文摘
背景。还不知道马接受同种异体间充质干细胞(msc)注射开发特定的体液免疫反应。我们的目标是开发和验证一个流仪MSC试验程序和确定马接受同种异体MSC在临床环境中开发可衡量的抗体后MSC。方法。血清收集从一个共有19马进入了3种不同的研究项目。马3的研究所有收到无与伦比的同种异体msc。骨髓(BM)或脂肪组织衍生msc (ad-MSCs)管理通过静脉,动脉内的,intratendon或眼内路线。Anti-MSCs和anti-bovine血清白蛋白抗体通过流式细胞术和ELISA检测,分别。结果。总的来说,anti-MSC抗体被发现在37%的马。大多数的马(89%)anti-bovine阳性血清白蛋白(BSA)抗体之前和之后MSC注入。最后,没有anti-BSA抗体的量之间的相关性和anti-MSC抗体的发展。结论。反allo-MSC抗体发展很常见;然而,这些抗体的意义是未知的。没有相关性的存在与否抗体和抗体绑定百分比MSC注入MSC和任何不良反应。
1。介绍
同种异体间充质干细胞(msc)正在研究在人类和马的研究。静脉注射(IV)注入同种异体msc似乎是安全的,并没有明显的不利影响已报告(1,2]。自体msc相比,同种异体msc的优点是提供一个彻底的细胞特征的产品,立即得到治疗急性损伤患者没有必要的延迟相关的文化和扩大自体msc (3]。此外,同种异体MSC使用标准是当前护理在大多数人类临床试验(3,4]。与输血或实体器官移植,组织输入需要防止血液/移植排斥,同种异体MSC使用没有任何组织类型或pretransfusion测试被认为是可能的因为MSC免疫逃避和他们的表达人类白细胞抗原(HLA)二类分子可以忽略不计3- - - - - -5]。
而同种异体msc以前被认为是免疫特权和不诱导同种免疫的反应6),现在认识到,低水平的细胞和体液alloimmunity可以识别在人类和马处理同种异体MSC (3,7,8]。然而,许多基本问题有关的msc(本文以5)之后,他们的命运intralesional和系统性输液仍悬而未决6,9]。虽然同种免疫的msc的识别可能伤害了msc、降低他们的生存时间,并阻碍临床结果,目前还没有数据来支持这一假设。
MSC给药途径、组织来源,最终配方,用量频率变量有可能影响发展anti-MSC同种抗体。皮内注射BM-MSCs诱导形成的特定anti-MSC抗体在6健康的马在一项研究[8]。msc,无论组织起源、体外固有的低免疫原性,并与人类和动物研究msc(狗和猪)建议使用同种异体,无与伦比的msc是可行的。然而,msc并不完全逃避免疫监视和已被证明诱导同种异体移植物反应免疫活性的恒河猴(10]。然而,所知甚少对马抗体开发的细胞来源,剂量,或政府在病马的频率。
本研究的目标是(1)开发和验证一个马特定流仪MSC试验程序和(2)来确定马接受同种异体MSC发达可衡量的抗体后同种异体管理来自不同组织来源的MSC通过不同路线的管理。我们假设马将制定可衡量的同种异体抗体MSC不管给药途径,政府的频率,或者MSC来源。
2。材料和方法
2.1。流仪试验测定
我们修改流仪MSC试验过程被开发用于确定移植患者与人类相关anti-MSC同种抗体([6埃德温·霍维茨博士)和免疫遗传学实验室,费城儿童医院的,个人通信)。低温贮藏msc解冻完全如前所述在37°C水浴(12,13]。解冻msc被转移到15毫升聚丙烯管(猎鹰,BD生物科学,富兰克林湖,NJ)与温暖的杜尔贝科的磷酸缓冲盐(DPBS Gibco,表达载体,卡尔斯巴德,CA)和离心机轻轻地(110,10分钟)。上层清液被和细胞在DPBS resuspended 30分钟休息在室温(RT)。细胞被洗(410,10分钟),然后孵化在屏蔽解决方案(2%正常山羊血清(杰克逊ImmunoResearch Inc .)、西树林,PA))在DPBS摇摆在RT 30分钟。细胞颗粒状(410,10分钟),上层清液,并与DPBS细胞被洗3次。马血清(MSC受体血清)热灭活和稀释1:1 12.5%正常马血清DPBS (HyClone,洛根,UT)。200年µL的稀释测试血清添加到每个管;样本是涡短暂和允许孵化RT 30分钟。孵化后,msc被洗3次(1000,5分钟)和流缓冲区(0.5%牛血清白蛋白和5毫米EDTA DPBS)。洗后,100µ二次抗体的L(马IgG-FITC兔多克隆抗体,稀释1:200年,Abcam,剑桥,MA)添加到细胞颗粒,混合,允许在黑暗中孵化在RT为20分钟。细胞被洗3次(10005分钟),resuspended流缓冲区,和分析流式细胞分析仪(Cytomics FC 500年,贝克曼库尔特,沥青,CA)。流式细胞仪数据分析使用FlowJo流式细胞仪软件(树明星Inc .,亚什兰,美国)。
