核受体超家族的一员,被指定为NR2F2,支持自我更新能力和人类骨骨髓来源间充质干细胞的多能性

文摘

间充质干细胞是具有自我更新能力和多潜能。NR2F2检测到核受体在间充质间的器官。然而,是否具备干细胞NR2F2扮演一个角色在维护间充质干细胞尚未探索。在这项研究中,我们调查了函数的NR2F2骨骨髓来源间充质干细胞通过shRNA-mediated NR2F2混战。NR2F2受损的抑制间充质干细胞的克隆形成的功效。克隆形成能力的抑制作用可能是由于加速衰老通过upregulation P21和P16。NR2F2也差别,对这些基因的抑制成骨的和脂肪形成的分化过程。总之,NR2F2扮演着一个重要的角色在具备干细胞维持骨骨髓来源间充质干细胞。

1。介绍

间充质干细胞(msc),可与各种组织如骨髓、脂肪组织(1),和脐带血2]是一种干细胞拥有自我更新和multipotential分化的能力。msc的已报告形式克隆形成能力unit-fibroblasts (CFU-F)和分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成肌细胞(3]。此外,msc具有免疫调节作用[4),在组织修复发挥有效的作用。因此,msc在细胞治疗各种疾病的前景,特别是在再生医学领域的。连续剧的临床试验揭示了鼓舞人心的结果,msc输液可以改善心脏(5和肝脏功能6)和福利的结果移植物抗宿主病(GVHD)患者(7,8]。msc的生物特性是临床研究的基础。因此重视探讨msc的生物学特性,特别是具备干细胞的监管机制。

NR2F2(核受体亚科2 F组的成员,或鸡卵白蛋白上游promoter-transcription因子II),核受体超家族的一员,这是广泛表达于间充质间的器官(9),已经证明对MSC分化的规定的影响(10和老鼠胚胎发生11]。通过降低体内体外实验和淘汰赛实验,谢等人证明NR2F2可能诱发脂肪形成的分化和抑制成骨细胞的分化通过激活PPAR mscγSox9表达式以及抑制Wnt信号通路和Runx210]。

据我们所知,NR2F2是否参加msc尚未探索的自我更新。因此,本研究进行调查的角色NR2F2具备干细胞BM-MSCs维护和支持的。

2。材料和方法

2.1。代BM-MSCs

正常的人类骨髓样本收集捐赠的一代的间充质干细胞。骨髓单核细胞是由密度梯度离心法分离和培养低杜尔贝科修改鹰的介质(10 - 014表格,DMEM康宁)补充10%胎牛血清(的边后卫,10099 - 141,Gibco) 37°C和5%的公司₂在湿润孵化器。中被取代后48小时内,每3天之后发生了变化。贴壁细胞时通过融合了90%。通道2 - 6的BM-MSCs用于以下分析。

2.2。BM-MSCs的特点

BM-MSCs的文章3 - 5或转染BM-MSCs收获和孵化anti-CD90-FITC (11 - 0909), anti-CD90-PE (12 - 0909), anti-CD105-PE (12 - 1057), anti-CD73-APC (17 - 0739), anti-CD45-FITC (11 - 9459), anti-CD45-PE (12 - 9459), anti-CD34-PE (12 - 0349), anti-CD19-APC(17 - 0199),和anti-CD11b-PE (12 - 0113, eBioscience)抗体在4°C 30分钟。结果发现通过使用FC 500制程流式细胞分析仪(贝克曼库尔特)。适当isotype-matched抗体(eBioscience)应用控制。

2.3。shRNA-Mediated混战的NR2F2

为了获得BM-MSCs NR2F2表达降低,指定的成分,这是以前报道(11)(5′-AGGTAACGTGATTGATTCAGTATCTTA-3′),克隆到pGLV3质粒(GenePharma)。炒序列(5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′)也是克隆成pGLV3消极的控制。慢病毒上清液是由与pMD2 cotransfecting 293 t细胞。G质粒,psPAX2质粒,并与磷酸钙转染shRNA-plasmid工具包(BW11002 Biowit技术)根据制造商的指示。病毒悬液收集、过滤和添加到BM-MSCs后直接删除的媒介。细胞培养病毒悬架和病毒10小时后换成新鲜培养基。GFP表达被使用一个倒生的荧光显微镜评估。的积极表达GFP是用来评价转染效率。

2.4。克隆形成Unit-Fibroblast化验

转染BM-MSCs(包括可拆卸的组和阴性对照组)被消化使用0.25%收获trypsin-EDTA解决方案(25200 - 056,Gibco)。细胞被播种在6-well板块(CLS3516康宁)每厘米50细胞密度²一式三份和孵化DMEM 10%的边后卫。14天后,细胞被固定在甲醇和2%结晶紫染色后10分钟去除介质与PBS和洗涤。超过50个细胞组成的殖民地和PBS删除多余的染色后计算。

