文摘
人类鼻甲间充质基质细胞(hTMSCs)小说干细胞来源于鼻下鼻甲组织。他们很容易隔离的捐赠组织鼻甲切除术后或鼻甲切开术。在这项研究中,我们应用hTMSCs病毒的基因传递系统使用聚乙烯亚胺(PEI)作为基因载体;此外,hTMSCs的细胞毒性和转染效率进行评估确认潜在的基因治疗的资源。DNA-PEI纳米颗粒(NPs)通过添加生成DNA和裴解决方案的特点是凝胶电泳和通过测量颗粒大小和NPs的表面电荷。hTMSCs是对待DNA-PEI NPs 4 h,和毒性NPs hTMSCs和基因转染效率的监控使用MTT测定,荧光图像和流式细胞术在24小时和48小时之后。在一个较高的消极和积极收取比例,hTMSCs DNA-PEI NPs治疗导致细胞毒性,但DNA转染效率提高由于NPs之间的静电效应和hTMSCs的膜。重要的是,这项研究的结果证实,裴可以提供DNA与效率高、hTMSCs表明hTMSCs可以被认为是未开发的资源在基因治疗中的应用。
1。介绍
干细胞可以分为两种主要类型:胚胎干细胞(ESCs)源自囊胚的内细胞团1)和成人干细胞(对asc) [2),分离各种成年哺乳动物的组织3]。ESCs多能性和能够分化为内胚层、中胚层,和外胚层,但相关的伦理问题,因为必须摧毁胚胎细胞的过程中收获(4,5]。另一方面,对asc可以孤立从成人组织没有任何伦理问题和展示自我更新和分化成其他类型的干细胞存在的特点相同胚层(6,7]。建议对asc的缺点之一是限制类型的干细胞,他们可以区分。然而,这个问题也被克服后最近的研究表明潜在的干细胞分化转移无关的细胞与起源组织(8- - - - - -10]。最常用的再生医学对asc是间充质干细胞(msc),尤其是来自骨髓msc(综合),因为他们容易隔离和快速扩散等特点在体外。此外,其他类型的msc被发现和分离各种成人组织如脂肪,脐带血,牙齿组织,胎盘和外周血11- - - - - -15),用于组织工程和再生医学的领域。
人类turbinate-derived间充质基质细胞(hTMSCs)被视为一种隔绝的msc消除在鼻子下鼻甲组织。收获的过程获取骨髓hBMSCs与高水平的痛苦,因此新方法是必要的。然而,hTMSCs可以分开组织丢弃鼻甲切除术或鼻中隔成形术后由于鼻下鼻甲肥大的组织。的MSC-like特点hTMSCs已确认使用CD标记在先前的研究16]。此外,hTMSCs可以迅速扩散在体外,类似于其他类型的msc、和显示分化为成骨细胞的能力,位于细胞在体外(16- - - - - -18),以及骨突组织在水凝胶系统在活的有机体内(19]。hTMSCs根据这些特点,他们也可以被认为是有前途的细胞来源组织工程和再生医学。
试图使用基因疗法治愈疾病的DNA,可能治愈慢性肉芽肿性疾病,免疫缺陷、癌症和其他复杂疾病(20.- - - - - -22]。基因治疗涉及到细胞内引入外源基因通过病毒或病毒的系统包含一个特定的网站物理或化学对DNA。DNA编码的信息转移到通过信使rna转录;此后,mRNA结合tRNA和准备的氨基酸链形成的蛋白质。这是基因治疗的主要优势,创建特定细胞所需的函数使用DNA通过控制蛋白质合成。此外,这种基于基因疗法可能目标特定疾病(23]。因此,理想的和可裁制成衣的干细胞可以通过基因转移,准备和干细胞可以申请各种组织使用的再生基因传递系统。
聚乙烯亚胺(PEI)是最著名的高分子领域的基因转移载体病毒基因传递(24,25]。胺组的每个重复单元在其分子结构,使其与DNA结合,形成复合物(26]。此外,贝聿铭的质子化了的胺核内体促进离子流入和破坏的核内体膜。这个过程可能是DNA的可能机制成核和随后的消除裴27]。在先前的研究中,转染效率之间的线性和分支裴在同一浓度,比较和效率更高的支裴应用时(28]。这些结果证实的一级胺裴基因转染效率的影响。