样品包括积极的红细胞(RBC)控制,3 -控制,测试条件。积极控制开发确认兔多克隆anti-equine IgG-FITC适当抗体检测到细胞与抗体绑定。积极的控制我们从Aa +马血清与红细胞表面混合从Aa−马确认anti-Aa同种抗体。虽然马红细胞抗原同种抗体凝集和溶血性anti-Aa主要凝集抗体(14]。总之,血液收集从一个Aa +马通过颈静脉穿刺真空采血管管含有酸柠檬酸葡萄糖(BD生物科学),离心机,享年1000岁×1分钟,等离子体和淡黄色的外套被移除。红血球与DPBS稀释和1×106红血球混合血清从一个Aa−马(稀释1:3 12.5%正常马血清DPBS)和孵化RT 20分钟。红细胞表面清洗2 x流缓冲区(1000马1分钟)后,抗体免疫球蛋白(IgG-FITC稀释1:200年,Abcam)是补充道。细胞被漩涡,然后孵化20分钟在RT在黑暗中。细胞被洗如上使用流式细胞分析仪和样本阅读。红细胞表面负控制样本包括(1)从一个Aa Aa−−马混合血清的马,(2)msc只有二级抗体(没有初级抗体(血清)控制),和(3)收件人马血清混合着“无关紧要”msc (msc从不同的捐赠者收件人没有暴露)。这本质上作为背景绑定控制排除非特异性结合血清msc。一个阈值(即。,negative) cut-off was determined based on the binding of serum to irrelevant MSC. Anti-MSC antibodies were considered positive if the serum bound more than 3% of the tested MSCs over the upper range of the background binding to accommodate for the variation in serum binding to MSCs at baseline (prior to MSC administration).
2.2。Anti-BSA抗体检测
ELISA是改编自格什温et al。15)检测抗体针对的主要牛在胎牛血清蛋白(的边后卫)与牛血清白蛋白(BSA)。短暂,96 - ELISA板(Nunc-Immuno MaxiSorp,热费希尔科学、罗切斯特NY) 100年被涂上一层µL BSA (1µg,分数V, Fisher) carbonate-bicarbonate缓冲区(63.5毫米碳酸盐,pH值9.5)一夜之间在4°C。100块,µL 1%的兔血清白蛋白(σ,圣路易斯,密苏里州)在DPBS被添加到每个在37°C,孵化1小时。井与DPBS洗+ 0.1%渐变20(洗缓冲区,EMD化工、圣地亚哥、CA)一次10分钟左右,然后6倍。100年µ测试血清L(1/1000稀释清洗缓冲)添加到每个。镀每个样本一式三份。已知的正面和负面的样本作为试验运行控制。盘子在孵化37°C以上1小时和清洗,然后100年µL的兔子anti-equine免疫球蛋白H&L-HRP(稀释1:200000年,Abcam)添加到每个。盘子被孵化的37°C 1小时洗如上所述,100年µL三甲过氧化物酶的底物(KPL,马里兰州)被添加到每个好,和盘子在RT在黑暗中孵化。与100年比色反应停止µL 2 N H2所以4和盘子被读450 - 540与Gen5软件协同HT多模标(BioTek Winooski, VT)。褶皱增加颜色相对于负控制确定为每个样本。
2.3。MSC捐赠者马和MSC文化
