环丙沙星具备干细胞改善人毛乳头细胞

文摘

改善成人干细胞可能增加他们的扩张方法使用的再生治疗。使用人类真皮乳头细胞行以及主要毛乳头细胞作为模型系统,目前的研究表明,环丙沙星在文化具备干细胞治疗可以防止损失。Clonogenicity和干细胞标记毛乳头细胞的逐渐减少文化时间的方式。治疗的细胞无毒的环丙沙星浓度可以维持干细胞形态学和clonogenicity,以及所有干细胞标记。我们发现,环丙沙星施加其影响通过ATP-dependent酪氨酸激酶/糖原合酶kinase3β进而调节依赖机制β连环蛋白。此外,环丙沙星显示诱导epithelial-mesenchymal过渡在dpc转录因子ZEB1和蜗牛都显著增加。此外,自我更新蛋白质Wnt /β连环蛋白通路,即Nanog在ciprofloxacin-treated Oct-4明显调节细胞。环丙沙星在维持干细胞特性的影响被证实在初选中直接获得从人类头发毛囊毛乳头细胞。这些结果显示环丙沙星对干细胞的创新应用提供底层机制,负责维护和毛乳头细胞具备干细胞。

1。介绍

基于毛乳头细胞(dpc)与毛囊上皮干细胞可以诱导生成新的(1- - - - - -3),细胞疗法使用dpc毛发移植已成为一个潜在的新方法(4,5]。dpc已经深入调查为细胞疗法的方法具有许多优点。然而,许多研究也证明具备干细胞的丧失和归纳活动期间在体外段落(4,6- - - - - -8]。

毛囊上皮和间质组成的隔间。dpc,主要的细胞群中存在间充质隔间,位于毛囊的基础和功能作为一个信号中心毛囊形态发生和生长周期9]。这些细胞通过特定的信号指示上皮干细胞的增殖和分化成多层生长头发轴(1- - - - - -3]。有趣的是,dpc都被定性为多功能干细胞和具备干细胞的细胞紧密相关的诱导毛囊形成的能力。干细胞生物学的综合知识,CD133的证据表明,人类干细胞的蛋白质标记,导致头发dpc的归纳属性在转基因小鼠10,11]。此外,消融的干细胞相关转录因子包括Sox2在dpc导致头发的损伤轴结果(12]。虽然具备干细胞调控的分子特性以及头发归纳函数在这些专业dpc仍然不太为人所知,Wnt /β连环蛋白信号似乎强烈支持借给毛囊形态发生和再生13- - - - - -15]。的确,β连环蛋白显示调节毛囊形成的关键信号通路在回应一些刺激,包括纤维母细胞生长因子(FGF)和胰岛素样生长因子(IGF) [13]。在转基因小鼠模型中,压制β连环蛋白的dpc导致毛囊形成的抑制(13),epithelial-mesenchymal过渡(EMT)最近被证明能够发挥重要作用的干细胞行为和激活Wnt /β连环蛋白信号显示激活的过渡上皮细胞向间充质干细胞。一起在细胞中转录因子的概念呈现接受EMT像蜗牛被发现是重要的成就的干细胞功能(16- - - - - -18),很可能这些β连环蛋白和EMT可能影响具备干细胞和干细胞dpc的活动。

环丙沙星(CIP)已经被用作预防抗生素预防细菌感染患者接受干细胞移植和干细胞研究[19,20.]。此外,这相当安全的药物被广泛用于治疗某些感染的细胞培养(21]。到目前为止,人类细胞生物学CIP的分子基础尚未全面调查,特别是在干细胞研究领域。因此,本研究旨在阐明CIP的可能作用的具备干细胞可能影响dpc使用人类真皮乳头细胞行和初级人类真皮乳头细胞模型。

