文摘

自体骨髓间充质干细胞和nonautologous /基质细胞(msc)被评为proangiogenic代理对缺血性血管疾病在成人而不是孩子。相当数量的新生儿和婴儿接受心脏手术的关键先天性心脏病都已经或有可能发展条件与组织灌注不足有关。新生儿心脏手术期间,少量的胸骨的组织通常是废弃的。我们证明msc可以隔绝人类新生儿胸骨组织使用一个非酶的外植体培养方法。新生儿胸骨骨髓msc (sbMSCs)被单独使用,有一个表面标记骨髓msc的特征表达谱,多功能,pluripotency-related基因表达水平较低。新生儿sbMSCs还演示了体外proangiogenic属性。胸骨骨髓msc配合人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)形成三维网络和管体外。在缺氧条件媒体sbMSCs培养也提升HUVEC生存和迁移。考虑到新生儿源、易于分离和proangiogenic属性,sbMSCs可能相关的治疗应用。

1。介绍

间充质干细胞/基质细胞(msc) proangiogenic品质著称,目前正在开发的治疗各种疾病引起的成人或复杂组织灌注不足和血管化1- - - - - -5]。先天性心脏病患儿接受心脏手术也受到疾病影响的灌注和血管化,如先天性冠状动脉异常和毛细管稀疏次要肥大出现在众多的缺陷(6,7)或中风等严重的并发症的治疗8,9]。MSC proangiogenic治疗这些儿科患者会有潜在的实用但没有被探索。这些病人的一个重要的考虑是msc的组织来源,并从胎盘msc,沃顿商学院的果冻,和描述了脐带,尽管污染的孕产妇细胞可能从这些复杂的分离组织(10- - - - - -13]。

根据国家数据库,心脏节律协会心胸外科严重先天性心脏病需要手术纠正在新生儿和婴儿时期发生在超过10000患者每年在美国。这些患者需要通过手术修正正中。正中胸骨切开术后,骨小梁组织碎片和一些骨髓通常出现在胸骨切开术锯条或分散手术领域。我们评估假设sbMSCs可以隔绝这废弃的胸骨组织获得新生儿心脏手术和sbMSCs拥有proangiogenic品质。

2。材料和方法

2.1。胸骨骨髓MSC隔离

这个研究是密歇根大学的机构审查委员会批准。知情同意下,六个患者(年龄在2 - 7天)左心房发育不良综合症,D-transposition伟大的动脉,动脉干被纳入本研究。

胸骨切开术后风动式胸骨锯(Stryker公司,卡拉马祖,MI)骨组织与生理盐水冲洗掉刀片。免费手术领域的骨碎片也被收集。胸骨组织被分为三个10厘米文化菜肴。大约3 - 5毫升的杜尔贝科的修改鹰介质,与high-glucose浓度,GlutaMax我heat-inactivated 10%胎牛血清,100 U /毫升青霉素,100μ0.25 g / mL链霉素,μg / mL二性霉素b(所有从Gibco,卡尔斯巴德,CA)被添加到部分涵盖了从这道菜组织不分离组织,然后改变了每一个5天。冲干净程度天后,组织和细胞都使胰蛋白酶化和山肩。胸骨骨髓msc (sbMSCs)通道1:4 confluency达到70%时,和段落之间的所有实验利用sbMSCs 3 - 8。

2.2。集落形成单位效率

集落形成单位效率(CFE)决心,sbMSCs ( 病人)稀释在烧焦的MSC介质细胞悬液和镀以每10厘米100个细胞组织培养菜(康宁生命科学,那里,MA)。经过14天的孵化与介质的变化每2 - 3天在标准条件下,sbMSCs用PBS洗净,用甲醇固定,与结晶紫染色。殖民地与> 50个细胞数和记录。

2.3。流仪鉴定

表面标记的4 sbMSCs ( 患者)的特点是流式细胞术使用抗体CD29、CD44、CD45、CD90、CD105, CD73, CD166 CD49e、CD56、STRO-1, CD271, SSEA-4, HLA-ABC, HLA-DR,巢蛋白(所有从BD生物科学,圣何塞,CA,除了Stro1从BioLegend购买,圣地亚哥,CA)和贝克曼库尔特MoFlo Astrios流式细胞分析仪使用适当的isotype-matched和清白的控制。

