文摘

诱导多能干细胞(iPS)细胞生成的异位表达人类体细胞山中四个因素。在这里,我们报告说,生存素,细胞凋亡抑制剂,能增强“诱导多能性”细胞一代从人类神经祖细胞(npc)与一个因素OCT4 (1 f-oct4-survivin)。与1 f-oct4相比,存活素加速重组人类npc的过程。(少量)neurocyte-originated诱导多功能干细胞细胞生成从1 f-oct4-survivin像人类胚胎干细胞(他)细胞在形态、表面标记,全球基因表达分析,表观遗传状态。生存素持续高表达在iPS和ES细胞。过程中少量的细胞向神经细胞分化、存活素的表达是在蛋白质水平迅速下降。从npc存活素促进重组效率的机制可能与稳定β连环蛋白在WNT信号通路。支持这个假说的实验rt - pcr,染色质immune-precipitation,人类胚胎干细胞和免疫印迹。我们的研究结果显示,过度的生存素可以提高重组的效率从npc iPS细胞通过一个因素OCT4稳定的关键分子,β连环蛋白。

1。介绍

重编程体细胞的诱导多能干细胞(iPS)细胞再生药物(为个人带来了福音1]。受伤的人类细胞或组织可以被从人类“诱导多能性”细胞相似的分化细胞(2]。基因组整合转基因的方法会增加肿瘤形成的风险和其他异常问题(3]。Nonintegration人类“诱导多能性”细胞生成使用adenoviral或质粒转染方法(4,5]。已经没有dna其他细胞方法包括仙台病毒(6信使rna蛋白质),直接交付,和修改或微rna的转换7]。在这项研究中,考虑到关键转录因子,SOX2,从内部高度表达在人类神经干细胞(nsc)或祖细胞(npc)重组的过程中8,9),我们应用一个游离向量(10,没有基因组整合方法之一,重组人类npc iPS细胞只有一个因素OCT4 (1 f-oct4)。

人类多能干细胞的自我更新维护(已经)在体外需要支持的生长因子(例如,bFGF)和细胞外基质(ECM)。更好的理解已经被自我更新可以开发中定义的化学物质。媒介是完全定义,定义的化学feeder-free媒介制定人类已经[的增长和扩张11]。对ECM的元素,feeder-free人工基底膜,这是一种凝胶状的蛋白质混合物由老鼠分泌Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)肉瘤细胞,是人类已经被广泛用于培养(12]。这种xeno-proteins起源于鼠标EHS的缺点可能会导致抗原反应时应用“诱导多能性”细胞在人类再生医学(13]。这里我们使用人类起源vitronectin (Xeno-free)而不是人工基底膜作为维护ECM iPS多能性只是为了安全担忧。

有一些报告显示,“诱导多能性”细胞保留其原始组织的表观遗传记忆老鼠和人类iPS细胞(14]。残留甲基化签名链接“诱导多能性”细胞的组织来源,甚至区分髓系和淋巴血液“诱导多能性”细胞的起源15,16]。不完整的DNA甲基化表明转录的记忆体细胞在人类“诱导多能性”细胞,特别是在早期的文章(17]。所有低“诱导多能性”细胞分析保留原始细胞转录的记忆。这种记忆的指纹“诱导多能性”细胞的体细胞来源(16]。“诱导多能性”细胞来源于人类胰岛β细胞分化为胰岛素生产细胞的能力有所增强,与胚胎干细胞相比,同基因的non-beta iPS细胞(14]。所有这些证据表明,“诱导多能性”细胞起源于神经祖细胞雕刻与表观遗传记忆可能受益更容易分化的神经细胞。