目前研究的总体目标是使转染增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因使用分支hTMSCs PEI-containing基因载体。我们在本研究解决以下问题。(1)hTMSCs合适的细胞来源的基因疗法吗?(2)hTMSCs裴一个有效的基因载体吗?(3)我们可以应用这个基因传递系统调整的特定蛋白质的表达在进一步的研究中hTMSCs吗?解决这些问题将提供的证据的适用性hTMSCs在基因治疗和再生医学。
2。材料和方法
2.1。材料
支裴(10 kDa)和异硫氰酸罗丹明B (Rhod B ITC)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国),和pEGFP-N2编码的红移变体野生型绿色荧光蛋白从Clontech购买(BD生物科学;帕洛阿尔托美国CA)。
2.2。隔离和hTMSCs文化
新鲜的下鼻甲组织从废弃的组织获得从一个年轻女子(22岁)接受了天主教大学部分鼻甲切除术的韩国,圣玛丽医院。本研究的协议是被人类受试者的内部审查委员会研究和伦理委员会(kirb - 00399 - _18 - 005),并从病人知情同意收购在入学之前这个实验。获得的下鼻甲组织使用生理盐水冲洗3 - 5倍与庆大霉素(Kukje医药行业;国军、韩国)。组织与Antibiotic-Antimycotic然后洗了三次的解决方案(Gibco;美国马里兰州盖瑟斯堡),和两次磷酸盐(PBS),在被切成碎片(1毫米3)。洗组织放置在培养皿杜尔贝科的修改鹰的介质(Gibco)含10%胎牛血清(的边后卫;Gibco强;大岛屿,美国纽约)和孵化37°C的氛围中5%的股份有限公司2。媒介是改为每2 - 3天新鲜培养基。细胞漂浮在文化板块分离的组织碎片。获得的hTMSCs培养细胞生长中有10%的边后卫和1% penicillin-streptomycin (Gibco BRL)基本medium-alpha (MEM -最小α)组织培养瓶(BD猎鹰;美国加利福尼亚州圣何塞)37°C和5%以下公司2。hTMSCs是沾CD34 (hematopoietic-positive标记),CD90 (msc标记)和存在(msc)标记抗体细胞表面,并评估使用流式细胞仪(BD生物科学)确认其具备干细胞属性msc。hTMSCs的异常是保证播种前用台盼蓝染色法。进行基因转染hTMSCs 70%融合。
2.3。提取的DNA和制备DNA-PEI纳米颗粒(NPs)
质粒DNA是培育出来的大肠杆菌(应变DH5α),然后使用PureLink endotoxin-free cDNA提取HiPure质粒过滤Midiprep工具包(表达载体;Lohne,德国)后,制造商的协议。DNA的纯度和浓度测量nanodrop分光光度计(nd - 1000 UV / Vis分光光度计;热科学;美国威尔明顿,德)。DNA是1毫克/毫升浓度稀释Tris-EDTA缓冲区。裴溶液溶解在蒸馏水(DW)添加到1μg的DNA在不同的消极和积极(N / P)电荷比率1,2,4,8日,12日和16日,分别。立即DNA-PEI的解决方案是漩涡,NPs培养30分钟到形式。
2.4。表征DNA-PEI NPs
DNA-PEI NPs的形成是由进行凝胶电泳验证Tris-acetate-EDTA缓冲区(AMRESCO; 1.2%的琼脂糖凝胶梭伦,哦,美国)并使用紫外图像可视化站(UVP;BioDoc-It成像系统;高地、钙、美国)和溴化乙锭(AMRESCO;梭伦,哦,美国)。的粒径和表面ζ电位DNA-PEI NPs是衡量动态光散射(elsz - 1000;大冢电子;日本大阪)在室温下。
2.5。细胞毒性测试
hTMSCs播种在24-well板块(Nunc;鲁开德、丹麦)细胞/密度和孵化24小时之前与DNA-PEI NPs接受治疗。无血清的细胞被洗MEM -α去除的边后卫和新鲜MEM -取代α。hTMSCs是对待每个DNA-PEI NPs 4 h,然后细胞生长介质中取代。转染24小时和48小时后每N / P DNA-PEI NPs、细胞毒性测试执行与3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)测定,比色测定用于测量细胞酶的活性,降低水溶性MTT试剂对其不溶性紫色甲瓒。总之,100年μL (MTT解决方案在PBS(5毫克/毫升)被添加到每个好hTMSCs和盘子37°C 5%孵化有限公司2的气氛。4 h后,整个介质被移除,500μL(二甲亚砜(DMSO)补充道,和盘子孵化下30分钟100 rpm摇晃解决甲瓒晶体。590纳米的光密度是衡量使用酶联免疫吸附试验板阅读器(EL808超微型板块读者;Bio-Tek仪器;美国佛蒙特Winooski)。所有的实验都是一式三份完成。
