Label-Free脐带组织形态和Explant-Derived细胞成像

文摘

原位检测msc仍是困难的,需要额外的援助与表征的方法在活的有机体内。双光子共聚焦激光扫描显微镜(TPM)和二次谐波发生(宋惠乔)可以填补这个空白。这两种技术使细胞和细胞外结构的检测,基于内在属性的具体组织和细胞内分子光辐照下。TPM成像和宋惠乔成像用于label-free监测干细胞分化,评估他们的行为可以使支架的生物相容性,甚至细胞跟踪在活的有机体内。在这项研究中,我们表明,TPM和宋惠乔可以精确的描述了脐带架构和可视化的单个细胞原位在文化启蒙,不使用体内应用标签。结合核DNA染色,我们观察到荧光强度方差在血管壁。此外,抗体染色显示,Oct4差异,αSMA、波形蛋白和ALDH1A1表达式原位,显示脐带细胞群之间的功能差异。在未来的研究中,需要成像可以增值的当前antigen-based染色方法来描述组织结构和识别的祖细胞的组织来源。

1。介绍

干细胞起源于围产期组织如脐带(加州大学)正在集中研究了在再生医学中的应用。由于其内在增长促进通过自我更新能力介导,multilineage分化,和营养因子的生产,以及他们的免疫调节功能(1,2),这些干细胞围产期提出有效的替代成年干细胞自体和同种异体来源的应用程序。因此,UC-derived基质细胞正在评估作为多个退化性疾病和细胞治疗作为疾病的免疫调节方法涉及异常的免疫反应,如多发性硬化、帕金森病、移植物抗宿主病、1型糖尿病、中风(3- - - - - -6]。

加州大学是一个丰富的干细胞,因为各种各样的祖细胞可以从不同的隔间的组织,例如,脐带血,血管周的空间,组织矩阵(7,8]。加州大学的多功能细胞矩阵的推导或沃顿的果冻(WJ)第一次描述了大约十年前米切尔等人,罗曼诺夫et al .,报告与mesenchymal-like基质细胞表型的隔离(WJ-MSCs) [9,10]。发现后,他们的临床潜力以及上级文化属性/成人(从)间充质干细胞(msc)已经进行了广泛的描述(11- - - - - -16]。与这种广泛的文化表征,WJ-MSCs的生物学原位从组织及其过渡到文化仍然知之甚少。

目前,mesenchymal-like细胞的识别来自特定组织的依赖在体外分析通常涉及的分离组织和细胞的分离和培养。经典,msc是由能力坚持塑料、比表面标记抗原的表达,和多功能分化潜力(17]。评估细胞分化和功能在特定的时间点或在一个特定组织,技术,如西方的屁股,定量聚合酶链反应和免疫组织化学是最常见的利用。尽管这些方法是高度敏感的和具体的,破坏性的自然不允许动态或实时评估细胞内完整的组织(18]。因此,原位msc残骸鉴定困难和需要额外的成像方法。

非线性光学显微镜技术,如多光子显微镜和更高的谐波发生,是新兴的工具活体的非侵入性成像的细胞和组织19- - - - - -21]。这些技术允许不需要可视化和特征的细胞和组织结构不固定或染色过程(19,22]。因此,双光子激发可以引起光子发射的内在细胞内的荧光团,比如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和黄素,这种现象称为自发荧光(AF) [23,24]。此外,不对称的分子如胶原蛋白I型和弹性蛋白能产生光在两次的频率(或波长的一半)脉冲激发光束,一项功能,被称为二次谐波发生(宋惠乔)[21,25]。宋惠乔不遭受光漂白,并允许长时间的观察(26]。此外,双光子激光激发光束会穿透更深的组织允许细胞的成像和跟踪相对厚1毫米的样品(20.,27,28]。通过监测AF和宋惠乔,干细胞分化,细胞行为在3 d生物支架(如胶原蛋白矩阵),和在活的有机体内跟踪的细胞(没有或转基因)和再生过程可视化(28- - - - - -37]。

本研究的目的是评估的潜力label-free成像在脐带组织和细胞的可视化监控基质细胞在外植体隔离和文化。我们的数据表明,双光子荧光显微镜(TPM)和宋惠乔成像可用于检测细胞原位没有体内应用标记分子。我们可以想象加州大学体系结构以及外植体附件和主细胞产物。在平行,chondrogenic颗粒成像验证程序,显示胶原蛋白丰富的存款和WJ-MSCs cleft-like结构分化后的细胞。此外,房颤和宋惠乔成像与核DNA染色法结合使用,揭示微分在核荧光强度脐带血管壁。因此,我们表明,TPM是一个优雅的工具”来形容加州大学干细胞原位,与潜在的并行使用与传统成像和染色技术。

