封装整个骨髓细胞改善Wistar鼠90%部分肝切除术后的生存

文摘

背景和目的。骨髓细胞的使用被认为是一种治疗急性肝衰竭。在这项研究中,我们调查的影响封装整个骨髓细胞在肝衰竭模型。方法。封装细胞或空胶囊植入老鼠提交90%部分肝切除术。存活率是评估。另一组是安乐死在6、12、24、48和72小时后肝切除术研究细胞因子和生长因子的表达。结果。全骨髓组显示高于10天存活率相比空胶囊组。基因表达与肝再生早期阶段在肝切除术后6小时降低封装细胞组,而再生相关基因增加在12日24和48小时。全骨髓组显示较低的再生速度72小时和半胱天冬酶3的表达和活性更高。相比之下,溶酶体β葡萄糖醛酸酶活性升高空胶囊组。结论。结果表明,封装整个骨髓细胞减少肝再生相关基因的表达,增加那些负责肝细胞分裂结束。此外,这些细胞凋亡细胞死亡和减少坏死,从而增加生存。

1。介绍

急性肝功能衰竭(ALF)的特点是突然损失导致黄疸,肝功能的凝血障碍,肝性脑病在先前健康的个体。如果不及时治疗,会导致肾和多个器官衰竭,昏迷和死亡(1]。正交的肝移植是治疗的首选阿尔夫虽然缺乏一个合适的捐赠者在很短的时间内可以限制这种疗法的成功(2]。除此之外,移植后的终身使用免疫抑制剂具有短期和长期的副作用(3,4]。这些观察和高成本的过程及其并发症导致寻找替代方法阿尔夫,不包括肝移植手术。

使用骨骨髓来源的细胞再生医学已经发展在过去的几年。其功效已被证明在动物模型的慢性(5,6)和急性肝脏疾病(7- - - - - -9]。他们有好几个优势相比,肝细胞是现成的,可以扩大在活的有机体内或在体外(10]。此外,使用自体的细胞将消除需要免疫抑制剂(11]。在动物模型中,异种移植间充质干细胞(12)或封装骨髓细胞(13也没有免疫抑制剂。但是这些细胞的机制发挥其有利影响肝脏再生不完全清楚。他们可能包括增加肝细胞通过分化转移的数量,融合,和/或旁分泌因子的分泌,刺激细胞分裂,抑制细胞凋亡,或调节局部和全身性炎症状态(10,14]。

几种促炎因子参与了肝再生早期阶段。部分肝切除术后,增加了大量的肠道脂多糖(LPS)绑定到地(toll样受体4)枯氏细胞激活MYD88(骨髓分化因子)通路和触发Nf的激活κ核因子- B(κB)和肿瘤坏死因子的释放α(肿瘤坏死因子-α白细胞介素- 6)和il - 6 ()15]。il - 6在肝再生中发挥着关键作用,激活急性期基因和启动肝细胞生长因子(16,17]。Hgf(肝细胞生长因子)刺激肝细胞,通过从G0 G1,因此启动细胞周期(18,19]。分子如Socs3的增加(3)抑制细胞因子的信号和Tgf -β1(转化生长因子)有助于减少在刺激因素和肝再生的停止18,20.]。

部分肝切除术后,有一个复杂的肝脏组织重构的瞬态干扰肝小叶结构(21]。团聚体的血管浸润肝细胞形成门静脉周的地区之前入侵正弦细胞(20.,22]。一些作者认为,在肝再生的早期阶段一个非常细调的实质和nonparenchymal细胞的增殖率是必要的。Ninomiya et al。22]表明,慢肝细胞再生率增加了90%的生存模型中部分肝切除术。

我们的目标是调查骨髓细胞的旁分泌作用和增加生存的机制在老鼠模型中90%的部分肝切除术。

2。方法

2.1。动物

远系繁殖两个月大的雄性Wistar鼠,称重控制温度(g,被安置在18岁到22°C)在光暗周期12 h和免费获取水和标准chow实验动物中心医院丹尼·德·阿雷格里港(HCPA)。处理、护理和处理动物进行了按照规定我们当地伦理委员会批准(协议号10 - 0062)动物保健和遵守国家指导方针。

2.2。实验设计

动物被提交至90%部分肝切除术(PH值90%),随机分为两组。治疗组封装整个骨髓细胞(WBM,)和对照组()收到空胶囊(EC)。生存观察10天后90%博士从两组一组额外的动物是牺牲在6、12、24、48和72小时后90%的PH值(/组/时间点)来评估治疗的早期影响。