2.6。转染效率
hTMSCs是镀细胞/密度在12-well板(Nunc)转染前24小时。两个微克的DNA是添加到每个DNA-PEI NPs与各种形式的N / P电荷比率。的hTMSCs对待每个比率DNA-PEI NPs 4 h。转染24小时和48小时后,治疗hTMSCs监控确认EGFP的表达使用Axio成像仪A1(卡尔蔡司缩微成像GmbH是一家;德国哥廷根),分析了AxioVision Rel。4.8软件(卡尔蔡司缩微成像GmbH),通过胰蛋白酶化评估转染效率和收获。收获hTMSCs洗了PBS和4%多聚甲醛固定(Biosesang Inc .);韩国京畿道)24 h。hTMSCs resuspended在100年μL(冰PBS。转染绿色荧光的hTMSCs检测使用FACSCanto二流式细胞分析仪(BD生物科学)与520 nm和570 nm EGFP的带通滤波器。对所有样本,10000事件被收购,和数据分析利用BD FACSDiva软件(BD生物科学)。
2.7。合成Rhod-PEI
监控的插入时间DNA-PEI NPs hTMSCs, Rhod B ITC,红色荧光染料,用于标签裴的伯胺组5%。贝聿铭是溶解在0.1碳酸钠在2毫克/毫升的浓度。50毫升Rhod B ITC的解决方案在干燥DMSO(1毫克/毫升)慢慢地一滴一滴地裴解决方案和搅拌24小时在4°C。24小时后,氯化铵溶液在DW介绍了50 mM的最终浓度猝灭反应。Rhod-PEI是透析使用膜过滤(1000 Da,光谱实验室有限公司;美国CA牧场Dominguez)消除未反应的Rhod B ITC和稀释在DW在同一浓度与正常裴。
2.8。收购时间转染hTMSCs的图像
实时图像的转染hTMSCs DNA-Rhod-PEI被捕和评估,评估的插入时间DNA-Rhod-PEI NPs pEGFP和细胞内表达。hTMSCs被播种细胞/ 2-chamber幻灯片上的密度(热费希尔科学;大岛屿,美国纽约)和孵化24 h。hTMSCs处理5μg / mL赫斯特33342年20分钟解决方案在培养基细胞核染色,然后用无血清MEM -洗α。DNA-Rhod-PEI NPs准备8被添加到hTMSCs N / P。4 h后,NPs删除和添加到转染hTMSCS培养基。表达Rhod-PEI pEGFP,赫斯特33342年hTMSCs在不同时间点监测使用奥林巴斯IX51倒置荧光显微镜(奥林匹斯山;日本东京,Moticam Pro 285 CCD相机)和分析Motic图像高级软件(Motic;厦门,中国)。
2.9。统计分析
统计分析都是通过单向方差分析方差分析与Bonferroni事后测试使用SPSS 12.0软件(SPSS Inc .);美国芝加哥,IL)。
3所示。结果
3.1。表征hTMSCs
hTMSCs,来自内部组织的鼻子,很容易孤立于捐赠组织鼻甲切除术或鼻甲切开术后。hTMSCs的表征,流式细胞术进行评估的特定标记的表达在第五段:CD34(血液细胞抗体)作为负面标记和CD90 CD166 (MSCs-related标记)作为积极的标记。结果,cd34多hTMSCs率为0.4%,表明hTMSCs不是血液细胞。相比之下,超过95%的细胞CD90——CD166-positive(99.9%和98.6%,分别地。),表明hTMSCs MSC-like特性(图1)。此外,按照先前的研究,hTMSCs迅速扩散从通道1到518]。这些属性的hTMSCs建议各领域潜在要求msc和适用性在基因疗法在治疗疾病。
