滑膜肉瘤微泡港SYT-SSX融合基因转录:比较不同方法的检测和生物标志物研究的影响

文摘

背景。滑膜肉瘤是一种激进的软组织恶性肿瘤。本研究探讨了存在SYT-SSX融合转录本的滑膜肉瘤微泡以及其潜在的角色作为滑膜肉瘤的生物标志物。患者和方法。微泡的滑膜肉瘤细胞被透射电子显微镜检查。分析了RNA-content qPCR、嵌套PCR、嵌套qPCR和液滴数字PCR比较其灵敏度的检测SYT-SSX融合基因转录。全血RNA, RNA的单核细胞,微泡RNA的滑膜肉瘤患者分析融合基因的存在记录。结果。电子显微镜分析显示滑膜肉瘤细胞释放membrane-enclosed微泡。在体外,SYT-SSX融合基因转录中检测出滑膜肉瘤细胞和微泡。嵌套qPCR被证明是最敏感的探测SYT-SSX融合基因的信使rna。相比之下,融合基因转录中没有检测到外周血细胞和滑膜肉瘤患者的微泡。结论。滑膜肉瘤细胞释放微泡窝藏SYT-SSX融合成绩单。嵌套qPCR被证明是最敏感的检测SYT-SSX融合基因的信使rna;然而,需要更敏感的化验检测癌症特异性微泡在癌症患者的外周血。

1。介绍

滑膜肉瘤是一种恶性的软组织恶性肿瘤,是最大的软组织肉瘤子组之一,尤其是在青少年和年轻人1,2]。定义的细胞遗传学的易位t (X; 18) (p11.2; q11.2)发现在人类滑膜肉瘤的融合结果SYT基因在染色体18日SSX1, SSX2,或SSX4 Xp11.2 X染色体上,形成SYT-SSX融合的成绩单(3- - - - - -5]。这种融合转录竞争与野生型SS18组装,形成一个复杂缺乏改变肿瘤抑制BAF47 (hSNF5),导致Sox2激活,导致滑膜肉瘤肿瘤细胞扩散(6]。SYT-SSX也已被证明影响polycomb-mediated基因镇压和瑞士/ SNF染色质重塑以及管制WNT -β连环蛋白信号在滑膜肉瘤7]。有趣的是,虽然表情SYT-SSX2癌蛋白导致感应的滑膜肉瘤不成熟的成肌细胞外显率100%,其表达更加分化的细胞诱导肌病没有肿瘤诱导的小鼠模型(8]。

SYT-SSX融合转录本的存在使特定的和敏感的滑膜肉瘤的分子诊断,在几乎所有检测滑膜肉瘤组织(9,10]。如最近的荟萃分析的10所示的研究包括902例滑膜肉瘤,在总体存活率没有显著差异,针对疾病的存活率与滑膜肉瘤患者表达SYT-SSX1 SYT-SSX2融合基因;然而,SYT-SSX1似乎代表一个不利预后因素的发展,metastasis-free生存(11]。然而,融合基因为生存的预后价值仍然是一个有争议的问题(10,12]。

因为它已被证明,肿瘤细胞释放小囊泡含有特异性蛋白质,表面标记,甚至mRNA变体具体某些肿瘤如EGFRvIII拼接变体在胶质母细胞瘤(13),本研究的目的是评估是否滑膜肉瘤细胞脱落的微泡携带肿瘤特异性融合基因SYT-SSX记录。此外,本研究分析了不同方法的灵敏度的检测SYT-SSX融合基因作为滑膜肉瘤的潜在生物标志物。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

人体滑膜肉瘤细胞(细胞系1273/99,请由马库斯·雷纳博士提供病理学研究所海德堡大学),哪个港口SYT-SSX2融合基因(14),培养在F-12营养混合物(火腿)(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)补充10%的边后卫优越和100 U /毫升Penicillin-Streptomycin。THP-1细胞(人类急性单核细胞的白血病细胞株)是1640年RPMI培养基培养(谷酰胺;生命技术)补充10%的边后卫优越和100 U /毫升Penicillin-Streptomycin。

