,胎盘膜,上皮细胞,胎儿消化道粘膜,呼吸道和尿路(1,2]。它已经表明,在其他细胞,通过羊膜穿刺术获得的样本,有一小部分细胞具有干细胞的特性(3]。这些细胞被称为羊水衍生的间充质干细胞,因为它们显示特征的间充质干细胞能够增殖高度,自我更新,并有多个家族向成骨分化潜能,脂肪形成的,肌原性的,神经源性,内皮细胞和肝表型在体外他们甚至比成人干细胞(表现的更好4- - - - - -6]。另一方面,来自羊水间充质干细胞不支持起始的癌症。AF-MSCs可以安全地从羊膜穿刺术获得样本,避免道德问题与胚胎干细胞(ES)细胞(5,7]。
人类羊水衍生干细胞表达Oct4、Sox2, Nanog, Rex1,和细胞周期蛋白和间充质干细胞表面标记,包括CD90、CD105, CD73, CD166 CD133和CD44 (3,8- - - - - -10]。此外,成立AF-MSCs阴性标记的造血血统(CD45)和造血干细胞(CD133 CD34),确认缺少污染与其他细胞从脐带和胎儿血液11]。
如前所述,AF-MSCs multilineage潜力和表达多能性标记。考虑这些属性被归类为多功能干细胞胚胎和成体干细胞的共享特征。AFS细胞没有明显的抗原性,因此可以使用作为一个基本研究工具和研究之前,他们用于细胞疗法1,12- - - - - -14]。此外,诱导多能干细胞(万能)产生AF-MSCs山中使用四个因素,OCT4、SOX2, KLF4,原癌基因(15,16),双因素(OCT4和SOX2) (17)不使用致癌基因的重组系统,甚至只有一个转录因子的异位表达OCT4 [18]。
在房颤派生的间充质干细胞成骨分化诱导获得从各种来源(人类、羊、鼠和老鼠)被描述(10,19,20.]。记录,培养AF-MSCs各种代理,如辛伐他汀(21],草药[22,23),和植物雌激素24)或牙髓干细胞(25)或特定的小分子核糖核酸(26增加成骨分化。研究描述的可能性在活的有机体内房颤派生细胞的成骨分化了(27,28]。虽然大多数的研究分析的变化在分化转录概况,表观遗传过程的另一个关键因素构成的分子基础转录潜能。
表观遗传因素,如DNA甲基化(29日,30.]和组蛋白甲基化和乙酰化与Polycomb压制性配合物1和2 (PRC1和PRC2)被确定为多能性的主要监管机构与Oct4 / Nanog在胚胎干细胞。他们也负责维护二价的染色质结构发育基因(31日,32]。组蛋白修饰酶与multilineage成人间充质干细胞的分化已报告(33,34),但到目前为止没有多少信息羊水间充质干细胞在分化的表观遗传变异。
在目前的研究中我们证明了基因表达水平的多能性标记(Sox2和Rex1)、特定的microrna的表达,染色质修饰酶(EZH2, SUZ12, DNMT1、HDAC1 HDAC2),和组蛋白修饰(H3K4me3 H3K9Ac, H4 hyperAc和H3K27me3)后被改变在羊水衍生干细胞成骨分化诱导。蛋白质参与沉默lineage-specific差别结果显示对这些基因和维护二价在干细胞以及酶促进染色质压实和组蛋白的变化修改提议,成骨分化是由各种表观遗传变化导致全球染色质重塑。
2。材料和方法
2.1。隔离和扩大人类羊水间充质干细胞
羊膜穿刺术获得的样本从健康的女性怀孕中期羊水产前诊断所需但未发现胎儿异常基因分析(协议批准维尔纽斯地区的生物医学研究伦理委员会,158200-123-428-122)数量。羊膜细胞被Savickienė孤立使用两级协议描述和合作者6)没有c - kit特定抗体的选择。形态均匀人口AF-MSCs保持在生长介质和亚文化进入更高的段落在大约80%融合0.05% trypsin-EDTA (Gibco,生活技术,大岛,纽约,美国)。