3.2。表征DNA-PEI NPs
基因转移的细胞吸收机制使用裴仍然不明,虽然内吞作用是最强有力的病毒的基因转染机制使用纳米尺度的粒子(图2(一个))。在这项研究中,DNA-PEI NPs准备各种N / P比值从1到16评估复杂的形成和转染效率hTMSCs根据N / P配料比。DNA的络合与裴通过琼脂糖凝胶阻滞实验评估。电泳结果显示DNA迁移完全迟钝的络合与带正电的裴每N / P比值(图2 (b))。粒子大小和电动电势测量DNA-PEI NPs的表征。如图2 (c),DNA的粒度是高于1000海里;然而,在裴,DNA-PEI NPs的粒径明显减少裴浓度的方式。DNA的电动电势−20 mV因为磷酸基的DNA;然而,DNA-PEI NPsζ电位的增加而增加更多的裴。这些结果表明,DNA-PEI NPs浓缩和改变和添加裴带正电的粒子。纳米尺度和带正电的粒子可以使DNA插入hTMSCs通过内吞作用和吸引力。
(一)
(b)
(c)
3.3。细胞毒性DNA-PEI NPs hTMSCs
DNA-PEI NPs的细胞毒性hTMSCs测量使用MTT测定波长590纳米。图3显示的异常hTMSCs在24小时和48小时后治疗DNA-PEI NPs。的细胞毒性DNA-PEI NPs hTMSCs稳步增加按照增加N / P电荷比率。从1到8 N / P, hTMSCs显示显著的毒性与对照组相比,但是他们仍然激增到治疗DNA-PEI NPs后48 h。然而,百分比的可行性hTMSCs低于50%,N / P治疗12在24小时和48小时;16 N / P配料比,hTMSCs在48小时的光密度是类似于在24 h。这个结果表明,DNA-PEI NPs的N / P进料比16是最有毒hTMSCs和抑制细胞生长。
3.4。转染效率,hTMSCs
引入EGFP的质粒进入细胞后,绿色荧光蛋白合成的膜细胞,使基因转染效率的评估通过测量绿色荧光的表达水平。监控转染效率,hTMSCs对待DNA-PEI NPs在1 - 16 N / P电荷比率,和绿色荧光检测荧光显微镜(图4)和流式细胞术(图5)。绿色荧光表达中没有观察到参与hTMSCs,而绿色荧光的DNA-PEI-treated hTMSCs依法加强了N / P的增量费用比率。然而,16 N / P配料比,转染效率是类似于12 N / P配料比,和很难直接比较细胞在其他N / P比值。这些结果表明,高的转染效率较差的裴和DNA-PEI NPs的N / P进料比16 hTMSCs毒性太大了,而细胞的数量减少。这些结果是按照细胞生存能力分析。
3.5。时间转染hTMSCs的图像
评估hTMSCs DNA-PEI插入,裴贴上红色荧光染料罗丹明B ITC,和DNA-Rhod-PEI NPs Rhod-PEI溶液加入到DNA的N / P进料比8(图6)。后立即治疗,我们观察到的阶段和蓝色荧光(核)的图像。在添加DNA-Rhod-PEI NPs后2 h,没有pEGFP的荧光表达,但红色荧光(Rhod-PEI)观察细胞核附近。这证明了DNA-Rhod-PEI NPs附着在膜内hTMSCs 2 h, NPs成为接近于核酸的hTMSCs 5 h。7点Rhod-PEI的红色荧光较弱h相比,在5 h。质粒DNA的绿色荧光表达的核酸hTMSCs h, 9点11 h,中可观察到明显的绿色荧光hTMSCs膜。24小时后,红色荧光稍微离开细胞的细胞核。这些结果表明,DNA-PEI从2 h - 7 h,插入和绿色荧光蛋白合成核酸在9 h与DNA-Rhod-PEI NPs细胞治疗后。24小时后,Rhod-PEI泄露的细胞和留在hTMSCs的细胞质。
4所示。讨论
在这项研究中,使用的基质细胞hTMSCs,从人类分离下鼻甲组织和描述为msc。hTMSCs可以分化成其他类型的成年细胞如软骨细胞,脂肪细胞,成骨细胞(16- - - - - -19,29日]。由于这些特点,hTMSCs一直视为关键资源在疾病的治疗领域的组织工程和再生医学。评估的可行性hTMSCs作为基因治疗的前景的来源,我们进行了基因传递hTMSCs和评价转染效率使用贝聿铭作为病毒的基因载体。