从健康脂肪和BM收集马住在马健康中心(CEH)加州大学戴维斯(UCD),正如之前(1,16]。这些马是常规接种疫苗,除虫,筛选病毒病原体。msc分离、培养和特征完全如前所述[11,16]。短暂,骨髓单核细胞和脂肪组织间质血管分数在杜尔贝科的修改鹰培养基培养(Gibco)补充10%的边后卫(亚特兰大生物制剂,华丽的分支,GA)和1% Penicillin-Streptomycin (Gibco)。在~ 70%融合细胞通道。msc被基质细胞形态学特点,塑料的依从性,表面蛋白表达(MHC i, CD90、CD44和CD29积极和MHC II, CD86,和F6B(马pan-leukocyte标记)消极的)(17]。
2.4。研究马
血清收集从一个共有19马参加3个不同研究项目(收件人马)[1,18]。所有的马都健康,成年马住在UCD的另一。3研究根据批准的机构进行动物保健和使用委员会协议(UCD)。从所有马血清收集2次:MSC注入和前2周后最后MSC注入。血清是整除,冻结在−80°C到分析。
所有的马3的研究收到了完全无与伦比的同种异体msc(见表1)[1,18]。在第一项研究中。,tendon study), horses received 4 injections of 25–80 million BM-MSCs per injection (total dose: ~100–320 million BM-MSCs/horse) [18]。msc通过静脉注射区域肢体灌注,经动脉内的地区肢体灌注,并通过直接注入实验诱导肌腱损伤(19]。在这项研究中,细胞从两个不同的捐赠者马。对于任何给定的接受者,重复注射都是来自同一个捐赠者的马。在第二项研究中。,eye study), horses received 2 intravitreal injections of fat-derived MSCs (Ad-MSCs, Borjesson, unpublished data). The first injection contained 25 million MSCs and the second injection contained 50 million MSCs (total dose was 75 million MSCs/horse). For this study, cells from 2 different donor horses were used. For any given recipient, repeated injections were all from the same donor horse. In the third study (a.k.a., IV study), horses received 3 intravenous injections of 25 million Ad-MSCs or BM-MSCs per injection (total dose was 75 million MSCs/horse) [1]。在这项研究中,细胞从5个不同的捐赠者马。对于任何给定的接受者,重复注射都是来自同一个捐赠者的马。
2.5。统计分析
一个学生的以及用于比较背景BM-MSCs和Ad-MSCs血清绑定。
3所示。结果
3.1。MSC试验试验发展
初级抗体的检测是使用串行开发稀释(收件人马血清)滴定连续稀释的二次抗体(兔子anti-equine IgG-FITC)。多个阻塞试剂和阻塞时间进行评估,以减少背景血清结合msc(2%正常山羊血清提供最完整的非特异性血清结合细胞)。商用兔子anti-equine的敏感性和特异性免疫球蛋白抗体经孵化马血清有或没有天然同种抗体与Aa + Aa +红血球,Aa−红血球,分别是积极的和消极的控制,分别(图1)。为了确定马血清非特异性结合,马MSC(从未经处理的动物),42血清样本,收集从马之前,任何接触MSC、被用来确定背景绑定的血清BM-MSCs ()和Ad-MSCs ()(表2)。背景血清绑定BM-MSCs明显高于背景血清绑定Ad-MSCs ()。作为研究样本,这样,最后积极绑定百分比报告为血清抗体的总绑定管理msc -后台绑定到“无关紧要”msc,没有管理的马血清检测。血清样本被认为是“积极的”anti-MSC血清抗体如果绑定到> 3%的测试msc /背景绑定(见细节材料和方法)。