2.2。流式细胞术分析
的表型鉴定AF-MSCs,至少1×105细胞一个试验是通过离心收集600 g×5分钟。颗粒状细胞被洗两次磷酸盐(PBS)补充0.2%胎牛血清(的边后卫)(Gibco,生活技术,大岛,纽约,美国)。然后细胞悬浮在50μL PBS 1%牛血清白蛋白(BSA)和孵化后抗体细胞表面标记:FITC共轭鼠标反CD45 (BD Pharmingen,圣何塞、钙、美国),CD34 (Miltenyi研究,Teterow,德国),和CD90(分子探针,生活技术,沃尔瑟姆,妈,美国)或PE标记鼠标反CD105的表达载体,生活技术,沃尔瑟姆,妈,美国)。鼠标IgG2A-FITC (Miltenyi研究、Teterow、德国),IgG1-FITC(表达载体,生活技术,沃尔瑟姆,妈,美国),或IgG1-PE(分子探针,生活技术,沃尔瑟姆,妈,美国)被用来同形像控制。样本在黑暗中孵化在4°C 30分钟和PBS 1% BSA洗两次。最后,细胞在200年被停职μL PBS 1% BSA和分析使用番石榴easyCyte 8 ht流式细胞分析仪(美国微孔)与2.2.2 InCyte软件。
2.3。分化分析
成骨分化的执行AF-MSCs单层使用StemPro®成骨分化工具包(美国纽约Gibco,大岛)。AF-MSCs融合培养在80% -90%,随后分化和分化培养基在37°C公司5%2。细胞染色,AF-MSCs被播种到4(3.85厘米2)板(Nunc热费希尔科学、鲁开德那样,丹麦)1×104细胞/厘米2密度。每个细胞群分化3复制使用未分化细胞作为对照。三个独立分化实验进行单独的天。在细胞分化过程中,媒介是每2 - 3天更换一次。经过15天的分化细胞染色中描述(6]。
2.4。RNA隔离和RT-qPCR
总RNA未分化和分化羊水干细胞分离使用试剂盒®试剂(Ambion,卡尔斯巴德,CA,生活技术)。
对于基因表达分析,cDNA使用最大值合成第一链cDNA包RT-qPCR(热科学,维尔纽斯,立陶宛)和Maxima SYBR绿色qPCR大师混合(热科学,维尔纽斯,立陶宛)Rotor-Gene 6000系统(Corbett生命科学)的应用。信使rna的数量是规范化GAPDH和相对基因表达是计算使用方法(相对于未分化的控制)。引物在表1被用于基因表达分析。
对微RNA表达分析,RNA是反向转录成特定的微RNA cDNA使用Taqman®微RNA逆转录工具包和Taqman microRNA化验(美国生活技术,培育城市,CA)。以下使用microRNA化验:hsa - mir - 223 - 3 - p, hsa-miR-21-3p, hsa-miR-34a-3p, hsa-miR-17-3p, hsa - mir - 148 - b - 3 - p。微rna表达水平进行了分析使用Taqman MicroRNA化验和Taqman普遍PCR主混合二世,没有)(应用生物系统公司,生活技术,促进城市、钙、美国)。内生控制RNU48微rna水平正常化。microRNA的相对表达决定使用方法(相对于未分化的控制)。
2.5。总蛋白分离和免疫印迹分析
