多层膜的粘多糖和胶原蛋白我生物调节功能和微泡释放内皮祖细胞

文摘

多层复合膜的生物材料可以增加脂肪干细胞或osteoprogenitor细胞的功能。最近的证据表明内皮祖细胞(epc)和内皮祖细胞释放微泡(MVs)血管生成和血管修复中扮演很重要的角色。在这里,我们调查的影响,生物材料多层膜的透明质酸(HA)或硫酸软骨素(CS)和胶原蛋白我(Col)功能和MVs释放内皮祖细胞。叠层(LBL)技术应用于构建多层复合膜。四种类型的膜由吸附公顷或CS和坳我或者与不同层次进行了研究。结果表明,所有四种类型的多层复合膜可以促进内皮祖细胞增殖和迁移,抑制细胞衰老、凋亡,激活caspase-3的表达。有趣的是,这些生物材料释放增加,mir - 126水平的EPCs-MVs。此外,CS-Col我和CS膜表层显示最对促进内皮祖细胞增殖的影响,EPCs-MVs EPCs-MV释放,mir - 126水平。总之,HA / CS和胶原蛋白我由多层复合膜可以促进内皮祖细胞功能和释放mir - 126油层EPCs-MVs,它提供了一种新策略对组织修复治疗。

1。介绍

医学生物材料组织或器官的修复或更换高分子物质。生物材料如透明质酸(HA)、硫酸软骨素(CS)和胶原蛋白(Col)生物活性干细胞(1]。Fibril-forming坳我(Col)矩阵作为一个最丰富的蛋白质还会影响增长,传播,和分化的干细胞(2- - - - - -4]。葡糖氨基葡聚糖HA和CS,细胞外基质(ECM)成分配合许多细胞表面粘附蛋白(如纤连蛋白)和细胞因子(生长因子),可以影响细胞生长和分化等生物学过程(5,6]。此外,CS能促进组织可溶性坳我前体成纤维状的形式对ECM结构和功能至关重要,影响脂肪干细胞的活性(7]。

各种表面改性技术已被用于改善生物材料的生物活性。所谓分层技术(LBL)技术已成为一种简单而通用的物理表面改性的方法。大分子包括坳我,哈,CS自然吸附和粘连字符允许为多层复合膜。坳我和CS或公顷被认为是适合做多层膜,ECM-like特点和作用[8,9]。HA-Col我或CS-Col LBL多层薄膜为原料可以调节成纤维细胞细胞和osteoprogenitor干细胞功能(增殖、迁移和再生),可用于使植入物的生物活性涂层(1,10]。然而,是否组件(我或者我CS-Col HA-Col)和顶层(HA、CS或坳I)的多层生物膜影响EPC活动仍不清楚。

内皮祖细胞(epc)的前身内皮细胞从骨髓动员到外周血为了应对缺血或损伤11,12]。近年来,许多组织内皮祖细胞在组织创伤的疗效,报道心脏梗塞,缺血性中风(12- - - - - -15]。有人建议,内皮祖细胞的治疗效果可能受到身体的病态条件(16,17]。因此,提高EPC函数是一个合理的策略应用的治疗。微泡(MVs)脂质膜小泡直径0.1 - 1μm时释放的细胞被激活或凋亡。他们带着他们的母细胞的特点和影响功能的受体细胞运输蛋白质的内容,microrna(大鹏)和mrna (18]。内皮祖细胞的治疗效果是目前被认为是部分相关EPCs-MVs [19]。此外,它已被证明,mir - 126中扮演一个重要的角色在调解EPCs-MV函数(20.]。

在这项研究中,我们调查的影响,不同的多层膜(我或者我CS-Col HA-Col)与不同层(HA、CS或坳I)在EPC细胞增殖、迁移、凋亡、衰老,MV释放和mir - 126。