2.2。Microvesicle-Purification滑膜肉瘤细胞

因为胎牛血清是描述包含细胞外囊泡可能改变肿瘤微泡的分析结果(15在microvesicle-free培养基培养),滑膜肉瘤细胞(包含microvesicle-depleted 5%胎牛血清DMEM /足协)直到confluency 80%,由超速离心法在110000 g 16 h去除牛斯库格所描述的微泡等。13)和条件培养基收集后48 h。微泡是纯化条件的上层清液通过差速离心步骤如前所述[16]。简单,条件培养基是离心10分钟300 g,消除细胞污染。上层清液进一步离心20分钟16500 g。微泡然后sterile-filtered (0.22μ米)和颗粒状超速离心法在110000克80分钟。微泡球然后洗在PBS,颗粒状再一次80分钟110000克、溶解在PBS,储存在−80°C,直到进一步的使用。

2.3。透射电子显微镜(TEM)

滑膜肉瘤细胞被镀在玻璃幻灯片24-well盘子。confluency 80%,媒介被细胞冲洗和孵化在PBS 37°C 90分钟以触发微泡释放。细胞随后用PBS和固定0.1磷酸盐缓冲剂(PB)含有4%多聚甲醛(PFA)和2%戊二醛(GA) 30分钟。细胞在ddH然后冲洗₂O为每个10分钟和0.1 PB和osmicated (1% OsO₄和6.86%蔗糖的0.1 PB) 40分钟。之后,这些细胞被冲洗几次在0.1 PB,沉浸在50%乙醇(EtOH) 10分钟,孵化在1%醋酸双氧铀在70% EtOH 35分钟,和一系列分级脱水乙醇(90%、95%和100%)。在氧化丙烯洗涤两次10分钟后,玻璃盖玻片上附带的细胞都沉浸在1:1的混合物氧化丙烯和Durcopan(丙烯酰胺、书、瑞士)1 h。其次是嵌入Durcopan隔夜的细胞;然后,他们被安装在盖玻片和新鲜Durcopan留给孵化24 h聚合的56°C。(40 nm)超薄部分被剪掉了,收集Formvar-coated镍电网和数字拍摄(LEO 906 E,蔡司、从德国)使用SIS软件(奥林巴斯,汉堡,德国)。描述的方法以前Hellwig et al。17)和适应轻微的改变。

为了提供鉴定的证据从滑膜肉瘤细胞释放的微泡,微泡纯化使用上面描述的差速离心步骤进一步分析了TEM。简单地说,5分钟后吸附、固定的微泡球团进行了5分钟,用1%戊二醛(GA)。微泡球被冲洗在ddH的四倍₂O和负染法进行1分钟使用1%醋酸双氧铀。负染色方法的对比是不应用于对象,但它的环境,结果像倒置的传统TEM图像(18]。微泡然后数码拍摄如上所述。

2.4。纳米粒子跟踪分析(NTA)

NTA进行了使用ZetaView®PMX 110纳米粒子跟踪分析器(粒子矩阵,Meerbusch,德国)和相应的ZetaView®软件。相机快门速度维持在130 ms。样本在sterile-filtered PBS稀释浓度的1:500纯化滑膜肉瘤微泡,1:1000 - 1:2500纯化血清微泡的滑膜肉瘤患者。视频记录在11个位置用摄影机和5周期敏感性从65%到81%不等。手动温度监测,范围从21.0到22.0°C。

2.5。核糖核酸酶治疗

评估是否融合基因转录在场在微泡,颗粒溶解在PBS,孵化为30分钟37°C与核糖核酸酶A(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国在100年最终浓度μg / mL或PBS负控制之前RNA提取如前所述的斯库格等。

2.6。研究人群

所有患者纳入本研究接受治疗从跨学科的肿瘤专家委员会综合癌症中心的弗莱堡(信心)。检测SYT-SSX融合转录本的显色原位杂交(CISH),荧光原位杂交(FISH),或者qPCR滑膜肉瘤的诊断确认。活跃的滑膜肉瘤患者的研究人群中,七面对转移疾病,而下肢出现局部的疾病之一。的两个患者接受化疗和一个病人接受放射治疗在过去六周内血液之前撤军(表3)。对照组由健康成年人匹配滑膜肉瘤组在年龄、性别和体重指数(BMI)(表4)。

