文摘

目的。比较多种间充质干细胞的影响,那些从人类分离脱落乳牙(棚),牙髓干细胞(DPSCs)和牙科毛囊干细胞(DFSCs),对人体外周血单核细胞(PBMCs)。方法。间充质干细胞分离orofacial地区的三个来源。鉴定和PCR分析。从健康的外周静脉血淋巴细胞分离。淋巴细胞和干细胞cocultured的存在和缺乏干扰素-γ和刺激anti-CD2、anti-CD3 anti-CD28 3天。然后,淋巴细胞增殖,CD4细胞的数量⁺FoxP3⁺T调节细胞和Fas的水平/ Fas配体,il - 4、il - 10,和干扰素-γ在文化浮在表面的测量。结果。DFSCs表现出增强的分化能力和增加CD4的数量⁺FoxP3⁺T淋巴细胞的增殖和凋亡抑制PBMCs与棚屋和DPSCs相比。增加干扰素-γ增强DFSCs扩散。此外,DFSCs抑制il - 4和干扰素-γ细胞因子水平和增强il - 10水平与其他细胞来源。结论。这些结果表明,干扰素-γ刺激DFSCs通过诱导免疫调节影响健康的捐赠者PBMCs而抑制细胞凋亡和增殖,增加CD4的数量⁺FoxP3⁺细胞。

1。介绍

干细胞具有自我更新能力并能分化成各种类型的细胞在体内。因此,他们诱导组织和器官的修复和再生,使干细胞细胞疗法和再生医学的理想来源。干细胞主要分为两组:胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞具有多能性特征和最能分化成胚胎层(1]。由于伦理问题围绕胚胎干细胞的使用,最近的研究关注adult-derived干细胞。

间充质干细胞(msc)有多种能力的成体干细胞。MSC人口已从各种来源孤立,比如脐带血(2,3),沃顿商学院的果冻4),胎盘(5,6),骨髓(7,牙齿8,脂肪组织(9,10]。

msc是牙科组织的有前途的来源,这是方便的,可以从许多来源的分离orofacial地区,如干细胞从人类分离脱落乳牙(物流)8(DPSCs)[],牙髓干细胞11毛囊干细胞(DFSCs)[],牙科12),和牙周韧带干细胞(PDLSCs) [13]。这些msc(棚,DPSCs和DFSCs)可以分化为成骨细胞,脂肪细胞,软骨细胞在合适的条件下。这些细胞也表达MSC-specific标记,如CD29、CD73, CD90、CD105,和CD166和造血标记是负面的,包括CD14、CD45、CD34、CD25和CD28 [8,11- - - - - -13]。

免疫系统是一个主要的防御机制,提供了防止外来物质和产生各种细胞和分子识别和消除巨大的各种可能的外国材料。第一个保护屏障对微生物是自然(固有)免疫反应(14]。调节性T细胞(Treg)发挥重要作用在控制免疫反应的过敏原,自身抗原肿瘤抗原和传染性病原体。这些细胞表达的转录因子叉头框P3(具体)15,16]。

最近的研究对msc报道其对淋巴细胞增殖抑制作用(17,18]。适应性免疫反应后,开发针对特定病原体。msc免疫抑制和免疫调节作用,是很有前途的治疗自身免疫性疾病。msc抑制mitogen-stimulated内存和幼稚T细胞反应。msc的抑制效应,增加T细胞生存能力和减少相关的细胞凋亡(19]。

报告的大多数研究T细胞间质stem-immunosuppressive细胞相互作用。T细胞是主要的适应性免疫系统的细胞效应器,在细胞免疫发挥着基础性的作用。一些报告表明,msc的抗炎和免疫调节作用与抑制T细胞增殖和细胞因子的生产效应T细胞的子集。

msc影响各类辅助细胞亚型(Th1、Th2和Th17细胞)和Treg细胞通过各种机制。通过辅助1型人类msc下调移行细胞表达,表达上调interleukin-4通过辅助2型细胞,增加Treg细胞的比例,并导致从促炎环境转向抗炎的环境。msc的调解机制抑制效应尚未明确定义(20.]。信息联络和可溶性因素被认为产生抑制效应。脱落细胞被发现有重大影响Th17细胞抑制与骨髓间充质干细胞(BMMSCs) [21]。