生存素是一种重要的IAP(凋亡抑制剂)的家庭成员;它的功能作为不同类型的细胞凋亡抑制剂特别是在癌细胞。生存素表达在正常组织发育调控和被报道低在大多数终末分化组织。但它也表明,生存素也表达了ES细胞和nsc (npc) OCT4、SOX2调节这些细胞的表达。生存素表达积极相关多能性胚胎干细胞或诱导多能干细胞的维护18]。在我们之前的研究中,upregulation存活素可以抑制神经干细胞凋亡由SOX2 [19]。WNT信号通路报道中扮演一个重要的角色在促进体细胞重编程;的机制是β连环蛋白与重组因子KLF4、OCT4、SOX2加强多能性电路基因的表达(20.]。在这里,我们发现,过度的生存素在npc可以提高1 f-oct4重组“诱导多能性”细胞的效率。生存素的机制提高npc重组的效率可以通过稳定与WNT信号通路的关键分子,β连环蛋白。我们发现存活素可以直接相互作用β连环蛋白在胚胎干细胞或诱导多能干细胞的免疫沉淀反应(IP)分析。我们的研究结果表明,稳定的β连环蛋白有利于多能性维护和可以提高编程的效率。

2。材料和方法

2.1。细胞隔离和文化

人类胚胎大脑皮层组织正是从自然流产胎儿的大脑解剖在66年,分别为74和90天。授权使用人工材料和父母的知情同意的伦理委员会批准北京大学健康科学中心的指导方针进行世界医学协会赫尔辛基宣言》(http://www.wma.net/en/30publications/10policies/b3/)。人类胎儿皮质组织用0.25%胰蛋白酶为15分钟,洗杜尔贝科的基本介质(DMEM;美国UT Hyclone实验室,洛根),分离成单个细胞悬液。细胞被播种密度100000细胞/毫升到T75烧瓶血压得到较好的控制包含20毫升的无血清培养基(DMEM: F12)补充B27(2%,生活技术,卡尔斯巴德、钙、美国),EGF (20 ng / mL, Peprotech,落基山,新泽西,美国),FGF2 (20 ng / mL, Peprotech,落基山,新泽西,美国),和肝素(5μg / mL,σ,圣路易斯,密苏里州,美国)。npc之前被截断的方法通过描述(21]。感染前的一天,npc被消化成单细胞Accutase(σ,圣路易斯,密苏里州,美国),和100000个细胞被播种poly-ornithine-coated six-well板块形成单层培养。

2.2。游离向量对细胞电穿孔

游离向量(EBNA-1)是一个很好的描述系统生产transgene-free,传染iPS细胞(10]。游离向量包含pCXLE-OCT4 (1 f-oct4)被引入人类人大通过电穿孔(Amaxa Nucleofector 2 b, LabWrench,加拿大)在0天。转染细胞被镀到vitronectin-coated文化菜肴。我们使用Reproeasy化学定义媒介(Cellapy,北京)培养1 f-oct转染细胞从第一天到第14天。媒介改变PSCeasy化学介质(Cellapy,北京)定义从15天vitronectin-coated文化船只,使用0.5毫米EDTA作为使试剂,根据制造商的指示。生存素可拆卸的shrna (CCAGTGTTTCTTCTGCTTCAA)被克隆到腺病毒穿梭载体pDC316-EGFP U6启动子和完整的存活素cDNA克隆成pDC316-EGFP向量。重组腺病毒生成使用AdMax系统(MicrobixBiosystems)。腺病毒是纯化使用ViraBindTM腺病毒净化设备(细胞生物学实验室)。莫伊的npc被感染(感染复数)60。

2.3。免疫荧光和免疫化学

细胞生长在封面幻灯片和4%多聚甲醛固定。以下SOX2抗体,NANOG,巢蛋白,SSEA-4 TRA-1-60,交易- 1 - 81都是购自Chemicon(泰梅库拉、钙、美国)和anti-OCT4来自圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯、钙、美国)。兔多克隆抗体的生存素是细胞信号技术,Inc .(中国)β从Sigma-Aldrich连环蛋白抗体(圣路易斯,密苏里州,美国)。第二抗体(Alexa萤石系列)表达载体(美国纽约大岛)。细胞AP活性分析的碱性磷酸酶蓝膜衬底解决方案工具包(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),根据制造商的指导方针。