2.7。伦理、许可和权限

签署知情同意是获得所有的参与者,让血液样本的分析,肿瘤组织,所有的临床数据。德国的弗赖堡Albert-Ludwigs-University的伦理委员会,批准了这项研究。研究的设计和性能符合《赫尔辛基宣言》。

2.8。血液采样

所有血液样本收集由肘前的静脉穿刺通过20量度针没有止血带。第一个3毫升的血液被丢弃。

2.9。全血RNA

每个2.5毫升的全血收集和稳定PAXgene血液中RNA管(PreAnalytiX、Hombrechtikon、瑞士)如前所述,凯勒et al。19]。RNA管孵化了至少2个小时在室温下(RT)后采血,以确保完整的血细胞溶解,然后被存储在−20°C,直到进一步的处理。在开始过程之前,他们是平衡至室温。总RNA > 18个核苷酸(包括microrna)纯化使用PAXgene血液microrna的手动工具(PreAnalytiX)根据制造商的协议。

2.10。分离单核细胞分数

大约9毫升肝素化活跃的滑膜肉瘤患者的外周血和一半的PBS稀释,然后轻轻地覆盖在4毫升Biocoll分离解决方案(Biochrom AG),柏林,德国)和离心机在1200克15分钟沿层含有单核细胞分离的接口,与10毫升PBS稀释,在300 g离心5分钟。浮在表面的丢弃,颗粒溶解在4.5毫升的边后卫(胎牛血清优越;Biochrom AG)、补充10%二甲基亚砜(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),然后被存储在−80摄氏度,直到进一步的使用。

2.11。Microvesicle-Purification的血清样本

7毫升的从健康对照组血清样本,滑膜肉瘤患者离心机在2500克15分钟rt,上层清液然后进一步离心机在2500 g在rt,随后被颗粒状的微泡15分钟超速离心法在110000克80分钟前面描述的斯库格等。13在PBS)和洗一次。15的颗粒得以解决μL PBS之前RNA提取。

2.12。RNA隔离

总RNA的细胞和微泡是纯化使用RNeasy迷你包(试剂盒、希尔登,德国)根据制造商的协议。RNA是量化使用Nanodrop 2000(热费希尔科学)。

2.13。毛细管电泳

RNA细胞和微泡的数量和质量进行评估,使用片段毛细管电泳分析仪(GmbH是一家现代化的、先进的分析技术、海德堡、德国)和标准/高灵敏度RNA分析工具。

2.14。DNase-I消化和转化的互补

RNA是孤立和DNAse消化和转化为互补脱氧核糖核酸是由DNAse-I,放大级设置(生命技术),AffinityScript多温度互补脱氧核糖核酸合成装备(美国安捷伦科技,圣克拉拉,CA)根据制造商的协议。10分钟的逆转录反应是孵化25°C,其次是1 h 42°C和15分钟在70°C。

2.15。qPCR

SYT-SSX1和SYT-SSX2融合基因的检测,qPCR都使用了绝对qPCR火箭混合(热费希尔科学)和以下引物:SS18-SSX1 + FAM (Hs 03024820 _ft) SS18-SSX2 + FAM (Hs03024398_ft) (TaqMan基因表达分析;生命技术),GAPDH-Primer集(GAPDH GAPDH-probe 899年- 875 f, GAPDH 946 - r;欧陆坊MWG操纵子,亨茨维尔,美国)作为内部控制。短暂,自行车在95°C条件酶激活了15分钟,其次是50周期的变性在95°C 15 s和退火/扩展60°C 1分钟。Ct-values < 39被认为是积极的。

2.16。嵌套PCR

嵌套PCR进行使用TaqPCR核心设备(试剂盒)根据制造商的协议。下面的PCR引物被用于第一轮PCR: 5-CAACAGCAAGATGCATACCA-3 5-CACTTGCTATGCACCTGATG-3。第二轮PCR引物的设计放大SYT-SSX1和SYT-SSX2亚型:5-ACAGCCTGGACCACCACAGC-3 5-AGGCATGTTTCCCCCTTTTG-3,产生212碱基对(bp)的PCR产物。引物序列是改编自桥本et al。20.]。循环条件35周期在94°C的变性40年代,退火在50°C 1分钟,在72°C和扩展1分钟后94°C的初始变性步骤3分钟。之后,最终在72°C扩展步骤进行了10分钟。