在这项研究中,我们调查了的免疫调节作用,DPSCs, DFSCs外周血单核细胞(PBMCs)健康的捐赠者。因此,coculturing棚屋,DPSCs DFSCs PBMCs,静脉血液样本中分离的影响免疫系统细胞,表明干细胞的机制发挥主要作用的免疫系统。

2。材料和方法

2.1。隔离的干细胞

牙髓(DP),牙科卵泡(DF)和脱落细胞收集马尔马拉大学牙科学院口腔颌面外科。所有病人的合法委托提供知情同意的伦理委员会的指导方针马尔马拉大学医学院在伊斯坦布尔,土耳其(09.2014.0015/70737436-050.06.04)。牙齿得到从3从8到15岁儿童和3成人捐助者20 - 25岁接受third-molar提取、收集和健康的人类third-molar毛囊从3岁健康的牙齿的牙芽20 - 25年。这些纸浆和毛囊运输杜尔贝科的磷酸盐(DPBS Gibco,大岛屿,14072年纽约,美国)含1%青霉素和链霉素(美国Gibco)。所有实验室工作是在实验室进行的儿科过敏,负责人马尔马拉大学研究医院。

牙科在无菌条件下纸浆和毛囊被孤立。纸浆和毛囊具有处理3毫克/毫升胶原酶I型(美国Gibco) 45分钟37°C到完全消化纸浆和毛囊组织。然后,3毫升的杜尔贝科修改鹰的介质(美国Gibco DMEM)补充10%胎牛血清(美国Gibco的边后卫)和1%添加青霉素和链霉素是为了消化纸浆和毛囊组织在1200转离心5分钟紧随其后。细胞得到了球,浮在表面的吸气。DPSCs棚屋,DFSCs被种植在T-25玻璃瓶有限公司5%₂气氛下37°C在DMEM培养基组成,10%的边后卫,1%青霉素和链霉素。提供的干细胞与DPBS洗和新鲜培养基。培养基是改变每3到4天,直到细胞达到融合。细胞分离与0.25% trypsin-EDTA(美国Gibco)时达到70 - 80%的融合。贴壁细胞培养3通道的特点和分析了特定的表面标记。细胞分析和分化进行了使用流式细胞仪。

2.2。流式细胞术分析

分析细胞表面抗原表达,细胞从第三段。棚,DFSCs DPSCs孵化了抗体对人类CD73藻红蛋白(PE), CD90 PE、CD146异硫氰酸荧光素(FITC)、CD29 allophycocyanin (APC), CD105 PE、CD45 FITC, CD34 PE、CD14 PE、CD25 APC, CD28 PE (BD生物科学、圣地亚哥、钙、美国)在黑暗中在室温下。控制抗体phycoerythrin-conjugated或荧光素isothiocyanate-conjugated allophycocyanin-conjugated鼠标IgG1和老鼠免疫球蛋白₂(BD生物科学、圣地亚哥、钙、美国)。流式细胞术结果使用BD流式细胞仪分析了石中剑。

2.3。干细胞的分化

诱导成骨的(MesenCult,干细胞技术、北美),脂肪形成的,和人类MSC chondrogenic分化功能识别工具包(美国大岛屿Gibco)使用。分化的细胞被镀在6-well板块(5×10⁴cell /),分化培养基制备根据制造商的指示和改变了每周3次。14天之后,脂肪细胞和软骨细胞沾油红O和阿尔新蓝,分别在28天之后,骨细胞与茜素红染色。

2.4。实时聚合酶链反应分析

总RNA分离出10×10⁶棚屋,DPSCs DFSCs通道3使用高纯RNA隔离设备(罗氏,曼海姆,德国)根据制造商的指示。一微克总RNA转化为互补使用transcriptor合成第一链cDNA工具包(罗氏,曼海姆,德国)。等量的cDNA被用于目标基因的实时放大根据制造商的建议使用LightCycler 480实时PCR系统(罗氏诊断,曼海姆,德国)。msc的特殊标记的基因表达,包括ALPL RUNX2, NANOG,巢蛋白,,和DSPP量化相对于管家GAPDH基因。rt - pcr条件如下:预培养10分钟95°C 1周期;放大10秒钟在95°C, 60°C 30秒,72°C, 1秒45周期;在40°C和冷却10秒钟1周期。反应混合物缺乏cDNA被用作在每次运行负控制。实时PCR结果分析使用LightCycler软件(版本2)。