2。材料和方法

2.1。细胞和试剂

不灭的毛乳头细胞(dpc)从应用生物材料有限公司(里士满,公元前,加拿大)。Prigrow三世的细胞培养介质(公元前里士满,加拿大)补充10%胎牛血清(的边后卫)和100单位/毫升的青霉素和链霉素(生活技术,医学博士,美国)37°C公司5%₂的气氛。人类主要dpc,他们来自PromoCell(德国海德堡)。的细胞培养介质含有牛脑垂体提取物4μL / mL,胎牛血清0.05毫升/ mL,碱性纤维母细胞生长因子1 ng / mL,重组人胰岛素5μg / Ml和酚红0.62 ng / Ml PromoCell(德国海德堡),和100单位/毫升的青霉素和链霉素37°C的5%的股份有限公司₂的气氛。环丙沙星(CIP)和二甲亚砜(DMSO)购买的σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。赫斯特33342年和propidium碘(π)从分子探针获得Inc .(尤金,或者美国)。(3)- 4 5-Dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)和Alexa萤石488/594共轭二次抗体来自表达载体(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。整合素兔单克隆抗体β1,磷酸化ATP-dependent酪氨酸激酶(473年Akt, Ser),一种蛋白激酶磷酸化,糖原合酶kinase3β(GSK3βGSK3 Ser 9)β,Nanog ZEB1 Oct-4蛞蝓,蜗牛,波形蛋白,N-cadherin,磷酸化细胞外signal-regulated激酶(Erk)的兵,β肌动蛋白和过氧化物酶共轭anti-rabbit免疫球蛋白g细胞获得信号(美国丹佛,MA)。兔子CD133抗体从细胞应用程序(aapl . o:行情)收购。(美国圣地亚哥,CA)。兔子胶原I型抗体,山羊醛脱氢酶1 a1抗体(ALDH1A1)和过氧化物酶共轭抗体免疫球蛋白是来自圣克鲁斯生物技术有限公司(美国德克萨斯州达拉斯)。止动剂西方化学发光底物合从密理博公司(Billerica, MA)和热费希尔科学Inc .(罗克福德,IL)。

2.2。细胞生存能力分析

MTT可行性分析是用来评估细胞的可行性。细胞被播种密度1×10⁴细胞/ 96年和培育12 h -板。之后,这些细胞被孵化与不同浓度的CIP(清廉μg / mL) 24 h。细胞被孵化与5毫克/毫升MTT 4 h在37°C。然后,上层清液被删除,取而代之的是100年μL (DMSO溶液溶解甲瓒晶体。MTT产品的强度为570 nm使用标(Anthos、杜伦、数控)。细胞生存能力由下列公式计算,提出了未经处理的控制比例值

2.3。核染色试验

赫斯特33342年和πcostaining被用来检测凋亡和坏死细胞死亡。细胞被播种密度1×10⁴细胞和培养12 h /好。随后,细胞治疗与不同浓度的CIP(清廉μ为进一步24 h g / mL)。治疗后,这些细胞被沾染了10μ米赫斯特和5μ克/毫升的π为30分钟37°C和可视化通过荧光显微镜(奥林巴斯第九51 DP70,奥林巴斯Inc .)、美国中心山谷,PA)。

2.4。细胞形态学和聚合行为评估

DP细胞被播种密度的6×10³细胞/到24-well板和孵化12 h。细胞治疗与不同浓度的CIP(清廉μ72 h g / mL),细胞形态学观察到0,24、48和72 h。细胞的聚集行为决定在72 h。细胞形态学和聚合行为通过相差显微镜拍摄(奥林巴斯IX51 DP70,奥林巴斯美国公司,中心山谷,PA)。

2.5。细胞周期分析

细胞被播种在3×10的密度⁴一夜之间细胞/到6-well板和孵化。细胞培养的CIP(10的存在与否μ72 h g / mL)。显示治疗后,细胞在缺乏生长因子孵化24 h。细胞被孵化完成媒体12 h,使胰蛋白酶化和固定绝对70%乙醇在一夜之间−20°C。这些细胞被洗冷PBS和孵化Triton-Xπ的解决方案包含0.1%,1μg / mL核糖核酸酶,1毫克/毫升propidium碘在37°C为30分钟。早期的细胞通道(通道2 - 3)没有serum-starvation被用作一个未经处理的控制在0 h。在整个细胞DNA沾π,使用流式细胞术和细胞周期进行了分析(FACSort,正欲,卢瑟福,新泽西,美国)。