2。材料和方法

2.1。制备多层复合膜

多层膜组装在清洗培养皿分别。聚乙烯亚胺(PEI)是用于pH值7.4作为锚定基础层获得积极的净电荷的各自的基质。多层膜形成的裴层使用CS或HA聚阳离子聚阴离子和坳。聚阴离子层(HA或CS)吸附在pH值为15分钟4.0,虽然坳我层吸附在同一pH值为20分钟。每个吸附步骤之后,冲洗以0.15 M氯化钠溶液(pH值4.0)为3×5分钟。因此,生物材料与多层膜系统是通过吸附HA / CS和坳我或者在裴层。我们构建了四种类型的多层膜。他们是1型(定义为坳我):三个影响HA-Col我和一个额外的层公顷(七替代层顶部哈和坳我哈),2型(定义为HA-Col):四个影响HA-Col我(八公顷的替代层和坳坳我我在上面),3(定义为类型坳我):三个影响CS-Col我和一个附加的第七层CS(七层替代CS和坳上面我和CS),和类型4(定义为CS-Col):四个影响CS-Col我(8替代层CS和坳坳我顶部)。未经处理的板是设置为汽车集团。

2.2。内皮祖细胞的文化

男性成人(8 - 10周的年龄;重量范围从20到25 g) C57 /提单老鼠用于所有实验。内皮祖细胞从骨髓单核细胞生成(跨国公司),我们之前报道21,22]。总之,刷新了骨髓从胫骨和股骨和跨国公司通过使用密度梯度离心法分离。跨国公司从C57小鼠分离计算和镀fibronectin-coated 6-well板块,然后在内皮细胞基底medium-2 (EBM-2)补充5% FCS包含EPC增长细胞因子鸡尾酒(Lonza Walkersville,医学博士,美国)。后三天文化井不涂(汽车集团)或涂以生物材料膜,不依从细胞被洗了PBS。此后,培养基是改变每2天。

2.3。细胞凋亡检测

细胞凋亡是由赫斯特33258年分析染色和膜联蛋白V-PE / 7-AAD凋亡检测设备(BD生物科学)正如我们先前描述(23]。总之,内皮祖细胞被播种文化井不涂(汽车集团)或涂以生物材料上校,我HA-Col,上校,我或CS-Col膜的密度2×10⁵无血清培养系统/在2毫升EBM-2媒介。文化24 h后,细胞凋亡率测量。赫斯特33258染色,细胞被固定和染色与赫斯特33258年解决方案根据制造商的指示(Beyotime)之后,荧光显微镜观察。为每个好五个独立的字段进行评估。阳性细胞的平均数量和总细胞/字段确定(放大200倍)。细胞的凋亡率被定义为阳性细胞的比例与总细胞。和膜联蛋白V-PE / 7-AAD凋亡检测,细胞被洗与PBS resuspended 100μ与5 L 1 x Annexin-binding缓冲区,孵化μL PE-conjugated膜联蛋白V和5μL 7-aminoactinomycin (7-AAD) 15分钟在黑暗中,然后通过流式细胞术分析。细胞染色与膜联蛋白V-PE和7-AAD被认为是凋亡晚期内皮祖细胞,这些彩色只有膜联蛋白V-PE被认为是早期凋亡细胞。实验重复三次。每组每个实验和三个板块进行了分析。

2.4。内皮祖细胞增殖试验

内皮祖细胞的增殖能力测试通过MTT (3 -4,5-dimethylthiazol-2-yl2、溴化5-diphenyltetrazolium)(σ5毫克/毫升)测定。内皮祖细胞被播种在96孔板涂层或涂层与生物膜(上校,我HA-Col,上校,我或CS-Col100年)和培养μL EBM-2(补充10%的边后卫)如上所述。麻省理工的解决方案(20μL)添加和孵化为4 h在37°C细胞;150μL DMSO溶液添加到每个好和细胞孵育15分钟37°C。细胞的光学密度(OD)值是读取在490 nm标(BioTek)。细胞一式三份井在每个时间点,检查和实验重复了三次。结果计算出的值在三个独立的实验中获得的。

2.5。内皮祖细胞的迁移分析

内皮祖细胞的迁移距离是衡量划痕试验。内皮祖细胞在6-well融合细胞培养板没有涂层(汽车集团)或涂膜生物材料(上校,我HA-Col,上校,我或CS-Col)。划痕是通过细胞单层使用P200吸管小费。与PBS洗涤后,细胞培养,0.5%的边后卫维护媒介。受伤区域的照片被立即(0 h), 48 h后刮去监控细胞的入侵到挠。定量分析的迁移测定以下方程:

2.6。细胞衰老检测

长期的文化是用于建立内皮祖细胞的衰老模型。总之,内皮祖细胞培养在6-well板不涂(汽车集团)或涂膜生物材料(上校,我HA-Col,上校,我或CS-Col4天)。在那之后,β牛乳糖染色工具包(Beyotime中国)被用来分析衰老内皮祖细胞。总之,与PBS洗涤后,内皮祖细胞种植在6-well板不涂(汽车集团)或涂膜生物材料(上校,我HA-Col,上校,我或CS-Col)处理2%甲醛和戊二醛0.2% PBS 6分钟,然后用新鲜的半乳糖苷染色孵化解决方案(1毫克/毫升半乳糖苷、5更易与L亚铁氰化钾,5 L更易与铁氰化钾,和2更易与L MgCl₂;pH值6)12 h在37°C没有有限公司₂。染色后,中细胞和总细胞数在3种不同的微观领域。的百分比β牛乳糖计算阳性细胞。

2.7。准备和EPCs-MVs检测

EPCs-MVs生成从内皮祖细胞培养如前所述20.]。总之,内皮祖细胞在细胞培养中培养菜不涂(汽车集团)或涂膜生物材料(上校,我HA-Col,上校,我或CS-Col)。当融合增长到80%,细胞被洗PBS和新鲜培养基培养48 h。然后细胞中收集和离心机重300克,15分钟,其次是2000 g, 30分钟,去除细胞碎片。脱细胞培养基是离心机在20000 g,颗粒MVs 2 h。MVs resuspended有20纳米过滤(绘画纸、匹兹堡、PA) PBS。细胞数量的粒子被发现纳米颗粒分析仪(NTA300、莫尔文、英国)。

2.8。mir - 126的分析

的水平在EPC-MVs mir - 126是由实时PCR。总大鹏提取利用miRNeasy迷你包(试剂盒)制造商的指示。使用Hairpin-it mir - 126互补dna合成™microrna rt - pcr量子化工具包(GenePharma、上海、中国)基于工厂仪器(25°C为30分钟,30分钟42°C, 5分钟和85°C)。实时PCR参数为3分钟95°C;40在95°C周期进行12和60°C 40年代(23]。PCR引物如下:5-TATGGTTGTTCTCGACTCCTTCAC-3和5-TCGTCTGTCGTACCGTGAGTAAT-3 mir - 126;TCG 5-CTC GCT 5-AAC GCT TCA和GCA GCA CA-3 AYY YGC GT-3 U6。定量实时PCR进行实时PCR系统(Bio-Rad)。小核RNA U6 (U6)作为内部控制。相对mir - 126的表达是通过计算方法(24]。

2.9。免疫印迹分析

内皮祖细胞的蛋白质提取与裂解缓冲。蛋白溶解产物通过sds - page凝胶电泳和转移到PVDF膜。1 h和孵化的膜被封锁主要抗体caspase-3(美国CST)和β美国肌动蛋白(CST)一夜之间在4°C。与TBST洗涤3次,30分钟后,免疫反应性的可视化是发射极耦合逻辑(美国通用电气医疗集团)的解决方案。

2.10。统计分析

数据都表示为均值±SD。多个双向方差分析进行比较。比较了两组利用学生的表现以及(GraphPad棱镜5软件)。被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。多层膜HA / CS-Col我同样抑制EPC细胞凋亡

赫斯特33258染色膜联蛋白V-PE / 7-AAD分析表明,多层复合膜显著降低血清培养诱导EPC细胞凋亡(与车辆;数据1(一)和1 (b))。此外,免疫印迹数据显示,裂解caspase-3水平,与诱导细胞凋亡,抑制了多层复合膜(与车辆;图1 (c))。有趣的是,我们并没有发现任何显著差异的测量在四个多层复合膜,表明他们都有对内皮祖细胞凋亡的影响。