2.5。淋巴细胞分离

外周血获得了来自10个健康献血者年龄在20至25年,加入肝素管。所有病人的合法委托提供知情同意根据指南的马尔马拉大学医学院伦理委员会在伊斯坦布尔,土耳其。通过Ficoll-Paque PBMCs得到(通用电气医疗集团生物科技)密度梯度肝素化外周血样本,如前所述[22]。细胞培养的RPMI(美国Gibco)补充青霉素、链霉素的边后卫10%和1%。PBMCs刺激了5μL anti-CD2 (0.5μ圣地亚哥g / mL, eBioscience CA) / anti-CD3 (0.5μ美国g / mL,寿命生物科学)/ anti-CD28 (0.5μ加州g / mL,微孔)(CDmix) 37°C在湿润的气氛中含5%股份有限公司₂72 h。

2.6。人类PBMCs Coculture棚屋,DPSCs, DFSCs

棚屋,DPSCs DFSCs (5×10⁴/在48-well板)镀前48小时增加十倍数量的淋巴细胞在培养基中。棚屋,DPSCs DFSCs,淋巴细胞(1:10)cocultured 3天。文化是刺激使用5μL CDmix和刺激的,没有5μL干扰素-γ(5μg / mL,微孔、钙、美国)。然后,淋巴细胞增殖(carboxyfluorescein succinimidyl酯,CFSE), CD4细胞凋亡(Fas / Fas配体)⁺FoxP3⁺Treg细胞表达通过流式细胞术和细胞因子表达进行了分析。

2.7。CFSE检测淋巴细胞增殖

coculturing 3天之后,淋巴细胞的细胞增殖行为量化使用carboxyfluorescein succinimidyl酯(CFSE)(美国大岛表达载体)。细胞用CFSE标记,10μm CFSE染料用于染色coculturing后的淋巴细胞。淋巴细胞在体外刺激的没有了,DPSCs, DFSCs,通过流式细胞仪检测CFSE稀释。

2.8。检测细胞凋亡的淋巴细胞Fas / Fas配体标签

coculturing 3天之后,淋巴细胞的凋亡率量化使用Fas / Fas配体工具包(美国BD生物科学),根据制造商的指示。这个工具包包括CD95-FITC CD178-biotin IgG1κ同形像统计图control-biotin, PE链霉亲和素。

2.9。CD4⁺FoxP3⁺Treg细胞评估

coculturing 3天后,Treg淋巴细胞细胞被量化使用一组人类FoxP3缓冲区(美国BD生物科学)。我们确定Treg (CD4的百分比⁺FoxP3⁺从淋巴细胞)标记了。文化评估通过流式细胞术使用人类FoxP3缓冲设备根据制造商的指示。工具包包括缓冲,又反CD4和反FoxP3 PE(美国BD生物科学)。

2.10。细胞因子的表达谱分析

coculture 3天之后,上层的百分比的il - 10、il - 4, IFN -γ被测量。通过流式细胞仪分析了细胞因子使用BD仪珠阵列(CBA)人类Th1 / Th2 Th17工具包(美国BD生物科学)根据制造商的指示。

2.11。统计分析

组之间的差异进行了分析通过单向方差分析测试使用SPSS v20(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)和GraphPad棱镜6软件。图生成使用GraphPad棱镜。值小于0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。分离、鉴定、分化和实时PCR分析棚屋,DPSCs, DFSCs

棚屋,DPSCs DFSCs稀疏附加到培养瓶,展出呈纺锤状在孵化的早期形态。的棚屋在大约3天开始增殖,逐渐形成小殖民地(图1(一))。棚屋达到70% confluency主要文化镀后7天在第一通道(P1)。大部分的棚屋展出呈形态在以后的章节(P1, P2, P3;数据1 (b)- - - - - -1 (d))。DPSCs开始增殖在大约4 - 5天,逐渐形成小殖民地(图1 (e))。confluency DPSCs达到70%的主要文化镀后9天在第一通道(P1)。大多数DPSCs展出呈形态在以后的章节(P1, P2, P3;数据1 (f)- - - - - -1 (h))。DFSCs开始增殖在大约2天,逐渐形成小殖民地(图1(一))。confluency DFSCs达到70%的主要文化5 - 6天后被镀在他们的第一个段落(P1)。大多数DFSCs展出呈形态在以后的章节(P1, P2, P3;数据1 (j)- - - - - -1(左))。然后,immunophenotyping和分化的三个细胞通道被观察到。