2.6。免疫荧光

细胞被播种在3×10的密度⁴细胞/到盖玻片在一夜之间6-well板和孵化。细胞培养在环丙沙星(10的存在与否μ72 h g / mL)。早期的细胞通道被用作一个未经处理的控制在0 h。盖玻片是与4%多聚甲醛固定20分钟和permeabilized Triton-X 0.1%在室温下10分钟。此后,盖玻片是孵化3%牛血清白蛋白(BSA)在室温下30分钟,以防止非特异性结合。盖玻片是水洗和CD133孵化或胶原类型我兔单克隆抗体1:100稀释一夜之间在4°C。主要抗体孵育后,盖玻片和Alexa萤石洗PBS和随后孵化488或594共轭二次抗体在室温下1 h。样本检验和共焦激光扫描显微镜(510年蔡司LSM)分析CD133的表达及胶原I型。

2.7。免疫印迹分析

细胞被播种密度的5×10⁴细胞/好到6-well板12 h和培养在不同浓度的CIP (2.5 -10μ72 h g / mL)。与PBS洗细胞后,细胞溶解产物是由孵化的细胞包含20毫米三冰冷的裂解缓冲Triton X盐酸(pH值7.5),0.5%,10%的甘油,150毫米氯化钠,氟化钠50毫米,1毫米钠原钒酸盐,1毫米phenylmethylsulfonyl氟化物,和商业蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏分子生化药剂)45分钟在冰上。随后,细胞溶解产物收集和确定蛋白质含量由布拉德福德(Bio-Rad大力神,CA)方法。每个样本(50的等量的蛋白质μg)煮在Laemmli加载缓冲区在95°C 5分钟。随后被加载到10% SDS-polyacrylamide电泳的蛋白质。分离后,蛋白质被转移到0.45μm硝化纤维素膜(Bio-Rad)。与5%的脱脂牛奶阻塞后TBST三(25毫米Tween-20盐酸(pH值7.5),0.05%,125毫米氯化钠)2 h,以适当的主要抗体膜被孵化10 h在4°C。膜清洗三次TBST 15分钟和孵化与辣根peroxidase-coupled二级抗体在室温下1 h。免疫复合物与化学发光检测底物(SuperSignal西Pico,皮尔斯,罗克福德,IL)和量化分析师/ PC微软件(Bio-Rad)。

2.8。统计分析

数据从至少四个独立的实验,提出了获得意味着±标准差(SD)。统计分析了使用单向方差分析和事后测试在显著性水平(α0.05)。这些分析使用SPSS版本19 (SPSS Inc .,芝加哥,IL)。

3所示。结果

3.1。CIP dpc的生存能力的影响

研究的角色CIP dpc的干细胞特性,我们首先为细胞生存能力和细胞死亡反应CIP治疗dpc使用MTT和赫斯特33342 / propidium碘(π)costaining化验。治疗的细胞浓度的CIP清廉μg / mL 24 h没有造成重大变化在细胞生存能力与控制水平(图1(一))。与赫斯特/π细胞凋亡测定一致,我们的结果显示,在治疗药物在这种浓度引起的细胞凋亡和坏死被赫斯特和π,分别(图1 (b))。这些信息可能有助于澄清以下CIP对dpc的影响没有细胞毒性效应或细胞压力的结果。

3.2。CIP保持干细胞的dpc的特征

dpc已报告作为多功能干细胞和dpc的具备干细胞与诱导毛囊的能力(10- - - - - -12]。然而,dpc失去毛囊感应能力在文化(4,6- - - - - -8]。后我们发现,培养5天的dpc, dpc的形状和外观是自发向呈形态学改变。原始dpc通常出现纺锤状细胞改为平多极细胞细长的形状(图2(一个))。此外,dpc开始时显示一个综合增长模式等文化和模式是失去了在长时间的培养。为了测试是否CIP影响这些dpc的形态学变化,细胞治疗与CIP清廉的浓度μ为0 - 72 h g / mL,形态的细胞以及综合模式确定。图2(一个)显示,大部分未经处理的控制表现出纤维母细胞形态学48和72 h。与此同时,CIP治疗细胞的形态学改变(图2(一个))。因为毛囊dpc的归纳属性已被证明与与他们的聚合行为(22),我们进一步研究了CIP治疗的效果综合增长模式的细胞。dpc在早期通道(通道2 - 3)中培养存在与否的CIP 72 h和总规模和数量确定。数据2 (b),2 (c),2 (d)表明,CIP在5和10的浓度μg / mL的大小以及数量显著增加细胞聚合相比,那些未经处理的控制在72 h。