2.5。5-Dimethyl-2-thiazolyl MTT (3 - (4) 2, 5-diphenyltetrazolium溴)测定

转染BM-MSCs被播种在96孔板上的浓度为2×10³每口井。三个平行井每组细胞的申请。孵化后2天、4天或6天,10μL MTT (LK-MTT001 Liankebio)补充道。中4小时后被丢弃。OD值被标评估(SpectraMax M5,分子设备)增加100后570海里μL DMSO溶液。

2.6。成骨、脂肪形成的分化

段落的转染BM-MSCs 3 - 5在成骨分化培养基培养(Cyagen huxma - 90021) 21天,与媒介改变了每3天。的形成钙结节茜素红染色(Cyagen huxma - 90021)是用来评估成骨分化。脂肪形成的诱导分化,转染BM-MSCs在章节3 - 5是在脂肪形成的分化培养基培养(Cyagen huxma - 90031)第一个3天。在脂肪形成的分化培养基培养后,细胞B (Cyagen huxma - 90031)。24小时后,与脂肪形成的分化培养基中B代替a在脂肪形成的分化培养基培养细胞终于B与媒介改变了每一个额外的7天3天之后三个周期的维护。细胞被沾油红O解决方案(Cyagen huxma - 90031)评价脂肪形成的分化。

2.7。衰老的分析

转染BM-MSCs被播种在6-well盘子。融合媒介被当细胞达到50%。细胞被冲洗与PBS和固定1 x固定剂衰老提供的解决方案β牛乳糖染色装备(9860细胞信号技术)15分钟。新鲜的β牛乳糖染色溶液制备根据制造商的指示。每个细胞都沾染了1毫升染色溶液清洗后用PBS的2倍。染色的过程是完成在37°C在干燥孵化器孵化后16小时。的β牛乳糖阳性细胞被认为是衰老细胞和统计至少4随机选择的字段。

2.8。细胞凋亡检测

转染BM-MSCs收获和洗冷PBS 2次。细胞被resuspended在100年μL 1 x绑定缓冲中提供细胞凋亡检测设备(559763年,BD Pharmingen)。细胞培养与膜联蛋白V-PE抗体和7-AAD(559763年,BD Pharmingen)在室温下15分钟。结果发现通过使用FC 500制程流式细胞分析仪(贝克曼库尔特)。细胞Annexin-V-positive和7-AAD-negative被认为是早期的凋亡。细胞凋亡后期被认为是当Annexin-V和7-AAD都是积极的。

2.9。定量逆转录聚合酶链反应(存在)

进行反转录与PrimeScript RT试剂盒gDNA橡皮擦工具(RR047A、豆类)细胞总RNA转染后BM-MSCs用试剂盒提取试剂(15596 - 026年,生命技术)。定量PCR是由使用SYBR预混料交货Taq II (RR420A、豆类)根据制造商的指示LightCycler系统(罗氏诊断)。样品都准备一式三份。3 -磷酸甘油醛脱氢酶的表达(GAPDH)检测规范化。使用的引物如下:NANOG提出5′-TGCCTCACACGGAGACTGT-3′,反向5′-CTTTGGGACTGGTGGAAGAAT-3′;OCT4提出5′-GTATTCAGCCAAACGACCATCT-3′,反向5′-GCTTCCTCCACCCACTTCT-3′;SOX2提出5′-GGAGAGAGAAAGAAAGGGAGAGA-3′,反向5′-GCCGCCGATGATTGTTATTAT-3′;碱性磷酸酶(ALPL)转发5′-TGCTCTGCGCAGGATTGGAACA-3′,反向5′-AGGCAGGTGCCAATGGCCAGTA;绑定唾液蛋白(BSP)转发5′-GGAGGAGGAAGAAGAGGAGACT-3′,反向5′-CCCAGTGTTGTAGCAGAAAGTG-3′;runt-related转录因子2 (RUNX2)转发5′-GCAGTTCCCAAGCATTTCAT-3′,反向5′-CTGGCGGGGTGTAAGTAAAG-3′;脂蛋白脂肪酶(LPL)转发5′-TTACCCAGTGTCCGCGGGCT-3′,反向5′-AGACGACTCGGGGCTTCTGCA-3′;过氧物酶体proliferator-activated受体-γ(PPAR -γ)转发5′-ATCAAGAAGACGGAGACAGACA-3′,反向5′-AACTGGAAGAAGGGAAATGTTG-3′;P21提出5′-AGGGGACAGCAGAGGAAGAC-3′,反向5′-GGCGTTTGGAGTGGTAGAAA-3′;P16提出5′-GTGCCACATTCGCTAAGTGCT-3′,反向5′-GACCCTGTCCCTCAAATCCTCT-3′;GAPDH提出5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′,反向5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。