2。材料和方法

2.1。脐带组织处理

人类加州大学组织的收集和实验使用特大学医学伦理委员会批准,Ziekenhuis Oost-Limburg。加州大学组织()获得无菌从怀孕足月简单计划剖腹产,在知情同意。声带都已干涸的血液和随后存储在无菌磷酸盐(PBS;Lonza Verviers、比利时)补充1% penicillin-streptomycin (P / S;10000:10000 U;Gibco®,生活技术,绅士,比利时)和0.2%二性霉素b®(250μg / mL;Gibco,生活技术)。组织处理在24小时内细胞隔离或切片。新鲜细胞隔离绳碎片处理(见下文)或固定在一夜之间有4%多聚甲醛(PFA;Sigma-Aldrich Bornem、比利时),其次是石蜡包埋。为后续原位分析,7μ米部分deparaffinized在二甲苯(VWR, Heverlee,比利时)和水化分级乙醇系列直到淹没在PBS。

2.2。沃顿商学院的果冻干细胞文化

基质细胞从WJ孤立使用外植体组织培养作为以前描述(4]。总之,切除血管后,线矩阵是切成2毫米³在淘汰赛碎片和培养™杜尔贝科的修改鹰的媒介F12 (Gibco,生活技术)补充1%的P / S, GlutaMAX 1%™(200毫米;Gibco,生活技术),10%胎牛血清(Biochrom AG),柏林,德国)。细胞产物从外植体观察时,新鲜的培养基添加每3天。成像,外植体被播种在8-well室幻灯片(μ幻灯片,Ibidi Martinsried,德国)。沃顿商学院的jelly-derived干细胞(WJ-MSCs)收集在80%融合使用StemPro®accutase (Gibco,生活技术)和播种在T75烧瓶(Nunc血压得到较好的控制™;VWR)进一步扩张,玻璃盖玻片(Menzel-Glaser;德国布伦瑞克)表征实验,或在8-well TPM和宋惠乔成像室的幻灯片。

2.3。Trilineage分化

如前所述(执行差异化38),使用人类间充质干细胞功能识别工具包(SC006;研发系统,阿宾顿,英国牛津郡)。脂肪形成的和成骨分化,WJ-MSCs培养3周24-well板块(Nunc)无菌玻璃盖玻片,在各自完成分化中根据设备指令。媒介改变了每3天之后,细胞被固定为4% PFA和存储在PBS在4°C到显微镜成像。验证单层分化文化,脂肪形成的盖玻片是沾油红O(奥罗;Sigma-Aldrich)如前所述38),而成骨的盖玻片从分化与anti-osteocalcin抗体染色设备。chondrogenic分化,刚收获WJ-MSCs被转移到15毫升锥形管含0.5毫升完成chondrogenic分化培养基。离心后,球被培养与媒介改变了每3天3周。之后,chondrogenic丸与4% PFA和固定存储在PBS在4°C到显微成像和阿尔新蓝染色。多光子显微镜,整个chondropellets被淹没在PBS室幻灯片。为了进一步验证分化过程,颗粒被临时冻结,分为7μ使用徕卡m组织切片CM1900UV低温恒温器(徕卡微系统、Diegem、比利时)。解冻cryosections水化有蒸馏水和阿尔新蓝染色(内部生成)在黑暗中30分钟。接下来,红色与核快速清洗和复染色的部分(非功能性需求;Sigma-Aldrich) 5分钟、脱水和安装使用DPX与玻璃盖玻片(默克公司,达姆施塔特,德国)。明视野图片使用尼康Eclipse 80我显微镜拍摄和处理与NIS元素BR 4.0软件(尼康仪器BeLux,布鲁塞尔,比利时)。