的棚屋,DPSCs DFSCs通过流式细胞术分析。这些细胞表现出积极染色CD29、CD73 CD90、CD105, CD14和CD146但负面,CD25, CD28、CD34、CD45(数字2(一个)- - - - - -2 (c))。

的棚屋,DPSCs DFSCs分化为骨细胞,脂肪细胞,软骨细胞。首先,成骨分化能力研究体外成骨诱导twenty-eight-day文化时期的媒介。的棚屋,DPSCs DFSCs与茜素红染色,和骨骼钙化结节形成的细胞结构(数据3(一个),3 (d),3 (g))。接下来,体外培养细胞脂肪形成的分化能力评估的脂肪形成的诱导培养基和油红o染色观察细胞内脂滴在这些细胞(数字3 (b),3 (e),3 (h))。最后,chondrogenic分化能力是一个情景调查期间体外14天文化时期chondrogenic感应介质,和细胞分化成软骨细胞与阿尔新蓝染色证实。细胞内蛋白聚糖观察这些细胞(数字3 (c),3 (f),3(我))。

我们分析了特定的基因表达标记在棚屋,DPSCs, DFSCs,包括碱性磷酸酶(ALP)、runt-related转录因子2 (RUNX2), NANOG,巢蛋白,,和牙质sialophosphoprotein (DSPP)相对于管家基因,3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。棚屋,DPSCs, DFSCs表示ALPL RUNX2, NANOG,巢蛋白,切口,DSPP基因。更高水平的所有基因表达的DFSCs相比棚屋和DPSCs(数字4(一)- - - - - -4 (c))。

3.2。DFSCs抑制淋巴细胞增殖比脱落细胞和DPSCs

淋巴细胞增殖是通过流式细胞术量化。CFSE标记分析,淋巴细胞增殖抑制在第三天。刺激淋巴细胞的增殖与CDmix显著增加相比,如果淋巴细胞()。淋巴细胞的增殖与CDmix刺激的存在和缺乏干扰素-γ是抑制淋巴细胞与棚cocultured细胞时,虽然结果不显著()。刺激淋巴细胞的增殖与CDmix抑制淋巴细胞与DPSCs cocultured时,虽然结果不显著()。然而,刺激淋巴细胞的增殖与CDmix干扰素-的存在γ显著抑制()。刺激淋巴细胞的增殖与CDmix干扰素-的存在γ显著抑制()与淋巴细胞的增殖没有干扰素-γ。刺激淋巴细胞的增殖与CDmix显著抑制淋巴细胞与DFSCs cocultured ()。此外,淋巴细胞的增殖与CDmix刺激干扰素-的存在γ显著抑制(),淋巴细胞明显的增殖抑制(当刺激与CDmix干扰素-的存在γ相比之下,在缺乏IFN -γ(数据5(一个)和5 (b))。

3.3。DFSCs抑制凋亡的影响比脱落细胞和DPSCs

Fas / Fas配体淋巴细胞通过流式细胞术量化的利率。棚屋的抑制作用,DPSCs, DFSCs Fas (CD95)的淋巴细胞是很有意义的。CD95 (Fas)率的淋巴细胞刺激CDmix显著增加(相比之下,如果淋巴细胞。CD95 (Fas)率的淋巴细胞刺激CDmix显著抑制淋巴细胞时cocultured脱落细胞()。此外,Fas (CD95)的淋巴细胞刺激与CDmix干扰素-的存在γ显著抑制()。CD95 (Fas)率的淋巴细胞刺激CDmix显著抑制淋巴细胞时cocultured DPSCs ()。此外,Fas (CD95)的淋巴细胞刺激与CDmix干扰素-的存在γ显著抑制()。CD95 (Fas)率的淋巴细胞刺激CDmix显著抑制淋巴细胞时cocultured DFSCs ()。最后,Fas (CD95)的淋巴细胞刺激与CDmix干扰素-的存在γ显著抑制(;数据6(一)和6 (b))。