2.4。基因表达谱和甲基化分析

全球基因表达分析是由Affymetrix人类U133 + 2.0微阵列(美国Affymetrix,圣克拉拉,CA)。转录组分析,5μ克总RNA作为输入用于标记cRNA合成后,制造商的指令(溶:12小时)。Quality-checked cRNA样本杂化生物的16个小时到人类U133 + 2.0 - 3′微阵列表达。所有的步骤包括洗涤、染色和扫描信号遵循制造商的建议。微阵列数据分析了Affymetrix表达式控制台软件1.3(美国Affymetrix,圣克拉拉,CA)。MvA情节的分析被用来比较两个微阵列(细胞)的身份。还利用皮尔森相关的方法(R²)值来表示相似。层次聚类分析进行了使用集群3.0 ([22),所更新的米歇尔•德•胡恩)和Treeview软件使用mean-centered皮尔逊相关性和完整的链接。DNA甲基化分析OCT4 NANOG是描述为弗雷伯格et al。23]。

2.5。荧光素酶活性测定

的生存素启动子被从人类基因组DNA, PCR扩增消化XhoI和HindIII,然后结扎成记者向量pGL3-Basic(美国Promega)。生存素启动子的引物PCR向前,5′AGCTCGGCGGGGTGGGAGGGGTGGGGAG3′,和反向5′AGCTTAGTAGAGGCGGGGCGGCGCG3′。HEK 293细胞被播种24-well板和瞬变转染存活素启动子记者向量和SOX2 OCT4表达质粒使用Lipofectamine 2000(美国表达载体)。pRL-CMV(美国Promega) Renilla表达荧光素酶转染作为内部控制。48小时后,转染HEK293细胞细胞溶解在被动裂解缓冲和荧光素酶活性测定dual-luciferase记者分析系统(美国Promega)使用Centro LB960 96孔光度计(德国)Berthold技术。

2.6。染色质免疫沉淀反应(芯片)和免疫印迹分析

生成染色质,约1×10⁷感染胚胎干细胞或诱导多能干细胞收集和固定聚甲醛为1%。甲醛灭活了125毫米的加入甘氨酸。细胞溶解产物是由孵化的细胞裂解缓冲(50 mM Tris-HCl, pH值8.0,150毫米氯化钠,0.5% NP40) 20分钟在4°C。染色质包含基因组DNA裂解缓冲被声波降解法支离破碎的范围150 - 500个基点。然后事先批准支离破碎的染色质蛋白A和G琼脂糖珠感兴趣的抗体和免疫沉淀反应和琼脂糖珠。然后清洗材料,筛选了纯化PCR试剂盒净化设备。分析的样品然后qPCR。芯片分析进行如前所述[8]。PCR, 1μL使用DNA的提取和放大为21 - 25日周期。生存素的近端启动子的引物,5′GACGCCCTGCTTTGCGAAGG3′,和反向5′CTTCTGGAGTCAGGGGCCAGGG3′。NANOG子的引物,5′GCTGGTTTCAAACTCCTGACTTC3′,和反向5′CAACAGAACCTGAAGACAAAC3′。引物的β肌动蛋白启动子向前,5′AGAAAATCTGGCACCACACC3′,和反向5′CGAGCCATAAAAGGCAACTTTCGGA3′。

RT-qPCR反应是建立在一式三份SYBR预混料试验(豆类、日本)。反应是Stratagene 3000 p实时PCR机器上运行(美国Stratagene) 40周期30年代在95°C, 30年代在58°C,和30年代在72°C (24]。