2.4。多光子显微镜和宋惠乔成像

房颤和宋惠乔成像的加州大学组织切片,外植体,进行干细胞蔡司LSM 510元安装在一个Axiovert 200(卡尔蔡司,耶拿,德国)和配备了飞秒脉冲激光激励源(美态DeepSee, Spectra-Physics、钙、美国)的中心波长810 nm。扫描整个加州大学部分,10倍/ 0.3目标(Plan-Neofluar 10 x / 0.3,卡尔蔡司)使用。详细的图片被通过一个40 x / 1.1水浸客观(LD C-Apochromat 40 x / 1.1 W Korr UV-VIS-IR,卡尔蔡司)。作为细胞的控制位置,加州大学组织切片()与0.1%复染色4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI;1毫克/毫升;分子探针®,生活技术)在蒸馏水。外植体成像的过程,WJ-MSCs在文化、或chondrogenic丸,一个20 x / 0.75的目标是选择(Plan-Apochromat 20 x / 0.75,卡尔蔡司)。房颤和宋惠乔被发现在向后nondescanned模式模拟光电倍增管。第一次分开的信号激发光束使用长通过二向色镜优势在685海里。接下来,宋惠乔和房颤彼此分离了很长一段通过二向色镜优势在442海里。宋惠乔信号会通过一个10 nm窄带通滤波器的中心波长405 nm。房颤的频道,宽频带通滤波器从450纳米到650纳米是用来清除任何可能泄漏励磁和宋惠乔光。3 d图像数字化后得到结合Z-stack光学部分。 All images were processed using ZEN 2009 Light Edition software (Carl Zeiss).

2.5。免疫组织化学

标记表达分析,7μ米厚的组织切片在10毫米微波抗原检索柠檬酸钠缓冲在pH值为6.0 (Sigma-Aldrich)。接下来,使用peroxidase-based想象发现特定的抗原表达™+系统(Dako, Heverlee,比利时)根据制造商的指示。与主抗体标记之前,组织在Tris-buffered permeabilized Tween-20盐水(VWR)和0.05%(默克化工、Overijse、比利时)(TBS-T)、内源性过氧化物酶活动后用0.5%过氧化氢就熄了。非特异性结合位点被封锁使用TBS-T正常山羊血清(Dako) 10%。随后,组织孵化了2小时在TBS-T主要抗体针对人类octamer-binding转录因子4 (Oct4;1/250;兔多克隆ab19857;Abcam,剑桥,英国),醛脱氢酶家族成员1 A1 (ALDH1A1;1μg / mL;兔多克隆ab23375;Abcam)、α-平滑肌肌动蛋白(αSMA;1/50;鼠单克隆αsm-1;Novocastra™徕卡)、波形蛋白(1/100;鼠单克隆V9;潘Dako)和细胞角蛋白(pan-CK;1/100;鼠单克隆MNF116;Dako),其次是30分钟的孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭山羊anti-rabbit或山羊anti-mouse二级抗体(想象工具包)。可视化结合的抗体,diaminobenzidine (DAB)发色体基质添加后的组织与迈耶的苏木精复染色(莱卡)或非功能性需求的核抗原的检测。染色没有初级抗体作为消极的控制。接下来,彩色部分是使用DPX脱水和安装玻璃盖玻片。光学部分使用米拉克斯集团检查办公桌显微镜幻灯片扫描仪和图像处理米拉克斯集团查看器软件(卡尔蔡司)。

2.6。免疫细胞化学

WJ-MSCs被播种在无菌玻璃盖玻片24-well板和增长到80%融合。WJ细胞被固定为4% PFA抗体染色前的设想™+系统。细胞膜渗透和非特异性结合位点被封锁用PBS补充0.3% Triton x - 100 (Sigma-Aldrich), 1%牛血清白蛋白(我们生物,Swampscott,妈,美国),和10%正常山羊血清(阻断缓冲区)在室温下45分钟。接下来,细胞培养2小时5μg / mL Oct4 (ab19857;Abcam), 1μg / mL ALDH1A1 (ab23375;Abcam),或者αSMA (1/100,αsm-1;Novocastra,徕卡)阻断缓冲区。消极的控制孵化主要抗体。随后,1小时的盖玻片是清洗和孵化HRP-conjugated山羊anti-rabbit或山羊anti-mouse二级抗体的设想工具包。洗后的细胞,核与迈耶的苏木精复染色或非功能性需求的执行,和盖玻片随后被安装在玻璃幻灯片使用Aquatex(默克公司)。染色细胞检查使用尼康Eclipse 80我显微镜和图像处理与NIS元素BR 4.0软件(尼康仪器BeLux,布鲁塞尔,比利时)。