3.2。试验结果研究马
19马配对血清样本预处理和post-MSC管理(肌腱的研究;眼睛的研究;第四,研究;见表1)。这些结果总结表3。百分之四十(2/5)的马眼研究开发了一种轻微的绑定(< 5%)和特定的抗体反应Ad-MSCs收到(数字2(一)-2(c))。百分之十(1/10)的马第四研究开发了一种温和的和特定的抗体反应BM-MSCs收到。所有4匹马在肌腱的研究开发和特定的绑定(> 15%)抗体绑定到BM-MSCs他们收到pre-MSC政府相比血清样本中没有观察到(表绑定2;数据2(d) -2(f))。总体而言,抗体检测在7/19马(马)37%的研究,其中5收到BM-MSCs和2收到Ad-MSCs。
虽然同种抗体持续时间的特定的决心和毅力没有任何3研究目标,同种抗体的检测在许多马匹后,我们回到了研究人口收集额外的血清样本,是可用的。例如,第四只马参加研究开发可测抗体,可用多个血清样本的研究。对于这个动物,抗体没有出席MSC注射,但发达国家和达到峰值后28天MSC注射后35天(在此期间马收到3 MSC注射)。然而,抗体不再检测到MSC注射后84天。4额外的马的样本(2眼研究2,肌腱研究),抗体由MSC注射后25天(在此期间2 MSC注射收到)。百分比增加绑定在一个马(肌腱研究中,注射后第420天)和减少剩余的3匹马(42天,585天,一天600 MSC注射后)。这些数据表明,MSC MSC可以开发3 - 4周后注射抗体和抗体主要是随着时间推移而下降;然而,他们可能会持续。
3.3。在研究马Anti-BSA抗体
十八岁的19研究马前后血清样本可供anti-BSA ELISA测定。16这些18研究马安置CEH高既存anti-BSA抗体滴度从4到16倍高于负控制样本(马没有可检测anti-BSA抗体)15]。两匹马在本质上是为阴性anti-BSA抗体(定义为褶皱增加< 2相比-控制样本)。18马没有显示任何变化在anti-BSA抗体采样MSC治疗或前2周后最后注入(图3)。也没有相关性anti-BSA浓度高和可检测anti-MSC滴度(所有7匹马发达可衡量的anti-MSC抗体可衡量的anti-BSA浓度;范围:7.3 -15倍而不随时间变化)。
4所示。讨论
在大多数急性临床疾病或综合征,同种异体msc将使用细胞治疗及时治疗的唯一选择。鉴于msc的低免疫原性和免疫逃避被认为是(3,9,20.),“万能供血者”的可能性msc为临床使用值得探索。我们建议使用干细胞试验技术,几乎以相同的方式,试验过程是用于红细胞输血,将提供重要信息的pretransfusion兼容性MSC治疗。为此,在这项研究中,我们开发了一个基于流仪MSC试验程序和用它来确定马的病人,暴露在同种异体MSC后,可能产生anti-MSC同种抗体。这些发现符合最近的手稿,报道anti-allogeneic MSC的形成抗体后皮内注射同种异体MSC在6健康的马(8]。在我们的工作中,抗体发展相当普遍;然而,这些抗体的意义是未知的。之间没有相关抗体的存在与否或百分比抗体绑定MSC注入MSC和任何不良反应。描述了类似的发现在老鼠21)和多个后狒狒,高剂量(5×106msc /公斤体重)同种异体msc管理局(22]。
抗体发展到最大程度(包括最多的马和最高的抗体绑定)的马参与肌腱研究。有许多潜在的强大的抗体反应的原因在这些马。这些马获得最高的msc、总数最多的注射,大部分航线的变化管理。这些马也有实验诱导病变(马在其他两个研究是健康的没有已知的病变)。特异性靶抗原决定基,或大的同种抗体是未知的。
与先前的研究一致,可能假设这些同种抗体可能是针对血型抗原呈现msc(表面8]。虽然Sundin和他的同事们(6)表明,人类msc不表达血型抗原,最近Pezzanite et al。8]表明,消极的马马白细胞antigen-A2 (ELA-A2)收到ELA-A2 msc积极捐助者发达ELA-A2特定的同种抗体,表明msc表达ELA-A2。具体的MSC最免疫原性抗原尚未确定。