裴已经被用来作为基因载体,因为它包含了许多胺组的主链的化学结构,在溶液中带正电的状态,从而能够转移基因进入细胞,保护DNA的质子海绵效应裴(27]。在我们的工作中,贝聿铭的解决方案添加到DNA后,DNA-PEI NPs的特点进行评估通过各种各样的方法,如在琼脂糖凝胶电泳和测量的粒子大小和电动电势。DNA-PEI NPs下降的粒子大小从1145纳米到140纳米按照增加由于凝结之间DNA和裴裴浓度(26),电动电势从−20 mV增加到30号通过增加带正电的胺组。DNA-PEI NPs形成DNA和纳米粒子之间的静电相互作用[30.,31日]。
我们评估后hTMSCs的细胞毒性和转染效率4 h DNA-PEI NPs的治疗。DNA-PEI NPs的细胞毒性更高的N / P电荷比率高于DNA-PEI NPs N / P电荷比率较低;另一方面,hTMSCs绿色荧光的增强通过引入DNA进入细胞。裴可能显示细胞毒性基因传递(32- - - - - -34),因为它增加了细胞内酸碱破坏的监管机制和去极化的细胞膜(35]。吸收NPs被认为是一个粘附过程;因此,在带正电的NPs的情况下,粒子可以强烈与细胞膜相互作用[36]。先前的研究中观察到,DNA-PEI NPs显示更大的细胞毒性hTMSCs相比其他msc。然而,hTMSCs的转染效率的两倍,观察到与其他msc在先前的研究在相同的实验条件下25,37]。这些结果说明hTMSCs是一个伟大的基因转染的细胞来源。裴,最著名的高分子基因载体,也可以用作hTMSCs基因携带者;然而,裴之前必须解决有效的细胞毒性基因转染可以实现。
监控的吸收时间和细胞内绿色荧光表达转染hTMSCs随着时间的推移,hTMSCs服用DNA-Rhod-PEI NPs的N / P进料比8。在最初的时间点,没有观察到荧光,但几小时后,Rhod-PEI的红色荧光检测到细胞质hTMSCs表面。绿色荧光蛋白表达的核hTMSCs DNA-Rhod-PEI NPs 9 h治疗后,由绿色荧光的colocalization证明核酸的赫斯特染色。在培养时间长,观察EGFP的表达在细胞质和核酸hTMSCs,和Rhod-PEI hTMSCs离原子核分裂的。在先前的研究中,分离后观察DNA-carrier复合物的吸收进细胞的核酸DNA聚合酶在转录(38]。然而,在我们的研究中,DNA转染到hTMSCs,然后Rhod-PEI的红色荧光检测的细胞质hTMSCs DNA-Rhod-PEI NPs的离解。
很少有研究特定基因的转染用慢病毒载体和特定分化的干细胞(39]。在这项工作,虽然,我们所知,我们提供了第一个证据表明DNA-PEI NPs hTMSCs诱导基因转染,正在进一步研究利用BMP-2基因传递到hTMSCs使用病毒基因载体和探讨转染hTMSCs成骨分化。
5。结论
我们评估了DNA引入hTMSCs使用共同的基因载体,裴,确认hTMSCs适用性的基因治疗。DNA-PEI NPs形成在不同的N / P电荷比率由DNA之间的相互作用和裴。更大的细胞毒性的发现转染hTMSCs DNA-PEI NPs与高N / P使用MTT试验费用比率。hTMSCs的转染效率约30%使用贝聿铭作为基因载体在12 N / P。我们的研究结果表明,裴,一般病毒基因载体,适用于基因转染的hTMSCs hTMSCs是基因治疗的潜在资源,因为他们的基因转染效率高于其他msc。通过本研究,我们可以验证hTMSCs有前途的基因转染的细胞来源在体外控制,该系统可以应用特定的蛋白质的表达取决于类型的基因转染。然而,DNA的优化配方和裴可能实现高转染效率低细胞毒性,需要进一步的研究。
利益冲突
作者声明没有经济利益的竞争。
确认
本研究从基础科学研究项目提供资助(2013 r1a2a2a04014200和2014 m3a9e5073700)和优先级研究中心项目(2009 - 0093826)通过韩国国家研究基金会(NRF)由教育部。