3所示。结果

3.1。详细的可视化脐带内的不同解剖室使用TPM和宋惠乔检测

房颤和宋惠乔信号的基础上,详细的加州大学体系结构生成的图像。图1(一)显示了一个串行扫描的组成部分TPM成像后脊髓组织。没有任何额外的标签代理,我们清晰地观察到整个绳组成和脐带血管的细胞组织,WJ, subamniotic区。加州大学主要由不同类型的胶原蛋白凝胶状的矩阵的支持两个动脉和静脉39]。我们发现了不同组织层次的脐静脉和动脉,是描绘在图1(一)和详细的数据1 (b)和1 (d)。基质内石洞内壁血管,细长myofibroblast-like细胞观察(数字1 (c)和1 (d))。此外,我们发现存在tripolar-shaped细胞在WJ和subamniotic地区(数字1 (c),1 (e),1 (f))。最后,一些中空的血管周围地区观察(图1(一)),可能造成extraluminal血液的存在,在切片中被淘汰了。

3.2。细胞自体荧光不区分基质细胞但不太明亮的血管平滑肌细胞

自体荧光观察整个脐带和局部血管壁(图1)。这种荧光信号起源于高度丰富的平滑肌细胞位于胶原沉积的媒体,就像平行的所示αSMA染色(图2和图S1)。虽然自体荧光是更多的局限于血管由于更高的细胞数量,这是观察到周围的基质细胞的信号强度高于平滑肌纤维(图1 (d))。然而,没有观察到的主要区别在自体荧光基质细胞之间的人口居住在另一个隔间(图1)。此外,血管进一步检查供核细胞的存在与DAPI染色。令人惊讶的是,我们观察到核荧光信号强度方差在细胞在血管壁的不同区域居住。见图3,位于平滑肌细胞和胶原蛋白血管壁的富媒体(红色和绿色荧光,分别地。,数据3(一个)和3 (b))显示高核荧光强度相比,细胞从血管周围动脉外膜(图3 (c))。

3.3。成像的WJ外植体和细胞产物

附加WJ外植体获得大约10天后隔离和随后与TPM成像。label-free的方式,我们可以想象在组织结构和提前细胞(图4 (b))。我们的观察与用亮视场显微镜观察细胞产物(图4(一))。通过扫描外植体附件区(Z-stack;数据4 (c)和4 (d)),我们发现了一个细胞的迁移模式,显示一个向下倾斜的结果从球状外植体表面文化。

3.4。验证WJ-MSCs Chondrogenic分化

确认我们的成像方法的有效性,chondrogenic分化WJ-MSCs评估。检测宋惠乔成人干细胞分化已经报道后基质细胞(40,41]。chondrogenic颗粒由一个复杂的矩阵含有葡糖氨基葡聚糖、胶原蛋白、蛋白聚糖与基质细胞分散在整个矩阵脚手架,正如图所示5(一个)阿尔新蓝染色。事实上,根据他们的自发荧光,WJ-MSCs观察小球的cleft-like宋惠乔(数据结构可视化5 (c)和5 (d))。此外,一个明亮的结节细胞组成的中心周围的胶原蛋白可以观察到颗粒的边缘(数字5 (b)和5 (c))。此外,我们拍摄了脂肪形成的和成骨分化最终状态(图S3)。脂肪形成的分化(图S3a和S3c)后,证实了奥罗染色,我们观察到典型的空洞在荧光信号由于脂滴堆积。成骨分化(图S3b和S3d),低宋惠乔信号检测,来自胶原蛋白沉积在ECM分化。有效性的分化了新创骨钙素的表达。

3.5。TPM表明自体荧光成像的WJ-MSCs文化来源于细胞核周围的细胞器

除了脐带组织,文化explant-derived细胞也使用TPM可视化。如图S2, WJ-MSCs呈形态和拥有大核和多个核仁,细胞器局限于细胞质细胞核周围的地区。后者也显示了Struys等人在超微结构水平(38]。有趣的是,在这项研究中,我们观察到自体荧光来自活细胞的细胞核周围的区域文化(数字6 (b)和6 (d))。几个宋惠乔散射可以观察(图6 (c))。