2.4。Trilineage分化能力

sbMSCs multipotency ( 病人)调查使用人类间充质干细胞功能识别工具(研发系统公司、明尼阿波利斯、MN)根据制造商的指示。在媒体分化程度天孵化后,细胞染色anti-osteocalcin抗体,油红O, anti-FABP-4抗体,anti-aggrecan抗体,使用共焦显微镜成像(尼康仪器公司,梅尔维尔,纽约)。脂肪形成的分化效率估计的面积百分比油红O染色使用ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/)和插件阈值颜色(http://www.mecourse.com/landinig/software/software.html)。随机100 x图像( / sbMSC线)被过滤色相饱和过滤器的应用。剩下的部分像素相对于最初的总计算产量的百分比染色的报道。单向方差分析与事后图基测试是用来比较不同油红O染色的不同sbMSC线。

2.5。多能性基因表达

多能性基因的表达Sox-2,Oct-4,Nanog决心在通道4 sbMSCs ( 患者)相对于人类诱导多能干细胞(由博士Eric Devaney hiPSCs,慷慨地提供)使用qPCR。总RNA提取使用RNeasy迷你包(试剂盒,瓦伦西亚,CA)。反转录进行了使用高容量cDNA逆转录工具包和随机引物(应用生物系统公司、大岛,纽约)。定量实时聚合酶链反应进行StepOne +实时PCR系统(应用生物系统公司)与反应混合物cDNA、正向引物和反向引物(表1),1 x iTaq普遍SYBR绿色Supermix (Bio-Rad实验室、大力神、CA)。褶皱基因表达的改变是基于计算 方法。三个独立的实验进行。

表1
定量PCR引物用于这项研究。
2.6。血管生成的基因表达

我们评估表达式为VEGFA,bFGF,ANG1,HIF-1α,HGF在新生儿sbMSC ( 病人)相对于人类脐静脉内皮细胞(瑞士巴塞尔HUVECs,从Lonza)使用qPCR。引物对qPCR分析表中列出1。细胞层与PBS洗,然后使胰蛋白酶化。细胞被离心机和PBS洗。实验qPCR和数据分析的细节,请参见上面的多能性基因分析。三个独立的实验进行。

2.7。发芽和小管形成

我们也探讨sbMSCs促进发芽和小管形成的能力和HUVECs coculture在三维空间中。细胞培养分离使用胰蛋白酶/ EDTA,离心机,resuspended EGM-2媒体(Lonza)含0.275%甲基纤维素(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)。细胞悬架被播种在nonadhesive培养皿的盖子(20μ每下降L)含800细胞/球体与1:1 sbMSC HUVECs组成。挂滴在一夜之间被孵化在37°C和5%的公司2允许球体形成。

纤维蛋白水凝胶在每个生成的24-well板如上所述紧随其后的75 /球状体聚合之前,确保被嵌入到水凝胶球状体。纤维蛋白原聚合后,基底EGM-2被添加到每个。培养7天,球状体成像在100 x使用倒置相差显微镜( 球状体/线)。图像数字化。实验使用sbMSCs孤立从三个不同的病人(行)。

2.8。缺氧sbMSC条件媒体的一代

缺氧是血管的病理生理的后果和灌注赤字(14,15]。缺氧也已被证明能够增强检查参与组成分泌腺proangiogenic MSC的属性(16- - - - - -19]。因此,我们决定sbMSCs条件媒体是否缺氧的设置也可以促进人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)生存和迁移。产生缺氧条件媒体,sbMSCs ( 病人)培养与6毫升T75瓶血压得到较好的控制基底EGM-2媒体在1% O2使用一个低氧孵化器(埃普多夫Inc .)、恩菲尔德,CT)。的媒体是在48小时内收集起来,然后储存在−80°C到用于下游实验。

2.9。内皮细胞迁移

媒体推广缺氧sbMSC HUVEC迁移的条件是由划痕试验评估。为了防止核扩散,HUVECs服用0.01毫克/毫升丝裂霉素C (Sigma-Aldrich) 2小时,用PBS洗净,然后在96孔酶标板(埃森生物科学,安阿伯市,MI)密度为2.5×104每口井的细胞(8井/组)。在标准条件下细胞孵化24小时允许附件。伤口制造商销工具(埃森生物科学)被用来创建一个在HUVEC单层在每个。细胞被洗两次之前的缺氧sbMSC条件媒体。基底EGM-2媒体或补充EGM-2媒体被添加到控制井。细胞迁移是每隔2小时24小时监控和分析CellPlayer细胞迁移软件(埃森生物科学)。平均密度、融合,在每个时间点和宽度确定。独立重复实验。

2.10。内皮细胞增殖

检查参与组成分泌腺缺氧sbMSC促进HUVEC增殖的能力评估。HUVECs 5×103细胞被镀在每个在96孔酶标(6井/组),并允许把24小时在标准条件下24小时血清饥饿紧随其后。24小时后孵化缺氧sbMSC条件媒体,基底EGM-2媒体或补充EGM-2媒体补充道。48小时孵化后,20μL 5毫克/毫升的MTT (dimethylthiazol diphenyltetrazolium溴铵)在PBS被添加到每个和孵化4 h在37°C和5%的公司2。上层清液被除去,200μL二甲亚砜(Sigma-Aldrich)被添加到每个溶解甲瓒晶体20分钟。吸光度与一盘570海里就决定读者(Promega,麦迪逊,WI)。独立重复实验。