间充质细胞已被证明是slow-cycling细胞,我们下一个调查的影响CIP dpc的增殖和细胞周期分布。dpc的培养存在与否的CIP 72 h和受细胞周期评估。缺乏生长因子的细胞被孵化24 h。然后,这些细胞被孵化完成媒体12 h和细胞周期进展分析了π和流式细胞分析仪。此外,在早期的段落没有serum-starvation dpc用作控制。数据2 (e)和2 (f)表明,12小时后细胞生长因子,未经处理的控制细胞在72 h开始阶段的细胞周期。重要的是,治疗的细胞10μg / mL CIP减毒细胞周期进展,细胞不能进入有丝分裂期。此外,细胞周期分布量化节中描述2。5。结果证实了上面的发现,细胞的治疗与CIP显著减少在G2 / M期细胞群(数字2 (e)和2 (f))。

3.3。CIP的差别可以防止对这些干细胞标记dpc

有显示文化引起的dpc干细胞的表型的自发的下降,我们下一个明确提到概念通过检测干细胞标记细胞。因为CD133及胶原I型表达式被公认为毛乳头细胞和纤维母细胞指标,分别为(11,23,24),我们分析了这种蛋白质的表达dpc处理浓度的CIP 10μg / mL 72 h和控制细胞。免疫细胞化学表明,CD133的表达与CIP镇压72 h的dpc细胞培养后相比,控制细胞(dpc在早期通道0 h,人物3(一个))。细胞与CIP的治疗可以显著预防这类损失CD133表达在细胞(图3(一个))。这些结果表明,CIP保持dpc的具备干细胞在文化。同时,纤维母细胞胶原I型标志的表达水平显著增加在未经处理的dpc细胞72 h,而增加纤维母细胞标记可以预防由CIP 10的浓度μ克/毫升(图3(一个))。

我们进一步利用的信息表明,CIP防止具备干细胞在培养dpc的损失。通过利用CD133,整合素β1,ALDH1A1毛乳头标记及胶原I型纤维母细胞标记,细胞培养分析了CIP的存在与否对蛋白质免疫印迹分析。图3 (b)表明胶原类型我的表达调节时间的方式,而CIP治疗可以防止这种蛋白质的增加。正如所料,所有的间叶细胞相关蛋白包括CD133,整合素β1,ALDH1A1在未经处理的控制细胞逐渐减少时间的方式和治疗的细胞与CIP抑制减少蛋白质的标记(图3 (b))。我们也存在剂量依赖的相关性实验,以确保执行dpc具备干细胞药物的效果。结果表明,CIP增加了干细胞标记在这些细胞虽然减少成纤维细胞标记在剂量依赖性的方式(图3 (c))。

3.4。CIP激活Wnt /β连环蛋白信号和dpc Epithelial-Mesenchymal过渡(EMT)

激活Wnt /β连环蛋白信号被证明干细胞维护起到了关键的作用[25- - - - - -27和头发再生13- - - - - -15]。此外,毛囊培养dpc诱导效应可能延长暴露细胞Wnt /β连环蛋白激活剂(14,15]。基于这些数据,它是承诺CIP可能具备干细胞发挥积极作用在dpc通过这个途径。Wnt信号蛋白相关β连环蛋白包括Akt激活(磷酸化Akt在Ser 473),总Akt,灭活糖原合酶kinase3β(GSK3磷酸化β在Ser 9), GSK3父母β,β连环蛋白免疫印迹分析测定。

结果表明,Akt激活显著增强了治疗的细胞与CIP 2.5 -10μ克/毫升剂量依赖性的方式(图4(一))。因此,GSK3下游β被灭活治疗GSK3 CIP的磷酸化的增加β(图4(一))。作为GSK3β显示抑制降解的过程吗β连环蛋白,我们发现GSK3磷酸化的相应结果β导致增加了细胞β连环蛋白治疗的CIP dpc(图4(一))。这些数据暗示,dpc CIP具备干细胞保持至少部分通过增加细胞β通过一种蛋白激酶/ GSK3连环蛋白β途径。