3.6。Oct4的差异,αSMA,波形蛋白、Pan-CK ALDH1A1表达式原位

像以前我们和其他人所示,培养WJ-MSCs表达几个表面和胞内标记,如古典msc表型面板中,还有其他一些,例如,multipotency标记(如Oct4、核),粘附分子(如CD54,膜),或免疫调节分子(例如,IDO-1细胞溶质)[4,42,43]。在这里,我们试图WJ-MSCs本地化原位通过评估Oct4的表达,转录因子与多能干细胞状态(44]。此外,我们进行染色αSMA,为了评估和myofibroblast-like细胞,平滑肌细胞的血管周的利基和ALDH1A1表达各种干细胞的数量(45]。此外,我们评估由pan-CK染色和细胞骨架蛋白的表达波形蛋白(一种中间丝状体中发现的间充质来源的细胞(38,46]。我们不能与一个特定的表达模式,这些标记特定的解剖位置在脐带,正面和负面两种细胞被发现在各领域(数字7- - - - - -9和图S4)。各自负控制染色中描述电子辅料,S1,自己,S4f S4i, S4l。

αSMA表达强烈脐中观察到血管,是可以预料到的,因为的平滑肌细胞。有趣的是,还WJ基质细胞表达αSMA(图7(一)和2);然而,我们不能观察增加血管周的区域与其他区域内细胞染色(数据没有显示)。波形蛋白和pan-CK表达分析表明,阳性细胞分布在整个脐带,包括血管周的地区(数字S4a-S4f),基质(数字S4g-S4i)和subamniotic区(图S4j-S4l)。值得注意的是,绳衬里上皮膜没有表达波形蛋白原位但显示强烈的pan-CK染色。Oct4在细胞培养WJ(图表示7 (c)),也原位大多数血管周的细胞,间质细胞,甚至羊膜上皮细胞(图8)。ALDH1A1染色更局限于媒体的脐船只,而且WJ基质细胞表达蛋白质(图9)。有趣的是,在WJ细胞培养,细胞阳性ALDH1A1(图7 (b)),表明一个特定的细胞群是孤立的文化或文化发生诱导表达。此外,我们观察到一个变量中表达强度异质文化,主要是小细胞显示深色染色模式。

4所示。讨论

多光子和高次谐波成像提供了一种高分辨率的表征工具,组织和干细胞,由于其非侵入性和不需要自然,而传统的评估组织结构破坏分子和结构水平(例如,蛋白表达和细胞外基质退化)。因此,这无损,label-free方法提供了一个强大的高含量表征工具,优化组织工程协议和评估工程组织植入物(47]。此外,非侵入性的可能性光学跟踪的细胞和组织结构在体外可以应用在未来的研究来评估组织发展,药物毒性筛选或其他治疗干预措施(如细胞植入)[27,48,49]。

在这项研究中,第一个步骤label-free识别脐带组织和干细胞培养进行了评估。通过测量房颤和宋惠乔TPM之后,我们能够想象的主要解剖人类UC的隔间。这些解剖位置,详细描述他们的成分,和潜在的干细胞内容可以发现其他地方2,8,13]。我们清楚地观察到细胞在血管周的安排区域和血管壁。此外,我们发现基质细胞在人口密集的线矩阵和subamniotic区越少。我们的发现密切相关的组织学研究,已经描述了不同的径向分布的基质细胞和细胞外基质(ECM)成分(39,50]。类似的结构和细胞分布模式可以观察到我们的成像方法,例如,subamniotic区三极的细胞的存在。值得注意的是,我们的研究显示细胞和结构安排整个绳只使用固有荧光的细胞和组织组件生成的脉冲激光激发后,没有额外的操作的样品。

与前一个报告Uchugonova和康尼锡,想象不同的亚种的细胞使用label-free设置(41),我们无法区分细胞各亚群基于自发荧光信号强度的差异。虽然房颤是高度丰富的墙壁脐船只,单个细胞没有显示增加或减少强度相比,细胞在其他加州地区。然而,我们做了一个额外的实验为细胞核染色的组织调查colocalization内细胞和房颤。令人惊讶的是,我们观察到一个微分荧光强度在DNA染色(DAPI)。我们假设这种差异暗示DNA含量差异的平滑肌细胞和外膜细胞,鉴于染色效率等于为不同的细胞类型。先前的研究表明,集成DAPI荧光强度很好衡量的DNA含量(51,52]。这可能是由于不同的代谢状态,上述细胞,平滑肌细胞比周围的支持细胞更活跃。进一步评估这个发现,免疫染色还染色质的超微结构分析使用透射电子显微镜应该执行。此外,其他人则记录了隔离的多功能干细胞脐静脉血管周的区域(53]。因此,它应该调查是否DNA含量与多能祖细胞的存在,使用,例如,TPM /宋惠乔成像方法与荧光标记抗体多个祖一直标记(例如,SSEA-4、CD271和CD133)。