2.11。统计分析

统计分析使用棱镜6 (GraphPad软件公司,圣地亚哥、钙、美国)。在适当情况下,单向或双向方差分析(方差分析)与事后图基的诚实的显著差异测试是用于分析组之间的差异。统计学意义是 。

3所示。结果

胸骨组织能够收获在新生儿心脏手术(图1(一))。程度天培养后,msc移植附着的骨小梁片段(图1 (b))。新生儿sbMSCs能够被冷冻保存,解冻,并扩大(数据没有显示)。

(一)
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(b)
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图1
丢弃新生儿胸骨组织含有msc。(a)与胸骨切开术锯条新生儿心脏手术期间组织。(b) Plastic-adherent msc从胸骨组织迁移后14天。比例尺= 100μm。

新生儿sbMSCs证明骨髓msc的许多特征。新生儿sbMSCs单独使用(数据2(一个)和2 (b))和《11 - 47%不等。表面表型sbMSCs被流式细胞术进一步评估。新生儿sbMSCs证明特征表面标记表型与积极表达CD29、CD44, CD90、CD105, CD73, CD166 CD49e, HLA-ABC。新生儿sbMSCs证明负面言论CD45、HLA-DR CD56、CD271 STRO-1,巢蛋白(图2 (c))。还有相当大一部分sbMSCs SSEA-4阳性(图2 (c))。

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图2
人类新生儿sbMSCs的特点。(a和b)新生儿sbMSCs克隆细胞的集落形成效率做了演示。(b)集落形成效率明显不同sbMSC线之间的单向方差分析其次是事后图基测试,除了带括号的组合。(c)新生儿sbMSCs表面标记流式细胞仪鉴定。结果3其他线的代表。

新生儿sbMSCs多功能(数字3(一个)- - - - - -3 (d))和细胞不同的病人似乎有类似的成骨的效率和chondrogenic分化(数据未显示),但明显不同的脂肪形成的分化,由数字图像量化分析(图3 (e))。新生儿sbMSCs培养的标准增长媒体并没有表现出任何自发trilineage分化(数字3 (f)- - - - - -3 (h))。新生儿sbMSCs还演示了低水平的Sox-2,Oct-4,Nanog基因表达与hiPSCs相比,这是符合多能性基因的表达在msc与其他组织(20.- - - - - -22]。之一sbMSC行(第2行)有更高的表达这些多能性基因比其他线(图4)。

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图3
新生儿sbMSCs Trilineage分化。胸骨msc ( 行)与媒体分化程度天孵化。(一)成骨分化被anti-osteocalcin染色了。(b) Chondrogenic分化anti-aggrecan染色。(c和d)去证明了油红O和anti-FABP。(情况)新生儿sbMSCs培养标准增长媒体没有展示任何自发分化。(我)不同效率的脂肪形成的差异化,油红O染色sbMSCs量化的图像分析。数据分析与事后图基单向方差分析测试和显著差异( )与括号表示。

图4
新生儿sbMSCs表达pluripotency-related基因Oct-4,Nanog,Sox-2由定量实时PCR。新生儿sbMSC第2行明显调节这些基因的表达比其他行。双向方差分析和事后分析的数据图基测试和显著差异( )。

新生儿sbMSCs还演示了体外proangiogenic属性。HUVECs相比,新生儿sbMSCs演示了几种血管生成生长因子基因的表达增加(图5)。VEGFA和ANG1表达显著增加在所有sbMSC行,而bFGF,HIF-1α,HGF显著增加的一个子集sbMSC行分析。在球状体只包含HUVECs并未表现出任何萌芽(图6天6(一)),那些包含sbMSCs明显增加(图6 (b))。球状体的组合HUVECs + sbMSCs最发芽(图6 (c)),超过6天(数据继续进展6 (d)- - - - - -6 (f))。这些豆芽出现腹腔(数据的一个子集6 (d)和6 (e))和豆芽从相邻的球状体还可以使吻合(图6 (f))。