2.3。隔离全骨髓细胞和封装

33没有肝损伤动物被用作WBM细胞的捐助者。在无菌的环境中,股骨和胫骨的孤立和WBM从每个骨头刷新了3毫升完全培养基:DMEM(鹰杜尔贝科的修改中,LGC,巴西)补充10%胎牛血清(美国Gibco)、青霉素、链霉素的1%(美国Gibco)。细胞生存能力是由台盼蓝排斥。

细胞执行封装协议,根据我们实验室以前描述(23]。短暂,WBM细胞混合1.5%海藻酸钠(美国Sigma-Aldrich)在完全培养基和挤压通过封装单元类型为J1 (Nisco、瑞士),连接到JMS注射泵。水滴被剪掉5 L / min的气流送到27 G针的尖端,输液速度是40毫升/小时。水滴落入125毫米CaCl洗澡₂和具有离子交联形成固体球形水凝胶珠包含嵌入式WBM细胞。为对照组,空胶囊生产使用相同的方法,虽然没有细胞。由此产生的胶囊是维持正常的细胞培养条件下完全培养基在37°C和5%的公司₂移植前24 h。

2.4。移植手术和胶囊

百分之九十肝切除术是由一个操作符被Gaub和球队24]。总之,左侧侧(30%),左值(40%),优越的叶(20%)被移除,只留下尾状叶。肝切除术是在异氟烷麻醉(久远的、雅培SA、阿根廷)(25]。后立即90% PH值和之前完全缝合,微胶囊(包含3×10⁷WBM细胞(26]或空)被放入到腹膜腔和葡萄糖补充i.p(体重的5%)。术后,动物被给予ip葡萄糖(5%的体重),直到第七天,收到20%葡萄糖标准的饮用水和食物随意。

2.5。安乐死

在公司执行安乐死₂钱伯斯。评价生存,动物安乐死90% HP后10天。评估治疗的早期影响动物安乐死6、12、24、48、72 h后90% HP和立即收集的血液,肝脏被重,部分是flash在液态氮冷冻或石蜡。

2.6。定量实时聚合酶链反应

肝组织的总RNA提取50毫克使用试剂盒试剂(美国英杰公司)根据制造商的指示。两个微克的RNA是使用高容量reverse-transcribed cDNA逆转录工具包(生活技术,美国)。基因表达测定采用TaqMan化验(美国生活技术)基因在肝再生(表1)。测试的RNA的百分比β肌动蛋白被减去计算周期达到阈值(CT)为一个单独的基因从CT试验使用β肌动蛋白试验确定ΔCT和以下公式:百分比β肌动蛋白= (100)×(27]。百分比β肌动蛋白切除肝脏动物是百分比除以β肌动蛋白在正常动物的比例来确定基因在大鼠治疗后90%的PH值正常。没有受伤的动物肝脏被用作校准器集团()。

2.7。肝再生率

肝再生率计算如下:肝再生率(%)=,在那里在PH值之前,估计肝脏重量是是切除肝脏重量的PH值,然后呢是再生肝脏的重量的时候牺牲(28]。

2.8。组织学

石蜡包埋的肝脏标本切成4μ米部分和苏木精和伊红染色())。评估肝细胞增生,肝细胞进行有丝分裂的数量计算10大功率领域(高通滤波器)72年海关在惠普(细胞有丝分裂指数)29日]。

确定的数量和大小的每张幻灯片实质细胞,肝细胞的核数和核间距离测量5高通滤波器利用细胞成像软件生命科学显微镜(奥林巴斯)72 h后惠普。

2.9。酶化验

荧光的半胱天冬酶活动(美国Sigma-Aldrich)化验根据制造商的指示进行。简单地说,大约100μ克的肝脏被放在一个不透明的96孔板和200年μL混合反应的解决方案(包含acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-7-amido-4-methylcoumarin)添加在每个。板孵化在黑暗在每10分钟25°C和激发的荧光读取在360 nm和460年发射。半胱天冬酶活性被蛋白质标准化。

溶酶体-β葡萄糖醛酸酶(Gusb)测量肝脏均质在PBS缓冲蛋白酶抑制剂鸡尾酒为1%。化验使用显色底物进行4-methylumbelliferyl -β-L-glucuronide (Sigma-Aldrich) pH值4.5。一个单位的酶活性1 nmol底物转化为产品每小时37°C。

2.10。统计分析

结果表示为意味着±标准差(SD)或在需要时中位数。统计学生的差异进行评估以及和Mann-Whitney测试是使用非参数变量。分析了存活率kaplan meier曲线。存活率的比较在不同的团体测试的日志等级测试。值小于0。被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。存活率