2.17。嵌套qPCR

qPCR进行第二轮PCR产物的嵌套PCR从全血,微泡,滑膜肉瘤和健康的捐赠者的单核细胞分数使用SS18-SSX1 + FAM (Hs 03024820 _ft)和SS18-SSX2 + FAM (Hs03024398_ft)引物。

2.18。液滴数字PCR (ddPCR)

液滴数字PCR进行了使用SS18-SSX1 + FAM (Hs 03024820 _ft)和SS18-SSX2 + FAM (Hs03024398_ft)引物和QX100 ddPCR系统(美国Bio-Rad大力神,CA)根据制造商的协议。在此,PCR扩增进行在每个液滴使用热循环后分区QX100样本到液滴的液滴发生器。PCR后,液滴流在单个文件QX100滴读者,计数荧光积极和消极滴计算目标RNA浓度。事件计数< 5解释为没有检测到,因为消极控制显示五个事件。

2.19。统计数据

值低于0.05被认为是具有统计学意义。使用学生的进行了统计分析以及独立样本。

数据提出了均值的平均值±标准误差(SEM)。所有的数据进行了分析与GraphPad棱镜6.0 (GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)。

3所示。结果与讨论

电子显微镜显示滑膜肉瘤细胞释放微泡包围保护膜(数据1(一)- - - - - -1 (d))。滑膜肉瘤差速离心纯化的微泡步骤由电子显微镜(图进行进一步分析2),显示对应于微泡释放滑膜肉瘤细胞中描述的数据1(一)- - - - - -1 (d)在大小和方面。

进一步描述微泡,纳米颗粒(NTA)进行了跟踪分析。微泡纯化从活跃的滑膜肉瘤患者的血清显示出类似的平均直径的峰值相比,微泡纯化从滑膜肉瘤细胞(151.7 nm(数字3(一个)- - - - - -3 (c))和154.4 nm(数据3 (d)- - - - - -3 (f)),职责)。平均浓度水平的微泡在活跃的滑膜肉瘤患者血清和滑膜肉瘤细胞上清液分别为3155.0×10⁹粒子/毫升(数据3(一个)- - - - - -3 (c))和18.60×10⁹粒子/毫升(数据3 (d)- - - - - -3 (f)),分别。

执行生物分析法的RNA滑膜肉瘤微泡及其起源的细胞,在RNA大小分布被发现显著差异,微泡RNA缺乏细胞的核糖体RNA的峰值特征RNA(图4)。

在体外,SYT-SSX2融合基因转录中检测出滑膜肉瘤细胞和微泡()(图5(一个)),微泡核糖核酸酶治疗只显示一个小降低融合基因的信使rna比未经处理的微泡()(图5 (b)),从而表明mRNA包含在微泡,防止脂质双分子层的核糖核酸酶。

qPCR比较嵌套qPCR的灵敏度时,嵌套PCR,和液滴数字SYT-SSX2融合基因转录的PCR检测滑膜肉瘤细胞和微泡,嵌套qPCR qPCR显示最高灵敏度的检测融合基因转录在微泡和细胞,而ddPCR显示最低的敏感性(表1和2)。

然后我们使用不同的化验检测SYT-SSX融合转录本的滑膜肉瘤患者的外周血样本。分析相应的肿瘤组织透露,两名患者SYT-SSX2融合基因表型,而五提出SYT-SSX1表型(21],它被认为是更常见的(10,22]。没有一个病人的肿瘤组织进行分析。疾病和治疗肉瘤病人的状态信息见表3。滑膜肉瘤患者()从健康对照组没有显著差异()有关年龄、体重指数、血红蛋白(Hb)水平、血小板和白细胞计数(表4)。

嵌套qPCR(图6(一)),qPCR(图6 (b)),嵌套PCR(图7),和ddPCR(图8)没有检测到SYT-SSX1/2融合基因转录本在提取的全血,单核细胞,微泡的滑膜肉瘤患者和健康的捐赠者。