西方墨点法,细胞细胞溶解冰冷的裂解缓冲和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(19]。等量的蛋白质提取(50 - 80μg)解决了SDS /页面(凝胶10%)电泳;然后凝胶转移至0.2μm PVDF膜。阻塞后5%的脱脂牛奶1 h,细胞膜被孵化主要抗体在一夜之间在4°C。使用的抗体是兔多克隆anti-SOX2 anti-Survivin,和鼠标单克隆抗-β肌动蛋白。细胞膜与PBST缓冲洗3次。在孵化后荧光标记二次抗体(美国罗克兰)1 h在室温下,膜上的图像与奥德赛西方墨点法系统开发(美国LI-COR生物)。

2.7。逆转录聚合酶链反应(rt - PCR)

RNA提取使用RNeasy +迷你包(试剂盒、德国)按照制造商的指示。为反向transcription-quantitative PCR (RT-qPCR) SYBR预混料试验(豆类、日本)被用来执行实时PCR MX3000P。下面的热剖面是用于所有PCR实验:95°C 5分钟;40周期为30年代在95°C;30年代退火温度58-60°C;和终止,最终扩展10分钟的72°C。

引物用于rt - pcr SOX2了5′GCCGAGTGGAAACTTTTGTCG3′,相反,5′GGCAGCGTGTACTTATCCTTCT′3,和生存素,5′AGGACCACCGCATCTCTACAT3′,和反向5′AAGTCTGGCTCGTTCTCAGTG3′。

2.8。ES (iPS)细胞分化与维甲酸(RA)

ES或“诱导多能性”细胞分离和分离成单个细胞与0.5毫米EDTA然后镀在细菌学上的菜在10毫升a-MEM (Gibco)补充10%的边后卫,碳酸氢钠(3毫米),0.1毫米我(EB介质)的密度5×10⁴细胞/毫升。2天,视黄酸(美国圣路易斯Sigma-Aldrich) 500海里被添加到培养基和维护96 h (25]。每24小时收集的细胞进行进一步分析。

3所示。结果

3.1。人类与1 f-oct4 npc的重组过程

首先,我们人类与immunofluorescent染色npc的识别标记。培育人类npc与抗体染色SOX2和巢蛋白,关键转录因子和表面标记,immunofluorescent分析。这是观察到,从内部SOX2和巢蛋白表达在大多数人类的npc(图1)。然后,我们通过电穿孔转染人类1 f-oct4 npc。转染后三天,这些细胞被镀在1×10左右⁵细胞每在35毫米盘与vitronectin预镀。相差显微镜下可以看到,细胞集落才出现在转染后15天(图1 (b))。在接下来的几天,典型的殖民地,平坦的和紧凑的,像人类ES细胞在形态(图2 (b))。我们称这些殖民地损害细胞。通常情况下,100 - 200 1 f-oct4殖民地可以产生1×10⁵npc(重编程效率:0.1 -0.2%)。

3.2。少量的细胞的多能的识别标记

这些少量的细胞可以通过EDTA和表现出积极的特性通过碱性磷酸酶(美联社)染色(数字2(一个),2 (b),2 (c))。免疫荧光染色证实人类损害细胞从1 f-oct4转染广泛表达人类多能细胞标记,包括碱性磷酸酶、OCT4、SOX2, NANOG SSEA4 TRA-1-60,交易——1 - 81(图2 (d))。这些结果表明,人类“诱导多能性”细胞可以产生人类npc OCT4单独一个因素。

3.3。基因表达分析、DNA甲基化和分化在活的有机体内

全球基因表达分析的npc,捏,他细胞是由人类U133 Affymetrix + 2.0微阵列。比较两个微阵列是由控制台软件1.3 Affymetrix表达式。我们使用MvA情节比较表达分析少量的人大和捏他细胞。皮尔森相关(R²)的损害和NPC细胞和少量的酒,他是0.87和0.97,分别。结果显示表达式的少量的细胞更类似于他的npc(图3(一个))。ESCs的层次聚类分析对人类npc,,和少量的细胞显示了相似的结果(见补充图S1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/4729535)。作证重新编程细胞表观遗传状态,我们使用亚硫酸氢盐测序分析来确定OCT4 DNA甲基化的程度,NANOG发起人(图3 (b))。类似于人类胚胎干细胞H1,启动子区域都是脱甲基1 f-oct4人类损害细胞相对于培养人类nsc或npc。我们的结果显示一个转录因子、OCT4重组人类nsc iPS细胞,非常类似于人类ES细胞在两个基因的启动子。