棚屋的抑制效果,DPSCs DFSCs Fas的配体(CD178)的淋巴细胞是很有意义的。Fas配体(CD178)率的淋巴细胞刺激CDmix显著增加(相比之下,如果淋巴细胞。Fas配体(CD178)率的淋巴细胞刺激CDmix显著抑制淋巴细胞时cocultured脱落细胞()。此外,Fas配体(CD178)的淋巴细胞刺激与CDmix干扰素-的存在γ显著抑制()。Fas配体(CD178)率的淋巴细胞刺激CDmix显著抑制淋巴细胞时cocultured DPSCs ()。此外,Fas配体(CD178)的淋巴细胞刺激与CDmix干扰素-的存在γ显著抑制()。Fas配体(CD178)率的淋巴细胞刺激CDmix显著抑制淋巴细胞时cocultured DFSCs ()。此外,Fas配体(CD178)的淋巴细胞刺激与CDmix干扰素-的存在γ显著抑制(;数据7(一)和7 (b))。

3.4。的影响了,DPSCs DFSCs CD4细胞⁺FoxP3⁺Treg细胞淋巴细胞的扩张

我们研究了的影响,DPSCs, DFSCs Treg频率。CD4⁺FoxP3⁺Treg细胞被刺激淋巴细胞显著诱导CDmix相比之下,如果淋巴细胞()。CD4⁺FoxP3⁺Treg细胞明显诱导刺激与CDmix干扰素-的存在γ淋巴细胞cocultured脱落细胞()。CD4⁺FoxP3⁺与CDmix Treg细胞明显诱导刺激干扰素-的存在γ淋巴细胞与DPSCs cocultured ()。CD4⁺FoxP3⁺Treg细胞显著诱导淋巴细胞刺激与CDmix cocultured时DFSCs ()。此外,CD4细胞⁺FoxP3⁺Treg细胞明显诱导刺激与CDmix干扰素-的存在γ淋巴细胞与DFSCs cocultured时(;数据8(一个)和8 (b))。

3.5。的影响了,DPSCs DFSCs il - 10、il - 4,和干扰素-γ细胞因子表达的淋巴细胞

il - 10的表达水平、il - 4和干扰素-γ通过流式细胞仪测定。il - 10是显著诱导淋巴细胞刺激时CDmix cocultured DFSCs ()和物流()。此外,il - 10是显著诱导淋巴细胞刺激时CDmix cocultured DPSCs (与CDmix)和干扰素-的存在γ当淋巴细胞与DPSCs cocultured (;图9(一个))。

il - 4是显著抑制淋巴细胞刺激时CDmix cocultured DFSCs, DPSCs和棚屋()。此外,il - 4时显著地抑制刺激的CDmix干扰素-的存在γ当淋巴细胞与DFSCs cocultured DPSCs和棚屋(;图9 (b))。

干扰素-γ显著抑制淋巴细胞刺激与CDmix cocultured时用了()。干扰素-γ显著抑制刺激时存在的CDmix IFN -γ当淋巴细胞与DFSCs cocultured DPSCs (;图9 (c))。

4所示。讨论

在这项研究中,免疫的影响、DPSCs, DFSCs评价体外。msc于1968年首次被Friedenstein [7,定义msc的最低标准是由国际社会细胞疗法。因此,msc必须附着在标准培养条件和塑料表面必须表达CD105, CD73, CD90、CD45的表达,而CD34, CD14,和CD11b必须缺席,msc必须能够分化为成骨细胞,脂肪细胞,体外(内层23]。

msc可隔绝各种产后地区和组织,如脐带血(2,3),沃顿商学院的果冻4),胎盘(5,6),骨髓(7,牙齿8,脂肪组织(9,10]。牙科组织承诺组织的msc。msc在牙科组织有可能分化成其他组织。牙科组织可以提供牙间充质干细胞,包括物流、DPSCs, DFSCs,顶端乳头间充质干细胞(APSCs)和PDLSCs24,25]。牙科组织msc代表源,交通便利,他们有可能分化成其他组织细胞系,可用于治疗一些疾病。我们有孤立和使用三种类型的牙科组织msc: DPSC, DFSC棚屋。此外,我们研究了这些msc在免疫系统细胞的影响。这些细胞也可以提取以最小的侵袭性,与其他细胞类型不同,因此可以使用。