3.2。多层膜HA / CS-Col我促进EPC增殖,在最好的上校我膜

MTT试验表明,所有四个多层复合膜(上校,我HA-Col,上校,CS-Col)显著促进EPC增殖(- - - - - -,- - - - - -,- - - - - -,倍,分别地;图2)与对照组相比。与此同时,我们发现上校是最有效的提高EPC增殖。的OD490价值上校我治疗内皮祖细胞- - - - - -,- - - - - -,倍上校,我HA-Col,CS-Col分别对内皮祖细胞(图2)。

3.3。多层膜HA / CS-Col我同样提高EPC迁移

刮伤进行了试验评估多层复合膜在EPC迁移的影响。结果表明,所有四个多层复合膜显著增加内皮祖细胞的迁移能力,平均迁移面积增加了- - - - - -,- - - - - -,- - - - - -,倍,分别上校,我HA-Col,上校,CS-Col治疗内皮祖细胞(图3)。然而,我们没有发现任何差异的四个多层复合膜。

3.4。多层膜HA / CS-Col我同样抑制EPC衰老

确定细胞老化,β牛乳糖被用作生化标记。在我们的实验中,内皮祖细胞%衰老速度后长期的文化。正如我们所料,epc时降低了衰老的速度在增长上校,我HA-Col,上校,CS-Col多层复合膜(%,%,%,%,分别地。,图4)。此外,我们并没有发现任何显著差异在四组。

3.5。多层膜HA / CS-Col我以不同的方式增加EPC-MVs释放

我们的研究结果表明,内皮祖细胞上生长上校,我HA-Col,上校,我或CS-Col涂布培养板释放更多的MVs(与车辆;图5)。我们还发现,四种类型的膜显示不同的影响EPC-MV释放。上校我对刺激EPC-MV版本(与最高的影响上校,我HA-Col,或者CS-Col;图5)。内皮祖细胞的MVs发布活动在其他组(HA-Col也是不同的,上校,我和CS-Col;图5),这表明EPC-EM释放受到不同的生物材料。

3.6。多层膜HA / CS-Col我以不同的方式增加EPC-MVs mir - 126水平

MV大鹏可以调解MVs的功能。我们发现mir - 126在EPC-MVs增加了四个不同的膜(上校,我HA-Col,上校,我或CS-Col(图)后24 h文化6)。我们还发现的影响上校是最高的(对比上校,我HA-Col,或者CS-Col;图6)。从HA-Col EPC-MVs mir - 126水平远远高于来自哪里上校我(和上校我;图6从CS-Col),是低于来自哪里上校我(和CS-Col;图6)。

4所示。讨论

在这项研究中,我们研究了四种类型的多层膜的影响(上校,我HA-Col,上校,我和CS-Col)在EPC和EPC-MV释放功能。主要的研究结果表明,所有四种类型的膜可以促进EPC增殖和迁移和抑制细胞凋亡和衰老。膜也可以促进富裕EPC-MVs mir - 126的释放。其中,上校我最好的影响促进EPC增殖和mir - 126油层EPC-MV释放。

最近的证据表明,表面改性与寡肽等生物分子或聚糖可以代表ECM的组件被频繁应用于实现一种改进的治疗反应医疗植入物(25]。生物材料表面的粘多糖,如HA和CS,发现加强信号转导到细胞,促进osteoprogenitor细胞传播,增殖,分化2,3]。在这项研究中,我们发现,生物材料组成的多层膜(HA / CS)和坳我促进内皮祖细胞功能。此外,扩散促进效果显著提高,当计算机科学上的应用coi膜组成,表明CS对内皮祖细胞可能更适合。