最近,从epithelial-mesenchymal表型细胞转变的过程(EMT)已经获得了细胞生物学的兴趣,因为它是与各细胞(干细胞的特性16- - - - - -18]。此外,转录因子调节在EMT像蜗牛被证明在许多细胞维持干细胞的表型(16- - - - - -18]。为了澄清这是否EMT在干细胞维持CIP EMT-activating转录因子包括ZEB1,蛞蝓和蜗牛被西方墨点法确定CIP治疗细胞。孵化与CIP 72 h后,细胞水平的ZEB1和蜗牛显著调节;然而,我们发现,只有蛞蝓(图中最小的变化4 (b))。此外,我们已经确定下游基因的水平目标的蜗牛包括N-cadherin和波形蛋白(28,29日]。结果表明,这种蛋白质显著调节CIP-treated细胞(图4 (c))。这里值得注意的是,p-Erk(刺202 /酪氨酸204),激活下游目标的蜗牛30.),也发现在CIP-treated细胞增加。综上所述,我们的研究结果揭示了小说CIP的分子机制介导的干细胞的表型dpc通过β连环蛋白和EMT。

3.5。CIP增加自我更新dpc的转录因子

干细胞的自我更新是一个重要的签名(31日- - - - - -33]。提供支持性数据的影响CIP dpc具备干细胞,关键转录因子在干细胞维持多能性和自我更新,包括Nanog和Oct-4,测定(34,35]。治疗后细胞的5和10μCIP(图g / mL4 (b)),细胞表现出显著增加Nanog Oct-4方式存在剂量依赖的相关性,表明治疗诱导这些细胞的自我更新机制。

3.6。CIP维护主要人类dpc的干细胞的表型

确定的程度主要人类dpc将应对CIP治疗同样的方式,我们把孤立的人类dpc和清廉μg / mL CIP和评价干细胞特征,相应的行动。数据5(一个)和5 (b)表明治疗与清廉的细胞μg / mL CIP导致这些细胞没有直接细胞毒性。我们下一个测试了干细胞的签名特征评估CIP是否持续具备干细胞的这些主要的细胞。细胞培养的存在与否的CIP 72 h和干细胞的表达以及纤维母细胞标记决心如前所述。免疫印迹分析显示,CD133的水平,整合素β1,ALDH1A1显著增加在应对CIP治疗剂量依赖性的方式,而胶原I型的表达显著抑制(图5 (c))。此外,Wnt /β连环蛋白和EMT被西方墨点法评估。图5 (d)表明治疗的细胞与CIP显著增加Akt激活水平,GSK3灭活β,β连环蛋白。此外,EMT转录因子ZEB1和蜗牛是调节的治疗(图5 (e))。综上所述,这些数据支持我们的早期发现CIP维护dpc的具备干细胞通过β连环蛋白和EMT。

4所示。讨论

dpc已被证明具有表型可塑性通过区分不同的细胞类型36]。有趣的是,multipotency dpc被接受的一个重要因素决定的能力诱导毛囊形成(10- - - - - -12]。虽然在研究促进文化的进步这些特殊细胞,先前的研究表明,dpc逐渐下降的头发诱导财产在文化(4,6,7]。为了评估可能的方法来维持dpc签名在体外,我们首次发现了CIP具备干细胞能够防止dpc的损失在文化。治疗无毒浓度的dpc CIP阻止细胞的自发改变形态对纤维母细胞(图2(一个))。同时,免疫细胞化学和蛋白质分析显示,培养dpc干细胞标记物减少,这可以预防的除了CIP(数字3(一个)和3 (b))。此外,我们发现胶原I型的dpc的增加,这表明dpc可以本能地鉴别纤维母细胞(图3 (b))。这个观察是在协议与以前的报告表明dpc区分对纤维母细胞(23,24]。