图5
新生儿sbMSCs表达血管生成的基因。所有新生儿sbMSC线表示VEGFA和ANG1更大程度比HUVECs,而一半的sbMSCs行评估也有增加bFGF表达式。数据分析与事后图基双向方差分析测试(°指定 和HUVECs)。
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图6
新生儿sbMSCs配合HUVECs球状体,形成一个复杂的萌芽在纤维蛋白凝胶网络。(一)包含HUVECs球状体(400细胞/球体)体现最小6天发芽。(b)包含sbMSCs球状体(400细胞/球体)表现出增加发芽后6天。(c)包含HUVECs球状体和sbMSCs(800细胞/球体与1:1的比例每个细胞类型)展示了一个复杂的网络在6天。比例尺= 100μm。(d和e)管形成(†)明显芽来自球状体的一个子集。比例尺= 50μm。(f)相邻的球状体被交织豆芽(有时彼此连接 )。比例尺= 20μm。

条件媒体缺氧新生儿sbMSCs提升HUVEC迁移和生存(图7(一))。从所有缺氧条件媒体sbMSC线提拔,不同程度,HUVEC迁移划痕试验,减少伤口显示宽度和增加伤口密度和融合。从所有缺氧条件媒体sbMSC行也诱导HUVECs扩散,虽然从一个较小的程度上比由补充EGM-2媒体(图7 (b))。

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图7
条件媒体缺氧新生儿sbMSCs促进HUVEC的迁移和扩散。(一)HUVEC迁移是由一个划痕试验评估。从所有缺氧条件媒体sbMSCs线增强和加速刮伤愈合评估平均(误差=标准差)伤口宽度、密度、和媒体融合与基底,EGM-2。生长因子补充EGM-2(+)作为一个积极的控制。数据分析与事后图基单向方差分析测试,代表两个独立的实验。(b) HUVEC增殖是MTT试验评估。从所有缺氧条件媒体sbMSCs线增强HUVECs扩散比基底EGM-2 ( , )。数据分析与事后图基单向方差分析测试,代表两个独立的实验。

4所示。讨论

符合公认的概念,msc出现在几乎每一个组织(23- - - - - -25],我们的结果表明,从少量的msc可以孤立存在自由骨组织在新生儿心脏手术的进行。我们证实,新生儿sbMSCs骨髓衍生msc被分享的许多特征:sbMSCs单独使用,有表面标记符合骨髓msc,多功能。一般来说,这些sbMSCs高于公布的《成人骨髓msc隔离来自捐助者(7 - 15%)26]。

从骨髓msc通常是孤立的吸入物长骨头或髂嵴的老年人。msc也被隔绝小梁骨碎片(股骨和胫骨)尽管这种技术利用酶消化(27- - - - - -29日]。Sottile等人所描述的类似的非酶的隔离方法,人工股骨骨小梁片段获得msc (30.]。msc从成人胸骨骨髓也被孤立31日]。独有我们的研究,我们能够分离msc通常被丢弃和忽视胸骨组织从新生儿心脏手术。

我们在这里描述的sbMSCs可能有增强治疗的潜力,因为他们来自一个新生儿的来源。众所周知,老化废除骨髓衍生msc的增殖和治疗潜力(26,32,33]。使用废弃的胸骨组织的描述本研究需要一个相对少量的组织可以分离msc,大样本可以收获没有负面影响病人。虽然这些大量的骨头不会那样大能够从一个成年人,一个增强新生儿msc的增殖和治疗潜力最终可能弥补这一缺陷。

我们还表明,新生儿sbMSCs拥有proangiogenic体外特征。小管形成,我们观察到当cocultured HUVECs表明sbMSCs功能促进血管生成的球状体包含的行为是一致的脐血msc和HUVECs以及脂肪msc和内皮祖细胞34,35]。像msc与其他组织隔离,新生儿sbMSCs血管生成生长因子基因表达的36,37]。在缺氧条件(模拟体内环境设置的血管疾病),sbMSCs分泌因子的条件媒体能够促进HUVEC迁移以及从血清饥饿存活。总的来说,这些结果表明,新生儿sbMSCs可能促进体内血管生成的潜力,虽然这并不是直接在这里检查。

新生儿心脏手术复杂先天性心脏病或灌注的患疾病的风险和血管化辅助先天性冠状动脉异常情况和毛细管稀疏次要肥大出现在众多的缺陷(6,7等)或引起严重并发症的治疗中风(8,9]。当别人提出了脐带及脐带血的潜在使用派生的心血管和msc治疗新生儿缺氧缺血性脑病(38- - - - - -40),我们这里的体外研究的结果表明,自体proangiogenic sbMSCs也可能在这些临床情况下效用。

5。结论

总之,新生儿sbMSCs与骨髓msc和分享许多特征也proangiogenic。因此,丢弃新生儿胸骨新生儿心脏手术期间组织的可能是一个潜在来源msc治疗使用,特别是那些小儿复杂心脏病患者有或灌注、血管化的重要患疾病的风险。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

承认

本研究支持的密歇根大学的心脏手术。