总体生存率观察肝切除术后10天。WBM的存活率较高组(63.6%)比EC组(6.7%)()。在WBM中动物群体死亡主要在前三天,而在另一组死亡发生在手术后(图1)。因此,评估的影响封装WBM的再生途径的分析后的头72个小时,PH值的90%。

3.2。在肝再生相关基因的表达

首先我们对基因的表达水平与肝再生早期阶段有关。的表达Tnf-α(),Nfκ- b()明显降低PH值在WBM中集团在6小时后90%(数据2(一个)和2 (b))。结果的表达il - 6也减少了()在WBM组相比,EC组(图2 (c))。有趣的是,LPS受体(地)及其中介(Myd88显示组之间没有差异基因表达后6小时90% HP(数据2 (d)和2 (e))。

然后,我们分析了基因与肝再生的进步。12、24、48小时后90% PH值其他基因也WBM和EC团体之间的不同表达。Socs3抑制信号通过il - 6在WBM小组增加12和24小时后90%的PH值(,图2 (f))。Hgf略在WBM中只有24小时后90%的PH值增加(,图2 (g)),而的表达Tgf -β在WBM中增加集团12-48小时(,图2 (h))。

3.3。肝再生率和组织学分析

有趣的是,基因促进肝脏再生减少在WBM中集团,而基因阻止肝细胞内有增加。另一方面,手术后肝再生率逐渐增加,但没有差异组在6、12、24、48小时。然而,如图3(一个)72小时,在WBM组显示较低的再生率相比,EC组(分别为44%和59%,)。然而,没有发现差异有丝分裂细胞的数量在两组(图3 (b))和肝细胞的数量在72小时后PH值也相似(图3 (c))。令人惊讶的是,在肝细胞中核间距离在EC组相比WBM组高在72小时(;图3 (d)),表明在WBM中肝细胞组在EC小于组,类似于正常肝(数据未显示)。这可以解释回复速度越低,衡量残余肝脏重量的变化。

3.4。细胞死亡的机制

因为没有差异被发现对细胞增殖,然后调查如果封装WBM细胞可能导致微分细胞死亡。为了评估可能的细胞死亡的机制与我们的结果,我们量化半胱天冬酶3来衡量坏死的细胞凋亡和Gusb活动作为一个指标。我们观察到WBM组有更高水平的Casp3在任何时间点(,图4(一)),除了在72小时组没有区别。半胱天冬酶3活动也评估肝脏匀浆在24日48和72小时。在WBM中增加相比,电子商务集团只在48小时内(;图4 (b)),这表明从WBM组细胞死亡的凋亡。有趣的是当我们评估Gusb活动在同一时间点,WBM集团提出了72小时的活动比电子商务集团(;图4 (c))表明肝细胞从电子商务组由坏死死亡。

4所示。讨论

在我们目前的研究表明,封装WBM细胞增加十天生存模型的PH值90%再生过程中早期。90%的PH值在6小时后炎性细胞因子在肝脏的合成减少。此外,废除肝再生(如表达的因素Tgfβ和Socs3)增加到12个小时,因此建议减少肝脏再生的速度通过旁分泌因子的分泌。我们的结果证实的发现刘和张13,28,29日,32),显示封装WBM细胞生存在大鼠90% PH值增加。

为期10天的增加存活率6.7% EC组治疗组中63.6%可能不是直接与其他文献中的数据。事实上后存活率90% PH值相当变量。这取决于许多因素,包括外科医生的经验,利用葡萄糖,和麻醉的类型(25]。事实上,一些作者报告100%生存在一个星期30.2天(后)而其他0%的生存31日),本研究利用葡萄糖补充。因此,重要的是要比较之间的差异处理和未经处理的动物在同一个研究小组,因为所有的动物都是提交相同的外科医生,麻醉协议,和葡萄糖。同时,无组空胶囊(EC);因此影响海藻酸本身的存活曲线的可能性不能排除。然而,这些研究结果可以比较的刘和张32报告35%生存空胶囊组在10天内(100%,那些处理整个骨髓细胞)。然而,他们显示Hgf的分泌的增加表明它刺激肝脏再生(32]。

我们评估炎性细胞因子的表达il - 6,Tnf-α,Nfκ- b关键的肝再生的开始(33]。我们观察这些细胞因子都在WBM中减少集团在6小时后90%博士然后我们猜测这可能减少,至少在某种程度上,由于信号降低了枯氏细胞。众所周知,部分肝切除术后枯氏细胞与肠道抗原超载,LPS-binding地触发再生过程(34]。但是,没有表达的差异地和它的中介Myd88检测组之间。值得注意的是,这种差异可能会发生在更早的时间点,因此不会被检测到。