2.10。免疫印迹分析

的转染BM-MSCs trypsin-EDTA收获通过消化使用0.25%的解决方案。细胞细胞溶解在冰1小时里帕裂解缓冲(AR0105博士德)PMSF解决方案(AR1179博士德)在洗一次冷PBS。细胞溶解产物在12000×g离心5分钟在4°C。浮在表面的孵化在100°C 10分钟后加载缓冲区添加适量。准备蛋白提取物被加载到一个10%,含SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,并转移到硝酸纤维素。膜被5%的脱脂牛奶在室温1小时,孵化与主要抗体一夜之间,然后用荧光二次孵化抗体(926 - 65010和926 - 65020年,LI-COR)在室温1小时。的特定抗体NR2F2(6434)和Caspase-3(9665)从细胞信号技术。P21的特殊抗体(ab109520)从Abcam和抗体GAPDH Multibioscience (Mab5079)。免疫反应性的乐队是可视化使用奥德赛红外成像系统(LI-COR)。GAPDH蛋白质被用来确保等效荷载样本。

2.11。统计分析

使用SPSS 19.0统计分析和差异意味着使用2-tailed学生的价值进行评估以及。一个值< 0.05 ()被定义为统计学意义。

3所示。结果

3.1。表征BM-MSCs

BM-MSCs送给一个轴的形状呈形态(图1(一))。如图1 (b),BM-MSCs阳性CD90 CD105,大多为CD73阳性,但不利于造血像CD34、CD45标记。此外,为CD19细胞呈阴性,B-lineage起源和CD11b的标志,表示对骨髓细胞和自然杀伤细胞。我们使用一个指定的shRNA收购BM-MSCs NR2F2表达降低。最低的组显著降低,炒对照组明显底片以后。转染细胞表达GFP蛋白如图2 (b)和2 (d)。如图2 (e),两组阳性转染BM-MSCs CD90、CD105,和CD45 CD73但负面,CD34, CD19。的下降表现NR2F2证实了免疫印迹分析(图2 (f))。

3.2。的混战NR2F2抑制BM-MSCs的克隆形成能力

的更新效率BM-MSCs被克隆形成的集落形成率评估unit-fibroblast (CFU-F)测定。CFU-F BM-MSCs的数量最低的组显著小于负控制(与,,数据3(一个)和3 (b))。我们也评估多能性基因的表达等NANOG,OCT4,SOX2用msc和维持多能性和自我更新是不可或缺的。不符合CFU-F化验的结果,相对mRNA的表达NANOG,OCT4,SOX2增加最低的组比消极的控制,尤其是对OCT4和SOX2取得了显著差异。此外,我们利用MTT试验来评估BM-MSCs扩散在2天,4天,6天(图3 (c))。虽然没有明显差异,最低的组的OD值相对较低。这些结果显示,减少表达NR2F2抑制集落形成能力但没有减少多能性基因的表达(图3 (d))。

3.3。NR2F2镇压的混战BM-MSCs的成骨和脂肪形成的分化

评估是否可拆卸的BM-MSCs NR2F2已经对骨的影响时,两组的转染BM-MSCs与成骨诱导培养中等21天。茜素红染色表明,msc在最低的组表现出更少的钙沉积比消极的控制。信使rna表达水平BSP和RUNX2显著降低最低的组相比,控制在7天14(图4(一))的mRNA表达水平ALPL减少14天(图4(c))。

至于BM-MSCs脂肪形成的分化,两组在脂肪形成的诱导培养基培养细胞根据制造商的指示。msc在最低的组显示减少油红O +染色与对照组相比。的信使rna表达水平LPL显著降低最低的组与对照组相比在7天14(图4(b))。然而,信使rna表达水平PPAR -γ没有减少在7天或14天。通过这些实验,我们证实,混战NR2F2抑制成骨的和脂肪形成的分化BM-MSCs(图4(c))。

3.4。NR2F2加速衰老的混战BM-MSCs但没有BM-MSCs对细胞凋亡的影响

随后,我们评价转染BM-MSCs的衰老。senescence-associated的染色β牛乳糖(SA -β加)透露,最低的组显示衰老细胞的比例更高。我们还发现,mRNA的表达P21和P16(增加数据5(一个)和5 (b)),这与SA -是相一致的β加染色结果。P21的表达升高也证实了免疫印迹分析(图5 (c))。我们也评估了转染的细胞凋亡BM-MSCs(图5 (d))。流式细胞仪检测结果显示无显著差异降低组和阴性对照组。Caspase-3的免疫印迹分析显示两组相似的结果(数据6(一)和6 (b))。