额外考虑同种抗体的发展将这些开发的同种抗体反应接触的边后卫(6]。msc在培养基培养经常补充的边后卫,据报道,msc内化和的边后卫组件呈现在细胞表面。敏化异种的血清蛋白质用于准备疫苗或其他细胞产品据报道在几个种类15,23- - - - - -25]。年度或半年度马与多个疫苗的接种疫苗(FBS-containing媒体中创建)是常见的马产业,因此马通常发展强大的BSA抗体(的边后卫的主要组件)。测量anti-BSA抗体也经常以人体临床试验(26]。在一项研究中,开发anti-BSA抗体相关治疗失败(26]。msc管理我们client-owned患者通常在10%的边后卫,从而培养我们想要区分一个抗体反应,可能是针对msc和抗体反应指向主xenoantigen细胞培养。大鼠msc生长在FBS-supplemented介质引起的体液反应复发后政府在免疫活性的动物27]。我们发现,尽管大多数的所有研究马BSA先前存在的浓度高,主要组成部分的边后卫,多个MSC注射不会引起任何可测量的或显著改变抗体效价。因此,anti-MSC抗体测定在这项研究中没有专门对牛xenoproteins执导。
有几个限制这一回顾性研究。首先,本研究回顾性研究使用样本来自健康的马参加3不同的体内研究中马接受同种异体MSC不同组织来源通过不同的路线和浓度。虽然这使得数据更加难以直接比较,它确实给强大的抽样的潜在反应在许多小型研究马。第二,我们没有试图确定的同种抗体免疫球蛋白类(即。,IgM, versus IgG, etc.) or the target epitope(s) of the identified alloantibodies nor did we determine if the alloantibodies were cytotoxic. Third, each of the three research groups contained a small sample size. And finally, we did not determine whether antibodies developed to autologous MSCs.
总之,有越来越多的证据表明,同种异体msc在接收者可能引起免疫反应,和我们的结果添加到越来越多的证据表明,同种异体捐赠者msc还没有完全免疫的特权在免疫活性的接受者。这样的结果可能有助于减少同种异体msc的治疗潜力;然而,对免疫反应的确切性质理解在发展战略对同种异体的msc可以帮助优化治疗使用同种异体msc和减少消极的免疫效果或降低可能的风险被拒绝。未来的工作评估的潜在使用该试验过程在临床和研究患者同时接受同种异体和自体msc可能有利于更全面地理解临床同种抗体生产的重要性。
缩写
| 广告: | 脂肪 |
| BM: | 骨髓 |
| BSA: | 牛血清白蛋白 |
| 另: | 马的健康中心 |
| DPBS: | 杜尔贝科的磷酸缓冲盐 |
| 资格认证: | 马白细胞抗原 |
| 的边后卫: | 胎牛血清 |
| HLA: | 人类白细胞抗原 |
| 四: | 静脉注射 |
| 硕士: | 间充质干细胞 |
| 加拿大皇家银行: | 红细胞 |
| RT: | 室温 |
| 加州大学: | 加州大学。 |
信息披露
这项工作的结果提出了在某种程度上作为一个平台在第三届北美兽医再生医学(NAVRMA)会议,2012年11月8日至10日,乔治亚州萨凡纳。
相互竞争的利益
作者没有利益冲突披露。
作者的贡献
肖恩·d·欧文斯构思研究和参与研究设计,MSC试验开发和论文写作。阿米尔Kol进行统计分析和论文写作。娜奥米·j·沃克进行流式细胞术研究,ELISA和细胞培养。多丽l . Borjesson构思研究和参与研究设计,MSC试验开发和论文写作。所有的作者都阅读和批准论文的最终稿。
确认
这个项目得到了马健康中心(加州大学戴维斯分校),从迪克和卡洛琳Randall慷慨的礼物。Amir Kol支持的奖学金奖励大学科学家(弧)基金会和干细胞从加州再生医学研究所的培训。