关于干细胞研究,CD133跨膜糖蛋白,广泛用作标准生物标记的干细胞(37]。我们在早期发现dpc段落表现出高度的CD133;然而,这种蛋白质的表达下降时间的方式被发现在种植的时候,表明细胞具备干细胞失去。连同其他干细胞标记,CIP显示具备干细胞维持的dpc的CD133的稳定水平,ALDH1A和整合素β1(图3 (b))。ALDH1A1的存在,除此之外,解毒酶高表达干细胞,显示调节干细胞功能(38]。因此增加的蛋白质反应CIP治疗可以支持我们发现CIP维护具备干细胞的细胞。

在过去的十年中,已经取得相当大的进展,阐明干细胞信号通路,特别是Wnt /β连环蛋白是维持干细胞特性以及功能的关键(25- - - - - -27]。以前,研究报道,消融的β连环蛋白dpc导致头发生长和再生的抑制13]。的β连环蛋白功能cotranscription因子的t细胞因子/淋巴增强因子(TCF /中位数),因此调节蛋白的表达促进干细胞功能(39]。细胞水平上的β连环蛋白由GSK3严格控制β。的磷酸化βGSK3连环蛋白的功能β导致泛素化和蛋白酶体降解β连环蛋白。显示了一种蛋白激酶激活抑制这种GSK3的函数βGSK3通过磷酸化的β在丝氨酸939]。因此,一种蛋白激酶的激活增加的细胞水平β连环蛋白。因此,β连环蛋白在细胞质中积累并且把目标基因的成核导致刺激。在这里,我们表明,GSK3 Akt激活和灭活的水平β调节持续增加的吗β连环蛋白细胞治疗的CIP(数字4(一)和5 (d))。这些结果表明,CIP的具备干细胞维持效果是由于一种蛋白激酶的激活/β连环蛋白通路。

事实上,dpc需要具备干细胞的分子信号而不是多能性细胞因子和生长因子的生产功能的角化细胞招聘和扩散。在这方面,激活Wnt /β连环蛋白信号显示诱导毛囊形成和头发的生长通过干细胞信号驱动细胞因子合成(7,13,40,41]。对于本研究的焦点,包括upregulation具备干细胞的信号β连环蛋白,Nanog Oct4、蛞蝓和蜗牛描述了环丙沙星在推动机制运作的dpc增强头发(数字的增长4和5)。

最近的证据表明,β连环蛋白与许多信号通路参与多能性和EMT (25- - - - - -27,35,42]。此外,Wnt /β连环蛋白信号激活了EMT的表达增加蛋白质和多能激活转录因子(43- - - - - -47]。符合之前的报道,转录因子蜗牛和ZEB1 EMT过程中发挥重要作用[16,18),我们发现这种蛋白的显著增加dpc CIP(数据处理4 (b)和5 (e)),增加了EMT标记被发现的干细胞的形态和综合行为。我们的研究结果也提供了有力的支持观点,Akt GSK3 /β端依赖β连环蛋白upregulation dpc具备干细胞维持是很重要的。我们推出了下游的转录因子的Wnt /目标β连环蛋白,即在CIP-treated Nanog和Oct4调节细胞。

最后,我们系统性评价CIP的积极作用在培养dpc具备干细胞治疗的维护。我们还发现了一个新发现在dpc CIP的具备干细胞监管效果,也就是说,通过一种蛋白激酶/ GSK3β端依赖β连环蛋白信号导致的upregulation与EMT和自我更新(图相关的转录因子6)。这些信息可能会打开门进一步的调查,使这种药物的新应用程序文化细胞治疗方法是有用的。

缩写

dpc:	毛乳头细胞
GSK3β:	糖原合酶kinase3β
一种蛋白激酶:	ATP-dependent酪氨酸激酶
EMT:	Epithelial-mesenchymal过渡
FGF:	纤维母细胞生长因子
IGF:	胰岛素样生长因子
国际马铃薯中心:	环丙沙星
TCF:	t细胞因子
中位数:	淋巴增强因子。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究已经支持的Ratchadaphiseksomphot朱拉隆功大学的捐赠基金(铜- 57 - 003 - hr)和泰国研究基金通过行业研究和研究人员计划。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表或论文的准备。

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