因此,我们可以显示滑膜肉瘤细胞释放小泡窝藏滑膜肉瘤特异性融合基因转录SYT-SSX。在此,RNA中包含这些微泡的大小分布显著不同的细胞来源。如图所示的耐核糖核酸酶治疗,融合基因转录似乎位于保护微泡膜。据我们所知,这是第一个研究表明SYT-SSX融合记录存在不仅在滑膜肉瘤细胞,而且在滑膜肉瘤微泡。

因为它已经表明肿瘤微泡作为胞间信使,激活信号通路,调节细胞生存当被其他细胞如单核细胞吞噬23),滑膜肉瘤肿瘤微泡可能作为重要介质,与免疫细胞在肿瘤的边缘,整个循环以及附近的宿主组织。在这种背景下,Andreola等人表明,肿瘤细胞释放Fas ligand-bearing微泡,触发Fas-dependent凋亡的淋巴细胞,从而削弱功效的抗肿瘤免疫反应,一种机制被称为“Fas肿瘤反击”[24]。这一发现表明,检测到肿瘤微泡的主要角色之一的角色可能会“自卫军”干扰淋巴细胞和其他免疫细胞,阻碍他们从应用抗肿瘤活性。因为它可以证明,肿瘤细胞与高转移潜能释放肿瘤微泡量大于细胞转移能力较低(25),微泡似乎理想的生物标志物的检测肿瘤的活动。这可能进一步被这一事实突显出,滑膜sarcoma-specific融合基因的检测微泡可以发现在他们的细胞总RNA浓度远低于原产地(表1和2)。嵌套qPCR显示是到目前为止最敏感的检测方法SYT-SSX融合基因转录,其次是qPCR、嵌套PCR和ddPCR(表1和2)。这符合Amary et al .,进行的一项研究表明,当采用qPCR常规PCR检测引物,SYT-SSX融合基因在大约50%的情况下可以找到最初SYT-SSX归类为负,而且表明qPCR显示了最高灵敏度相比常规rt - PCR和鱼。然而,这可能是基于PCR引物设计也可能产品的大小而不是检测的方法(26]。通过嵌套PCR和qPCR,我们可以进一步增加的敏感性SYT-SSX融合基因检测由几个大小,这对滑膜肉瘤的诊断可能是有用的,当只有很小的肿瘤样本是可用的,例如,在芯针吸活组织检查。

不过,qPCR并不能证明总是优于ddPCR在其他应用程序中。Drandi等人发现ddPCR比得上qPCR当检测免疫球蛋白基因重排和BCL2 /免疫球蛋白基因主要在多发性骨髓瘤断点地区重排,套细胞淋巴瘤,滤泡淋巴瘤(27]。丰达涅利等人出现ddPCR略高灵敏度的检测JAK2V617F突变Philadelphia-negative慢性骨髓增殖性肿瘤相比qPCR [28]。然而,当评估巨细胞病毒负荷在临床样本,qPCR表现出更大的敏感性比ddPCR [29日]。也按照我们的研究中,Kiselinova等人表明ddPCR的主要缺点是大量的假阳性结果时比较ddPCR和seminested qPCR unspliced用拼接hiv - 1 RNA的量化,没有模板控制是一贯消极的seminested qPCR但产生了积极的ddPCR信号(30.]。因此,似乎每个方法的敏感性变化在不同的研究,可能是主要依赖于PCR引物的设计和产品的大小。

到目前为止,只有少数研究肉瘤的潜在生物标志物。最近,特定的microrna的概要文件被发现在滑膜肉瘤患者的外周血21和横纹肌肉瘤31日]。同时,研究引发了循环肿瘤细胞的领域,已被发现在一些恶性肿瘤(32,33),这被证明与疾病和转移的阶段(34)以及无进展和整体生存(35不同的肿瘤。Satelli等人检查细胞表面波形蛋白作为普遍使用单克隆抗体标记对循环肿瘤细胞,证实肉瘤患者的积极性的循环肿瘤细胞通过血液化验飙升和免疫荧光染色36]。然而,波形蛋白被描述在各种恶性肿瘤(37,38),因此很难作为一个特定的生物标志物。