4所示。讨论

在这项研究中,我们探索的角色NR2F2的生物学特性的规定通过shRNA-mediated BM-MSCs NR2F2混战。我们的研究结果显示,压制NR2F2通过可拆卸的BM-MSCs CFU-F效率下降。代CFU-F文化反映了自我更新的能力,这被称为干细胞的增殖没有谱系分化(12]。因此,我们的研究结果表明,抑制NR2F2 BM-MSCs自我更新能力的影响。然而,多能性基因的表达表现出不一致的结果。NANOG,SOX2,OCT4提出了作为转录因子调节维持多能性状态的胚胎干细胞和成体干细胞13,14]。NANOG后经研究提出了截然不同的结果,但不是OCT4或SOX2,调节人类msc(多能性15]。在我们的结果,NR2F2镇压后,mRNA的表达NANOG,OCT4,SOX2所有的增加,虽然增加了NANOG没有意义。据报道,压制OCT4 upregulation NR2F2发挥了作用,这在一定程度上与我们的结果一致(16]。我们的数据表明,NR2F2对自我更新能力的影响并不受这些多能性基因。此外,CFU-F化验的结果反映的抑制NR2F2抑制的长期扩散BM-MSCs在14天。因此,我们评估的短期扩散BM-MSCs两组在2天,4天,6天。表示天的潜伏期后,虽然没有明显差异,降低集团的OD值都低于阴性对照组。这些结果表明,抑制NR2F2可能诱导减少短期BM-MSCs扩散的趋势。

因此,我们研究了影响BM-MSCs NR2F2抑制衰老和细胞凋亡。衰老的分析显示,混战的NR2F2导致更高比例的SA -β加积极的细胞。细胞凋亡分析显示两组之间没有显著差异。这些结果表明,减少CFU-F部分归因于的加速衰老。随后,我们评估的表达P21和P16通过抑制,提出了启动衰老CDK4/6 [17]。我们的数据显示,均升高。增加P21 NR2F2抑制符合以前的报告后,提出超表达的NR2F2 P21表达下调和SMAD4(通过直接联系18]。由NR2F2 P21的规定是否和SMAD4归因于直接联系在我们的案例中需要进一步的研究。综上所述,自我更新能力和扩散影响NR2F2抑制可能归因于衰老的加速度通过upregulation P21和P16。

我们也评估的影响NR2F2 BM-MSCs抑制脂肪形成和骨生成。分化过程都明显抑制后根据染色结果相应的感应文化。先前的报道显示,失去NR2F2诱导受损脂肪形成的程序和强化骨(10]。虽然从脂肪细胞,成骨细胞细胞命运决定的切换通过抑制transactivation已经证明(γ- ppar的函数19),另一份报告显示冲突的结果(20.]。的表达PPAR -γ在我们的案例中并没有减少;然而,减少LPL和减少油红O +染色仍然抑制脂肪形成。因为我们使用相同的序列的shRNA之前报道(10,11),报告不一致的结果可能归因于不同种类的msc。之前的结论(10,21)是通过老鼠实验,mice-derived msc、或老鼠细胞系。我们的数据是基于人类骨骨髓来源msc。另一方面,我们的研究结果显示,BM-MSCs增殖的抑制作用,这也会影响成骨分化。未来的研究需要的详细机制不同的结果。

5。结论

总之,我们的结果表明,压制的NR2F2 shRNA-mediated压倒一切的自我更新能力受损和骨骨髓来源间充质干细胞的多能性。克隆形成能力的抑制作用可能是由于加速衰老通过upregulation P21和P16。因此,NR2F2 BM-MSCs具备干细胞维护的扮演着重要的角色。

缩写

msc:	间充质干细胞
BM-MSCs:	骨骨髓来源间充质干细胞
CFU-F:	克隆形成unit-fibroblasts
NR2F2:	核受体亚科2 F组,成员2
移植物抗宿主病:	移植物抗宿主病
SA -加:	Senescence-associated牛乳糖
GAPDH:	3 -磷酸甘油醛脱氢酶
ALPL:	碱性磷酸酶
BSP:	绑定唾液蛋白
RUNX2:	Runt-related转录因子2
LPL:	脂蛋白脂肪酶
PPAR -:	过氧物酶体proliferator-activated受体-。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作得到了中国国家自然科学基金重点项目(81230014)和浙江省重大科技项目(2012 c13021-1)。

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