总蛋白提取分化和未分化的细胞使胰蛋白酶化,与冰冷的PBS洗两次,孵化与benzonase细胞颗粒的体积(1/10)(默克公司,达姆施塔特,德国)30分钟在冰上。然后在相同体积的2 x细胞resuspended SDS裂解缓冲(125毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值6.8,4% SDS, 200毫米德勤,20%的甘油,和溴酚蓝的痕迹)和10卷1 x SDS裂解缓冲被添加。通过26个样本均质在96°C G针和加热5分钟。在最大速度离心后15分钟在4°C,上层的收集,用于加载到7.5 - -15%梯度聚丙烯酰胺凝胶。Tris-glycine SDS电泳后,蛋白质被转移到PVDF膜。使用抗体进行免疫印迹DNMT1、HDAC1 HDAC2(圣克鲁斯生物技术,达拉斯,德克萨斯,美国),SUZ12, EZH2(细胞信号技术,贝弗利,妈,美国),H3K4me3, H3K27me3, H4 hyperAc(五)和H3K9Ac(美国微孔,泰梅库拉,CA)。抗体GAPDH (Abcam,剑桥,英国)被用作一种蛋白质加载控制。中等辣根peroxidase-conjugated anti-mouse、anti-rabbit和抗体抗体(DAKO、斯特鲁普、丹麦)和增强化学发光检测执行使用超级信号™西方Pico化学发光底物(美国热科学,罗克福德,IL)和ChemiDoc™XRS +系统图像实验室™软件(Bio-Rad实验室)。半定量的分析的印迹是使用ImageJ软件(美国国家卫生研究院)。
2.6。统计分析
除非另有说明,所有实验至少重复三次。数据表示为与SDs平均值。两个示例学生的统计分析t以及被设定为执行和意义,,。
3所示。结果
3.1。表征AF-MSCs
羊水间充质干细胞获得来自怀孕中期羊膜穿刺术样品和培养使用两级协议中描述的部分2。典型的纺锤状细胞(图1(一))被用于以下实验。使用流式细胞仪,这些细胞被认为是强阳性间充质细胞表面标记CD105 (endoglin,表达超过90%)和CD90 (Thy-1,胸腺细胞antigen-1,超过70%的细胞)的表达和消极的CD34(造血标记)和CD45(白细胞抗原(图)1 (b))。这些细胞也表达了多能性干细胞的标记Oct4, Nanog, Sox2, Rex1由RT-qPCR(图1 (c))。AF-MSCs也证实multilineage分化潜力向成骨的(图1 (d)),脂肪形成的、肌原性的和神经性的血统(数据没有显示)。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。在AF-MSCs成骨分化的基因表达
AF-MS细胞成骨的条件下培养15天展出矿物钙总量彩色鲜艳的红色与茜素红而控制没有染色(图的未分化细胞1 (d))。表达两种成骨分化基因标记,碱性磷酸酶和骨桥蛋白,确定使用RT-qPCR(图2(一个))。我们观察到相对的表达碱性磷酸酶早期成骨分化标记,增加强烈(高达50倍)在终端成骨分化阶段,也就是说,15天,而未经处理的AF-MSCs。另一方面,我们决定增加三倍骨桥蛋白基因表达,称为晚期成骨的标记。此外,相对Sox2具备干细胞基因的表达和分析了Rex1 AF-MSCs在诱导成骨分化(图2 (b))。结果显示Sox2在差别和Rex1对这些相对于未经处理的控制细胞分化。
(一)
(b)
3.3。在成骨分化微rna的表达
小分子核糖核酸,非编码RNA分子小,调节各种发展和分化相关基因的胚胎干细胞和其他表达式。因此我们分析了五种不同的小分子核糖核酸的水平,有关干细胞分化和更新,AF-MS诱导成骨分化后细胞。我们选择了两种小分子核糖核酸参与干细胞,多能性维护miR-21和mir - 17(图3(一个))。相对表达式,由RT-qPCR决定,显示miR-21,直接抑制Sox2多能性标志,是调节在成骨分化。mir - 17的水平,这是调节人类多能干细胞,是表达下调和分化期间不断下降。此外,我们研究了三种小分子核糖核酸的相对水平调节成骨相关基因(图3 (b))。miR-34a的差别结果显示对这些基因,抑制成骨细胞分化,mir - 223的差别以及对这些基因介导的命运决定在脂肪生成和骨之间。此外,相对mir - 148 b的表达,促进骨生成微rna,是我们分析细胞调节在成骨分化。