一致的降低促进早期再生阶段相关的基因,Hgf也没有增加在WBM中集团,除了在24小时后90%博士另一方面,的表达吗Tgf-βHgf的抑制剂(35在WBM中),显著增加组12 - 48小时。除此之外,的表达Socs3,一个重要的负监管机构的il - 6块Stat3磷酸化(36,37在WBM中),也增加。综上所述,这些数据表明,封装WBM细胞增加生存通过减少肝再生率。

然而,两组的肝再生率类似到48小时。在72小时才WBM组相比,再生率下降明显EC组。Ninomiya et al。22]表明,突然后再生反应PH值会导致错乱的肝小叶结构损害肝细胞。在他们的工作,肝脏再生的减速增加存活率在90%博士因此,本研究在WBM组存活率是63%比6.7% EC组在手术后10天。

重要的是要强调,上述再生率评估剩余肝脏的重量。因此,更准确的回复速度会有丝分裂指数或肝细胞数。然而,当我们评估这些参数我们没有发现WBM组和EC组之间的差异。然而,核间距离在WBM中更小的组,表明肝细胞与EC组相比会更小。因此,这些结果指出,电子商务组的肝细胞膨胀,这可能有助于让人联想到肝脏重量的增加。

细胞肿胀水肿的退化的迹象,所观察到的洛佩兹et al。37在90%的PH值模型。这使我们假设WBM组肝细胞比电子商务健康组的肝细胞,也许由于保护性细胞死亡。这两个半胱天冬酶3基因表达在WBM和活动增加。此外,Gusb活动,坏死的标志(38在WBM中),低组。这些结果表明,在WBM组细胞死亡的主要机制是EC组细胞凋亡而坏死。

凋亡细胞可能被视为一个控制过程,消除故障,导致凋亡的身体将被其他细胞(吞噬细胞39]。坏死,另一方面,是一种创伤性细胞死亡,细胞膨胀,直到溶解和扩散的细胞内的组件,这将触发免疫反应,导致炎症(39]。我们观察到的结果在两组肝细胞死亡受伤;然而在WBM中组死亡是清洗和控制。

值得注意的是,供体和受体动物没有关系,我们在Wistar鼠的实验研究,是远的动物。然而,随着细胞封装在海藻酸珠子没有预计免疫反应的细胞;这是胶囊的功能。同种异体移植物模型似乎是一个更好的选择,在临床设置一个不可能指望一个病人在急性肝衰竭能提供细胞移植或等待一个匹配捐助。

总之这里给出的结果表明,封装WBM细胞生存在模型中增加90%的PH值,减少在肝再生相关基因的表达等肿瘤坏死因子- - - - - -α,Nfκ- b,il - 6,Hgf,增加那些负责肝细胞分裂结束,等Tgf-β和Socs3。此外,这些细胞凋亡细胞死亡和减少坏死,从而增加长期生存。虽然没有确切的答案如何这些细胞产生有益的影响,一些假设可能被排除。没有免疫调节干细胞的影响,随着数据系统细胞因子水平组之间没有差别(补充图在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/4831524)。相关差异基因在肝脏再生被发现但指向相反的方向(如人们所预料的生存与更快的再生)。同时,在细胞增殖没有发现差异。不幸的是,我们无法从康复胶囊以获取足够的RNA调查WBM细胞发生了什么样的变化,虽然我们组的一个正在进行的研究的初步数据显示,他们可以补偿一些肝功能,以及哪些特定的细胞类型参与这种反应。

缩写

阿尔夫:	急性肝衰竭
WBM:	全骨髓
电子商务:	空胶囊
PH值:	部分肝切除术
有限合伙人:	脂多糖
地:	Toll样受体4
MYD88:	骨髓分化因子
肿瘤坏死因子:	肿瘤坏死因子
il - 6:	白细胞介素- 6
Hgf:	肝细胞生长因子
Tgf-β:	转化生长因子
Nfκ- b:	核因子k B
Socs3:	抑制细胞因子信号3
Gusb:	溶酶体,β葡萄糖醛酸酶
SD:	标准差。

利益冲突

作者没有利益冲突声明。

作者的贡献

卡Uribe-Cruz和卡洛斯奥斯卡基尔贡献同样这项工作。

承认

这项工作是由FIPE / HCPA PRONEX / FAPERGS 10/0039-3。

补充材料

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