来验证我们的成像方法,包括分析chondrogenic分化WJ-MSCs丸。大米等人报道的定量使用双光子激发荧光和宋惠乔无创监测msc分化(40]。他们表明,通过测量内生的对比来源如胶原蛋白、细胞代谢活动的变化,可以可视化形态学和细胞外基质生产。这样,我们可以清楚地发现chondrogenic颗粒和区分新成立的矩阵和细胞分散在整个脚手架。此外,我们拍摄的WJ-MSCs单层文化完全分化的脂肪形成的和成骨的血统。双光子激发荧光和宋惠乔成像adipo——人类从骨髓msc和成骨分化已经报道文化(35,40]。去后,我们观察到类似的空洞荧光信号由于脂滴堆积。成骨分化、低宋惠乔信号检测,来自胶原蛋白沉积在ECM分化。在这种情况下,我们不希望引人注目的信号变化,因为我们以前的报告表明,WJ-MSCs代表一个不成熟的祖在体外骨(38]。此外,我们的文化是有区别的在正常氧含量,而大米等人观察胶原沉积增加缺氧分化条件下(40]。然而,我们label-free和包含IHC分析确认trilineage WJ-MSCs分化潜能的文化。

除了成像加州大学组织,我们可以想象WJ-derived细胞,在隔离和文化。虽然没有宋惠乔,提出培养细胞主要房颤信号起源于细胞器丰富的细胞核周围的区域。这样的发现是感兴趣的,因为它可以允许细胞根据其特定的细胞内分子的检测。使用流式细胞仪,莫利诺等人最近报道三个不同的细胞的检测基于不同子集autofluorescent信号(54]。利用内生荧光团作为细胞生物标志物检测可能是有益的兽医研究使用的脐带,因为immunomarkers并不总是可用的(例如,马或狗的研究)31日]。还需要进一步的研究来验证不同的激光成像手段(例如,流式细胞仪对共焦激光扫描显微镜)和描述特定的信号来自细胞。

除了生长细胞的可视化在盖玻片上,基于我们的AF和宋惠乔成像方法是适合可视化外植体的起始细胞培养。胶原蛋白丰富的外植体碎片(宋惠乔)和提前细胞(AF)很容易发现在附件文化室。此外,外植体培养技术保留最初的WJ组织(细胞利基)的细胞出现。因此,我们建议这样label-free分析可以证明有用的发现:细胞的起源,而实时成像外植体培养过程。

目前不清楚具体的加州大学的组织间包含多功能基质细胞。直到现在,它不可能确定干细胞利基,随后跟随迁移所需的多功能细胞组织的隔间。他们的识别仍然发生在细胞已经在文化。因此,它仍然证明很难隔离特定人群的祖细胞。许多研究都试图解决原位来在体外过渡的脐带干细胞相关标记的表达细胞培养他们的组织起源(46,55- - - - - -57]。然而,几个问题进一步复杂化等研究,例如,各种不同的细胞群隔离技术的出现(例如,I型和II型细胞),也可能受其他细胞污染和缺乏具体的多功能干细胞生物标志物,给没有决定性的结果50,58]。此外,对于一些标记蛋白表达诱导或逐步减少在培养,很难追溯细胞组织内(回到原点46]。我们评估多个候选干细胞标记物的表达表达原位和文化。最初,我们评估了表达式Oct4、多能干细胞的标志(44),α平滑肌细胞表达的SMA,一般一个标志也间充质基质细胞(59),和ALDH1A1表示在正常和癌症干细胞数量(45]。使用标准的免疫组织化学,我们试图定位抗原表达模式的差异;然而,我们无法限制特定的加州大学区域的标记。值得注意的是,在所有线箱内无污点的细胞可以观察,表明原位标记表达式已经先前存在的差异。我们的研究结果与先前的报道,显示αSMA表达位于脐船只和WJ (60)和指示的存在Oct4表达细胞内WJ (43]。此外,我们评估了波形蛋白的表达,表达的细胞骨架纤维msc。波形蛋白是大量表达整个除了羊膜脐带组织。我们的原位和之前的报道细胞培养数据分析(38确认Coskun的最新报告,可以,他们表明explants-derived细胞来自加州大学从羊膜基质,而不是积极的表达波形蛋白和确定αSMA在文化46]。