(一)
(b)
3.4。在AF-MSCs成骨分化的表观遗传变化
在这项研究中,我们探索表观遗传变异在蛋白质表达水平和组蛋白修饰在起始阶段(5天)和晚期的成骨分化(15天)(图4)。核心成员Polycomb压制复杂2 (PRC2),保持二价的染色质干细胞,包括组蛋白H3赖氨酸27 (H3K27)甲基转移酶包含蛋白质SUZ12 EZH2和锌指域。我们的研究结果表明,表达强烈表达下调在成骨分化的终端阶段(图4(一))。DNA和组蛋白修饰酶的表达水平DNA甲基转移酶1 (DNMT1)和组蛋白去乙酰酶抑制剂1 (HDAC1)和2 (HDAC2)也在分化(图有所下降4(一))。进一步我们调查了全球水平的组蛋白修饰视为表观遗传标记。组蛋白H3赖氨酸4中的数据显示微小的改动trimethylation (H3K4me3)水平和轻微upregulation的乙酰化组蛋白H3赖氨酸9 (H3K9Ac)和组蛋白H4 hyperacetylation (H4 hyperAc)激活修改。在相关PRC2蛋白质水平降低,组蛋白H3赖氨酸27 trimethylation (H3K27me3),染色质压实和失活马克,成骨诱导后表达下调AF-MS细胞(图4 (b))。
(一)
(b)
4所示。讨论
成骨分化和骨形成是一个高度复杂的过程,涉及从环境刺激和显示细胞表型的变化,转录,蛋白质组和细胞通讯和结构的形成。这些过程是严格监管网络的信号通路和转录因子。此外,越来越多的证据表明,表观遗传机制的组蛋白修饰和染色质重塑也参与其中。在目前的研究中我们调查表型特征、基因和蛋白质表达以及修改期间的羊水派生的间充质干细胞成骨分化的主要集中在表观遗传变化。
羊水衍生的间充质干细胞表达了类似干细胞的多能性维护标记水平如Oct4、Sox2, Nanog, Rex1。AF-MSCs被定义为强烈表达间充质表面标记CD105 (endoglin)和CD90 (Thy-1,胸腺细胞antigen-1)并没有表达CD34(造血标记)和CD45(白细胞抗原)。这些特征对应的描述羊水衍生其他同事间充质干细胞分离的报道之前(3,4,6]。
我们选择了两种广泛使用的基因标记,也就是说,碱性磷酸酶(ALP)、骨桥蛋白指标的成骨分化的存在。Upregulation这些基因和细胞与茜素红染色证明是成功的成骨分化(21- - - - - -24]。
羊水间充质干细胞被归类为多功能和表达多能性维护标记,转录因子Oct4、Sox2, Nanog, Rex1。众所周知,在干细胞分化这些标记物的表达减少,细胞失去多能性和发育成特定细胞系。所有四个标记的多能性干细胞监管网络,形成一个收敛控制关键干细胞基因的表达(35]。在目前的研究中利用AF-MSC我们确定Sox2和Rex1诱导成骨分化后表达下调。Sox2连同Oct4多能监管网络层次结构的顶部是如上所述的瑞达et al。36),据报道促进扩散通过促进G1 / S过渡(35]。这是符合我们的数据作为AF-MSCs增长放缓在分化和Sox2表达减少。此外,Sox2被确认为一个Rex1监管机构与其他多能性标记(37)和低水平的Sox2与Rex1的低表达。