三浦等人从人类分离出msc乳牙;从每个乳牙,他们获得15 - 20细胞。作者表明,这些细胞附着在塑料表面和基质细胞的特征。当作者这些细胞对骨髓基质细胞相比,他们发现人类乳牙有一个更大的潜在增殖和繁殖潜力高于骨髓基质细胞。此外,乳牙干细胞表达STRO-1和CD146表面标记8]。Suchanek等人孤立了,表明这些干细胞表达高水平的CD44, CD73, CD90、CD117, CD166和HLA I,中等水平的CD29、CD105和低水平的CD45 CD63、CD71细胞表面标记。此外,这些细胞为阴性CD18, CD31, CD34, CD49d, CD49e, CD106, CD133, CD184, CD197 CD146, HLA二世细胞表面标记(1]。在我们的研究中,我们从人类分离出干细胞乳牙根据隔离协议。这些细胞附着在塑料表面,并表现出较高的增殖潜力。隔离后,我们为特征表达的细胞,表明他们CD146表面标记和其他干细胞标记,包括CD73 CD90、CD105, CD29,他们负CD14, CD34、CD45, CD25和CD28标记。

Tarle等人相比潜在增殖和分化和基因表达式的棚屋和PDLSCs。在他们的研究中,他们检测了成骨、脂肪形成的,和chondrogenic分化棚屋和PDLSCs和茜素红染色分化细胞,油红O,和冯·Kossa分别展示分化过程(13]。在我们的研究中,我们利用成骨、脂肪形成的、和chondrogenic差异化协议和茜素红染色细胞,油红O,和阿尔新蓝,分别显示了可以分化成这三个细胞株(成骨、脂肪形成的和chondrogenic)。当成骨分化了,我们证明了成骨细胞的细胞系。在脂肪形成的文化中,油滴被观察到,在chondrogenic文化、软骨和蛋白聚糖染色后观察协议。

Gronthos等人从人类分离出msc牙髓内,发现牙髓干细胞矿化矩阵和展出fibrosed和blood-veined组织类似于纸浆复合物。孤立的干细胞表现出纤维母细胞形态学的殖民地。这些细胞与骨髓干细胞相比,没有表达造血系细胞表面标记,包括CD14、CD34、CD45 [11]。另一项研究在2010年发表的报告说,孤立DPSCs展出呈CD11b殖民地,消极,CD34, CD31、CD33, CD49b,和CD45和CD44阳性细胞表面标记,CD73, CD90细胞表面标记(26]。Doğan等人表明DPSCs CD34呈阴性,CD45,和CD133阳性CD29, CD73, CD90、CD105,存在27]。我们孤立的牙髓干细胞,表明他们汇合的第九天塑料培养瓶。纤维母细胞表现出形态的殖民地CD73呈阳性,CD90、CD105, CD29,和CD146造血标记CD14和消极,,CD34、CD45 CD25和CD28。

Doğan等人孤立DPSCs和执行采用免疫分析和rt - pcr和诱导分化成骨的脂肪形成的,chondrogenic细胞系。沾染了冯Kossa分化细胞,油红O,和阿尔新蓝27]。Eslaminejad等人孤立的牙髓干细胞进行流式细胞术和rt - pcr,评估了乘以比例,和牙原性的执行,chondrogenic,脂肪形成的,成骨分化的研究26]。我们孤立DPSCs和分化为成骨的研究,进行脂肪形成的,chondrogenic细胞系。分化后,我们与茜素红染色细胞,油红O,和阿尔新蓝,分别显示分化能力。染色后,我们检查了使用显微镜细胞,成骨细胞结节显示成骨、脂肪形成的油滴,蛋白聚糖作为chondrogenic有关分化过程。

牙科卵泡是牙齿周围组织,涵盖了削弱。牙科毛囊、牙骨质、牙周韧带和肺泡骨髓间充质组织在一起形成凹痕(28]。牙科毛囊组织,很容易访问。牙科毛囊被手术过程中由于矫正的疾病。此外,它很容易从牙科毛囊干细胞分离出来。翰达岛和他的同事首次显示,DFSCs cementum-like矩阵形式当细胞在体外分化。然而,DFSCs形式呈殖民地和附着在塑料表面(29日]。横井等人表明DFSCs能够形成牙周韧带(28]。最近的研究也表明,DFSCs高增殖能力,可以向成骨分化,脂肪形成的,chondrogenic细胞系(30.]。在我们的研究中,我们从牙科毛囊分离出干细胞,取得了第五天融合在塑料表面。