外植体的细胞培养,一个变量表达式模式显示αSMA和Oct4。这些标记相比,ALDH1A1是所有培养细胞中表达。此外,观察ALDH1A1强度差异较小的tripolar-shaped细胞和纤维母细胞更大。这些细胞是否可以追溯到subamniotic三极的细胞区仍有待确定的实验。其他的研究已经显示,原始多能干细胞隔离(ALDH表达式61年- - - - - -63年]。由于脐带的微分表达式模式组织和孤立的细胞,更多的研究在这种酶的表达文化启蒙应该执行。此外,一些干细胞相关标记很难追踪到他们的组织起源的表达式是受到孤立和文化方法(表型变化)46,57,64年]。人类脐带的细胞来源于不同的隔间被证明表达不同数量的CK亚型在文化、根据他们的隔离方法(64年]。我们发现表达pan-CK在脐带的多个站点,类似于最近报道原位研究Coskun和能46]。pan-CK抗体用于本研究,其中包含CK 5, 6, 8, 17日和19个亚型,各基质细胞染色阳性,血管周的地区,但观察染色强度最高的羊膜上皮细胞衬线。

其他msc在标记如N-cadherin或肌间线蛋白(56是有趣的候选人的跟踪研究外植体结合label-free成像设置。我们认为,通过使用AF和宋惠乔成像结合特定的抗体标记,细胞产物从外植体可以实时跟踪(荧光寿命成像)和识别不同的细胞亚型的潜力。这种方法已经用于癌症研究,成像癌细胞迁移和ECM重塑(65年- - - - - -67年]。

总的来说,这项研究表明,房颤和宋惠乔检测是一种有效的和容易的干细胞的可视化方法原位并可能进一步形成一个起点脐cord-derived干细胞的生物学研究。房颤和宋惠乔最佳适合外植体生活在文化的可视化。因此,成像方法可以是一个有用的工具来评估原位文化转型的干细胞以及确定最优分离和培养条件。我们推测,房颤和宋惠乔成像可能有用的发现:细胞的起源,而实时成像外植体培养过程。此外,潜在的高分辨率成像应该进一步探讨生活在与其他现代标签技术,如抗体结合近红外的荧光团(68年,69年,量子点70年),或其他纳米粒子(71年,72年),没有提供光谱重叠。Label-free监测干细胞,结合先进的染色技术,打开角度更好的细胞特征原位和体外同时,通过可视化居民细胞和细胞外的组件。因此,房颤和宋惠乔成像可以作为一个重要的额外工具,解开脐带内的干细胞利基和其他组织。

缩写

αSMA:	α-平滑肌肌动蛋白
房颤:	自发荧光
ALDH1A1:	醛脱氢酶家族成员1 A1
轻拍:	Diaminobenzidine
DAPI:	4′,6-Diamidino-2-phenylindole
ECM:	细胞外基质
合:	辣根过氧化物酶
msc:	间充质干细胞
非功能性需求:	核快红
Oct4:	Octamer-binding转录因子4
pan-CK:	锅中细胞角蛋白
P / S:	Penicillin-streptomycin
PBS:	磷酸盐
PFA:	多聚甲醛
宋惠乔:	二次谐波发生
TBS-T:	Tris-buffered盐水Tween-20为0.05%
TPM:	双光子共焦激光扫描显微镜
加州大学:	脐带
WJ:	沃顿商学院的果冻
WJ-MSCs:	沃顿商学院的jelly-derived间充质干细胞。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者要感谢女士Katrien Wauterickx,佩特拉希尔肯博士和珍妮女士Santermans援助的免疫组织化学染色和脐带的石蜡包埋组织。这项研究是创新财政支持的机构通过科学和技术(Agentschap voor Innovatie门Wetenschap Technologie, IWT),研究Foundation-Flanders(昏聩Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen, FWO),跨国大学林堡特大学、比利时夏科的基础。林堡省(比利时)被公认为金融支持在图尔IMPULS熔丝二世计划,允许升级的激光源用于这项工作。

补充材料

引用

1. r·r·Taghizadeh k . j . Cetrulo和c l . Cetrulo”沃顿商学院的果冻干细胞:未来的临床应用,”胎盘,32卷,补充4,S311-S315, 2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
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