小分子核糖核酸(miR)是小和基因表达的共同监管机构及其表达变化与各种疾病或癌症的发展。最近小分子核糖核酸被归类为基因表达的表观遗传修饰词除了其他著名的表观遗传机制。有许多小分子核糖核酸参与干细胞自我更新,维护具备干细胞或分化。因此,几个小分子核糖核酸的表达与维护骨生成的干细胞多能性或调制进行了分析。我们同意报告研究结果表明miR-21直接抑制Sox2在人类间充质干细胞,促进成骨分化(26水平)和mir - 17,是调节人类多能干细胞(38]AF-MSCs分化后下降。越来越多的小分子核糖核酸已经证明是监管者的骨骼发育的不同方面或成骨细胞分化。其中一些已报告等抑制剂的成骨分化miR-34a [39)或mir - 223 (40在人类的基质细胞。作为我们的结果公开,这些小分子核糖核酸的效果都是一样的在人类AF-MS细胞成骨分化诱导后水平显著下降。另一方面,mir - 148 b在脂肪中提取干细胞被认为是提高骨生成41),我们演示了细微但重要的upregulation mir - 148 b表达在AF-MSCs成骨分化。
我们探索表观遗传变化在成骨分化AF-MSCs包括染色质修饰蛋白质和组蛋白修饰的分析。我们的数据显示,表达的DNA甲基转移酶1 (DNMT1)负责维护在复制DNA甲基化在成骨分化有所下降。这可以解释为多能性和自我更新属性,因为细胞分化时复制的承诺不再发生。我们的研究结果是一致的与蔡的报告和合作者42],他们表明DNMT1由多能性因素Oct4和Nanog通过直接绑定到其启动子在成人间充质干细胞维持自我更新和未分化状态。此外,在细胞分化染色质经历全球从压抑的状态转换时development-linked基因是不活跃的开放和积极转录状态。组蛋白修饰酶是关键在调解这些变化和组蛋白乙酰化是一种最丰富、动态的组蛋白修饰。据报道,HDAC1 HDAC2抑制增强骨生成,阻断脂肪生成在小鼠胚胎成纤维细胞(33]。同意这一点,我们的研究结果的差别,对这些HDAC1 HDAC2以及upregulation的组蛋白的乙酰化形式H3K9的重要性和H4显示染色质重塑AF-MSCs成骨分化期间进行。另一个非常重要的球员在基因表达的表观遗传调控干细胞分化是PRC2及其组件,组蛋白甲基转移酶包含SUZ12 EZH2和锌指域。我们的数据表明,EZH2和SUZ12表达下调AF-MSCs和诱导成骨分化之后,因此,trimethylation H3K27的减少。此外,如上所述在魏等人的研究(32),EZH2-mediated H3K27me3减少由CDK1-EZH2控制信号通路,这是特定的人类成骨分化的调控msc通过调制EZH2-targeted成骨的基因表达。我们的发现证明表观遗传变化(图的重要性5)相伴AF-MSCs的成骨分化。
5。结论
总之,人类羊水派生的间充质干细胞成骨分化是由表观遗传变化由染色质修饰酶,组蛋白修饰和特定的microrna表达。所有这些因素结合转录因子形成全球一体化网络,调节染色质的状态维持自我更新和多潜能干细胞的分化过程。我们的结果扩展数据在成骨分化的表观遗传过程,补充知识源自人类羊水间充质干细胞。
缩写
| AF-MSCs: | 羊水间充质干细胞 |
| Oct4: | Octamer-binding转录因子4 |
| RT-qPCR: | 定量逆转录聚合酶链反应 |
| Sox2: | 性别确定区域Y-box 2 |
| Rex1: | 减少表达1 |
| EZH2: | 增强剂的zeste同族体2 |
| SUZ12: | 抑制zeste 12蛋白同系物 |
| FITC: | 异硫氰酸荧光素 |
| 体育: | 藻红蛋白。 |
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
莫妮卡Glemžaitė执行所有实验,分析数据,并写了手稿。Rūta Navakauskienė设计项目,负责数据生成,导致数据的解释和修订后的手稿。
确认
这项工作是支持的研究委员会的立陶宛(项目MIP-057/2015)。作者要感谢JūratėSavickienė宝贵的磋商。