如一个病例报告所述,桥本等人设法检测肿瘤细胞表达SYT-SSX融合基因转录的22岁的孕妇外周血与滑膜肉瘤嵌套PCR (20.]。因此,一个更具体的方式分析中循环肿瘤细胞的存在肉瘤可以具体融合基因的检测记录,如SYT-SSX融合基因mRNA在滑膜肉瘤,EWS-ERG和EWS-FLI1融合在尤因肉瘤(EWS)和原始记录Neuroectodermal肿瘤(PNET) [39- - - - - -41),PAX3-FKHR或PAX7-FKHR融合转录在肺泡横纹肌肉瘤(42),或者ASPSCR1-TFE3融合转录泡软部分肉瘤(asp) [43]。尽管桥本等人发现了SYT-SSX融合基因产物的孕妇外周血有一个很大的大腿的滑膜肉瘤切除术前的肉瘤,SYT-SSX融合基因转录后无法检测到肺转移的发展,表明循环肿瘤细胞减少肿瘤切除术后无法检测到的水平(20.]。

循环肿瘤细胞携带sarcoma-specific mRNA融合基因转录只发现在几个肉瘤患者。等到等人发现外周血循环肿瘤细胞的转移患者的22%和20%的患者局部尤因肉瘤(39]。星野等人发现了asp的特定融合基因转录,ASPSCR1-TFE3,外周血样本1 asp远处转移患者[43),而凯利等人没有检测到PAX3-FKHR或PAX7-FKHR融合转录肺泡横纹肌肉瘤在任何特定的肺泡横纹肌肉瘤患者的外周血样本,但在少数病人的骨髓42]。这表明,在许多肉瘤患者循环肿瘤细胞是无法检测到的水平降低。

事实上,斯库格等人发现胶质母细胞瘤的肿瘤特异性EGFRvIII mRNA变体特定血清微泡的胶质母细胞瘤患者(13)进一步支持我们发现循环tumor-derived微泡携带肿瘤特异性mRNA,所以可能会作为高度特定的肿瘤标记物。斯库格等人进一步表明tumor-derived微泡传递遗传信息和蛋白质周围细胞在肿瘤周边和诱导人神经胶质瘤细胞的增殖。

因此,正如肿瘤特异性突变信使rna可以从胶质母细胞瘤患者,血清中检测出微泡tumor-derived微泡可能是一个有用的工具诊断以及恶性疾病患者的治疗决策。

这尤其重要,因为这些肿瘤特异性mrna可以使高度敏感检测肿瘤微泡,当我们能够探测到SYT-SSX融合嵌套总微泡qPCR RNA转录的只有6 pg(表2),这是不到一个细胞的RNA含量。

虽然我们可以证明SYT-SSX融合基因转录有滑膜肉瘤微泡,微泡的融合转录无法检测到从滑膜肉瘤患者的外周血分离。因此,尽管肿瘤微泡似乎是理想的生物标志物对滑膜肉瘤,更敏感的方法需要发达的末梢循环检测。

4所示。结论

滑膜肉瘤细胞释放微泡哪个港口SYT-SSX融合记录在他们的保护膜。这些囊泡可能作为诊断的生物标志物;然而,需要更敏感的化验检测癌症特异性微泡在癌症患者的外周血。

缩写

asp:	肺泡软部分肉瘤
体重指数:	身体质量指数
CISH:	显色原位杂交
分布反馈:	Microvesicle-depleted胎牛血清
EWS:	尤因肉瘤
鱼:	荧光原位杂交
ddPCR:	液滴数字聚合酶链反应
Hb:	血红蛋白
NTA:	纳米粒子跟踪分析
聚合酶链反应:	聚合酶链反应
PNET:	原始Neuroectodermal肿瘤
qPCR:	定量聚合酶链反应(实时)
RT:	室温
rt - pcr:	逆转录-聚合酶链反应
透射电镜:	透射电子显微镜。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢克里斯蒂娜·恩格尔她的技术支持,托马斯•Boschet桑德拉斯特拉斯堡博士博士和教授Gunter Finkenzeller宝贵的建议,和马库斯·雷纳博士建议,这种捐赠滑膜肉瘤细胞系1273/99。这项工作是支持的德国研究基金会(DFG)赠款EI 866/1-2和866 / 2 - 1 PD史蒂芬博士Eisenhardt和海森堡奖学金由DFG PD史蒂芬博士美国Eisenhardt (EI 866/4-1)以及研究委员会的弗莱堡大学医学院(批准号3095120017)博士大卫Braig。

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