冻伤的多能性细胞也是考验在活的有机体内。八周后注射1×10⁶SCID小鼠的睾丸损害细胞,肿瘤质量被疣状分离和分析。如图3 (c)神经组织,肿瘤组织中(外胚层,左面板),软骨(中胚层,中间面板),和gut-like上皮(内胚层,右面板)。这些结果表明畸胎瘤损害细胞的特点,揭示了这些细胞的多能性。

3.4。生存素表达与重组的效率

生存素是一个重要因素,ES细胞多能性相关的维护;我们检查生存素在ES细胞分化和重组表达方式。我们评估的影响1 f-oct4感染NPC与高水平或低水平的生存素在人大重组的过程。在感染后12 - 15天,大多数碱性phosphatase-positive (AP +)殖民地出现在群3.5厘米直径与生存素超表达组相比,控制或模拟向量。殖民地的数量的生存素超表达双重组相比1 f-oct4控制和模拟矢量,)(图4(一))。相反,低存活素表达(大约减少70%)RNAi导致一半AP +殖民地形成1 f-oct4控制或nonsilence(相比,)(图4 (b))。mRNA水平相对生存素超表达组约3.5倍相比,控制和模拟组(图4 (c))。RNAi当生存素被抑制的mRNA水平相对降低3倍比控制和nonsilence组(图4 (d))。这些研究表明,沉默的生存素降低了“诱导多能性”细胞生成和表达的自我监管机构生存素细胞重新编程是绝对有必要的。

3.5。SOX2和OCT4协同调节生存素的表达

我们建造生存素启动子序列,然后测量存活素转录活动HEK 293个细胞在添加OCT4和SOX2荧光素酶质粒的检测。结果表明生存素启动子驱动荧光素酶表达正受OCT4 SOX2。这两个转录因子有协同效应在生存素的调节在体外(图5(一个))。找出如何存活素参与ES或iPS细胞多能性维护和重新编程,我们做了染色质免疫沉淀反应在ES细胞(芯片)。ChIP-qPCR进行了分析使用SOX2和OCT4抗体和特定的引物促进NANOG,生存素(Birc5),和β肌动蛋白基因。结果显示一个更高层次的浓缩NANOG启动子作为积极控制和生存素(Birc5)启动子在ES细胞。然而,启动子β肌动蛋白(负控制)没有浓缩(图5 (b))。芯片分析揭示了SOX2的入住率和OCT4生存素的推动者。这个结果表明SOX2 OCT4可以调节存活素通过绑定到其启动子表现为协同作用。

3.6。生存素通过调节控制多能性β连环蛋白蛋白质稳定性

已经表明,激活规范WNT通路足以维持自我更新的他和mES细胞(26]。在重编程找出生存素的作用,我们在人类ES细胞与生存素免疫沉淀反应。Coimmunoprecipitation (Co-IP)分析显示β连环蛋白可以通过生存素拉(图6(一))。这证明了生存素可以直接相互作用β连环蛋白,这也是与ES细胞多能性和重组。如果生存素表达减少成分的表达β连环蛋白也表达下调(图6 (b))。这些结果表明击倒的生存素导致的减少β连环蛋白。