内皮祖细胞被认为在内皮完整性起着重要的作用,血管内稳态,和血管生成,这是一个重要的内源性组织修复和再生机制。介绍或动员内皮祖细胞可以恢复组织血管化后缺血性中风和重建内皮完整(21,26]。各种研究试图提高EPC功能在生理和病理条件下,这样他们可以有效地用于治疗(27,28]。我们小组报告说,超表达的趋化因子受体CXCR4和ACE2可以提高EPCs-based治疗缺血性中风的有益作用通过促进EPC增殖和生存29日,30.]。本研究首次提供了新颖的证据对生物膜的影响(HA / CS和坳我多层)内皮祖细胞,这可能是重要的生物材料和干细胞应用于临床治疗。生物膜的有利影响内皮祖细胞可能通过促进细胞增殖活性,抑制细胞凋亡,减少细胞衰老。几个途径可能参与了这些影响。例如,Ras / ERK / VEGF和PI3K / Akt /以挪士信号通路已报告与EPC增殖,迁移和管形成能力(27,28]。然而,精确的潜在机制需要进一步研究。

干细胞的治疗效果在一定程度上与他们发布了MVs [19]。MVs不仅携带母细胞来源的特点,被用作生物标记,但也会影响受体细胞的功能通过转让内容(蛋白质,microrna和mrna) [31日]。循环内皮细胞的数量释放MVs被证明增加许多血管疾病包括严重高血压、急性冠脉综合征、各种形式的血管炎(18,32- - - - - -34]。我们有报道说EPC-MVs中风的严重程度呈负相关,病人的大脑缺血性梗塞体积。此外,增加EPC-MVs水平与缺血性中风(血管密度呈正相关20.]。MVs可能是重要的潜在的内皮祖细胞的机制发挥其功能。EPC-MVs已报告保护肾脏缺血再灌注损伤,并可能增强neoangiogenesis人类胰岛细胞(35,36]。EPC-MVs能促进内皮细胞生存、增殖和管形成能力,通过在MVs mir - 126 (19),血管生成和血管的完整性发挥了关键作用37]。循环mir - 126这可能产生atheroprotective效应已被证明是减少血管疾病,包括中风和冠状动脉疾病(38- - - - - -40]。在EPC-MVs mir - 126可以转移到邻近的细胞调节受体细胞的活动。结果表明,油层mir - 126 EPC-MVs H / R HB-ECs诱导细胞凋亡和改善功能障碍通过激活PI3K /以挪士/不通路(20.]。詹森等人报道,mir - 126运输到人类冠状动脉内皮细胞(HCAECs)内皮细胞释放MVs (emv)和监管HCAEC迁移和扩散41]。这些表明,MVs的水平,内容很重要因素密切相关的细胞状态和功能。EPC-MVs富含mir - 126可能对受体细胞起到有益的作用。在目前的研究中,我们显示的数量和mir - 126从实验多层膜尤其是EPC-MVs水平coi都比对照组多,研究表明生物膜可以促进EPC-MVs功能。换句话说,他们可能有助于增强内皮祖细胞治疗效果。多层治疗改善了EPC函数不仅可以通过调节扩散,迁移,衰老,内皮祖细胞的细胞凋亡,但也通过释放mir - 126油层MVs进一步促进邻近细胞的功能。然而,这种假设需要验证通过进一步调查。

此外,数量和mir - 126级别的EPC-MVs膜强烈坳我是不同于膜HA-Col。的数量和mir - 126水平EPC-MVs上校,我从这些膜CS-Col也明显不同。因此,我们推测,生物材料直接接触的内皮祖细胞在调节中发挥着关键作用EPC-MVs的释放和mir - 126的内容。这可以帮助选择最有效的生物膜为提高EPC函数时应用于临床治疗。

5。结论

总之,生物材料等上校,我HA-Col,上校,我或CS-Col构建多层膜可以调节EPC功能和数量和mir - 126 EPC-MVs水平。这些生物材料的有利影响膜可能通过促进增殖、凋亡,和antisenescence内皮祖细胞的能力,以及通过加强EPC-MV释放,mir - 126水平。因此,结合使用的生物材料和干细胞可能提出一个新颖的方法,促进伤口愈合和组织再生。然而,在动物模型和患者需要进一步调查。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Bingyan戴、Qunwen锅和李Zhanghua贡献同样这项工作。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金支持的(国家自然科学基金委、81400360和81400360号);广东省科技计划项目(没有。2014 a020212293);广东省医学科学研究基金会(没有。B2014311);湖北省和国家自然科学基金(没有。2015 cfa079)。

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