3.7。生存素表达的过程中减少神经人类胚胎干细胞的分化

在血清文化中,维甲酸(RA)诱导有效的神经分化的ESCs[至关重要27]。ESC分化的过程中,存活素大幅下调后24小时治疗类风湿性关节炎的免疫印迹分析。然后它维护媒介表达分化的神经细胞(图7(一))。多能性基因,如OCT4、SOX2在神经分化显著减少(图7(一))。然而,生存素在mRNA水平逐渐减少与RA的治疗时间延长RT-qPCR(图7 (b))。RT-qPCR和免疫印迹分析显示生存素表达减少的过程中胚胎干细胞分化为神经细胞。这个结果表明生存素是另一个因素相对于维护人类多能干细胞的多能性。

4所示。讨论

体细胞重编程能力的发展中具有巨大应用潜力个性化治疗疾病和药物筛选[3,6]。这里我们提出,人类“诱导多能性”细胞重新编程OCT4由单一因素,从神经祖细胞或干细胞与游离向量。人类“诱导多能性”细胞重新编程通过OCT4培养这个系统似乎是类似于人类ES细胞在形态、表面标记和分化的能力三个胚胎胚芽层(10]。制定和feeder-free媒介优势NSC重组和重复实验。游离向量可以通过培养他们随后从细胞(细胞游离向量的逐渐丧失增殖细胞)。代的iPS细胞神经退化疗法(作为一个伟大的来源28]。Reproeasy PSCeasy介质,设计开发了Cellapy生物技术公司,是完整的媒介,化学公式定义为feeder-free重组设计,维护和扩张的人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞。这种培养系统,定义材料媒介、feeder-free, Xeno-free ECM来维持人类“诱导多能性”细胞具有较高的临床应用安全。

我们的研究结果表明,生存素的因素参与ES或iPS细胞多能性维护。我们还发现过度的生存素在npc可以提高1 f-oct4重组“诱导多能性”细胞的效率。生存素的机制来维持多能ESCs能相互作用的状态β连环蛋白在WNT信号通路。WNT信号和β连环蛋白也报道相对于ESC的多能性和“诱导多能性”细胞的重编程(20.,29日]。WNT3a-conditioned媒体推动重组小鼠胚胎成纤维细胞(MEF) [30.]。其他团体提出的证据也支持我们的观察:核β连环蛋白细胞重编程过程中细胞凋亡的保护。基于这些结果,他们建议WNT /β连环蛋白/ CBP信号含铅重编程效率的改善(31日]。因此,稳定β连环蛋白由生存素有助于维持多能状态ES iPS细胞。其他研究显示ubiquitin-proteasome通路阻塞ESC分化的抑制和增强细胞重新编程通过稳定的原癌基因(32]。所以另一种可能性,研究抑制ubiquitin-proteasome系统可能会稳定β连环蛋白的蛋白质。在这里,我们显示生存素与之交互β连环蛋白在ES细胞,机制可能是由于生存素——这一事实β连环蛋白相互作用可以防止β连环蛋白降解。

“诱导多能性”细胞的分化能力formulated-ingredient-medium神经细胞没有影响。诱导多能干细胞在医学应用程序的关键取决于是否有完善的微分系统生成神经细胞类型(15]。“诱导多能性”细胞表现出多样化的属性在不同的细胞文化系统。定义材料媒介的文化体系,feeder-free, Xeno-free ECM iPS细胞重编程过程中可以减少批差异。细胞来源的研究表明,父母的细胞可能会影响合成“诱导多能性”细胞的分化能力(33]。有一些报告显示“诱导多能性”细胞来源于nonhematopoietic细胞(神经祖细胞和成纤维细胞)保留残留甲基化(34- - - - - -36]。一些证据显示,“诱导多能性”细胞保留残余转录记忆的体细胞和提供数据支持效率低下的启动子DNA甲基化的底层机制(14,17]。这样的记忆将会“诱导多能性”细胞的体细胞的指纹。这些最初的记忆可以帮助人类NSC的iPS细胞更加容易和高效分化的神经细胞与人类相比fibroblast-originated“诱导多能性”细胞。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

时新周、刘忆南向和Ruopeng冯同样导致了这项工作。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金(31301212,31301212,31301212,81570215,21233003)。

补充材料