森等人孤立DFSCs和immunophenotype进行分析。这些细胞表面标志物表达CD73 CD146, CD90、CD44、CD105, HLA和CD45呈阴性。此外,这些细胞系表现出更高的增殖率与骨髓msc (12]。与研究Mori et al .,我们表明,DFSCs不表达造血干细胞标记(CD14、CD45、CD34、CD25和CD28)。此外,DFSCs表达CD73, CD90、CD105 CD29,和CD146 MSC标记。

森等人表明DFSCs可以分化成成骨细胞系。我们另外表明这些细胞有可能分化成成骨、脂肪形成的,chondrogenic细胞系。分化的过程后,我们染色茜素红的细胞系,油红O,阿尔新蓝显示成骨、脂肪形成的,分别和chondrogenic分化过程。染色后,我们检查了细胞系使用显微镜观察到,在成骨细胞系,成骨细胞成骨细胞结节染色橙红色指示,油滴被染成红色表明脂肪形成的细胞系,和蛋白聚糖是彩色蓝色指示chondrogenic细胞系。

我们比较三种类型的msc获得不同牙科来源。此外,我们比较了增殖率、分化潜能,从rt - pcr和基因表达式DPSCs,棚屋和PDLSCs。比较隔离步骤,菌落,扩散潜力,扩散潜力高DFSCs (DFSC > > DPSC)。此外,流式细胞仪分析,揭示DPSCs表示大量的MSC标记与脱落细胞和DFSCs相比。低表达的了大量的造血干细胞标记相比DPSCs和DFSCs (> DPSC > DFSC)。因此,DFSCs可能更有效,因为他们要扩散潜力,克隆形成能力,和分化潜能与其他细胞系相比,特别是与棚屋和DPSCs相比。

三浦和他的同事们发现了高山基因表达标记的基质和血管系统细胞株(8]。高山基因是一种特定nondifferentiated多能干细胞的标志。此外,诱导多能干细胞表达高山(31日]。它也表明,DFSCs表达高山当在缺氧环境中培养32]。我们显示了,DPSCs, DFSCs高山基因表达。DFSCs高山基因的表达水平较高而棚屋和DPSCs。DPSCs,此外,我们表明,棚屋和DFSCs表示DSPP RUNX2,切口,巢蛋白的基因。DSPP DFSCs表达水平较高,RUNX2,切口的基因。棚屋和DPSCs相比,NANOG DFSCs表达水平较高,多能干细胞标记。

维护的连续性生物功能的第一个目标是细胞疗法治疗受伤的组织和器官。为此,干细胞是最重要的材料用于细胞疗法(33]。干细胞从各种来源(例如,胚胎干细胞和骨髓msc)已被用于在体外和体内实验模型。然而,伦理性考量阻碍胚胎干细胞的使用,和这些细胞系的畸胎瘤可能阻止他们的使用在临床试验中34]。因此,干细胞隔离研究专注于msc来自其他组织,如肌肉,软骨,牙髓、脂肪组织、神经组织、骨髓(35]。

MSC治疗是一种很有前途的生物治疗治疗一些疾病。由于简单的分离msc,培养条件的快速扩散,和他们有前途的分化特性与其他细胞系相比,有人建议,大多数msc可用于研究[36,37]。此外,msc是潜在的免疫系统,监管机构和他们的畸胎瘤风险很低37]。在这项研究中,我们审查的影响从乳牙分离msc,牙髓和牙卵泡在免疫系统细胞。的研究结果很重要,使用这些细胞系一些免疫系统疾病的治疗。

msc是高度承诺由于其免疫抑制和免疫调节对自身免疫性疾病的影响38,39]。在这个地区有有限的实验研究。msc是用于治疗疾病,如多发性硬化症(MS)和肌萎缩性脊髓侧索硬化症,被认为是有效的减缓或诱发这些疾病的回归40]。msc的免疫原性很低,他们诱导免疫抑制效果,代表研究者关注的主要原因在临床应用msc。这些细胞不表达HLA-DR或costimulatory因素(CD80、CD86)。msc刺激Treg细胞,防止T细胞的激活,从而抑制B细胞活化。msc展示他们的免疫抑制效应通过抑制T细胞增殖。在这项研究中,我们检测了免疫抑制的影响,DPSCs, DFSCs培养每一个细胞类型外周血单核细胞的免疫系统细胞。

msc抑制天真和记忆T细胞的反应与有丝分裂原刺激。Demircan和他的同事们发现,牙髓干细胞诱导T细胞增殖抑制的影响(41]。首先,我们检查了的影响,DPSCs, DFSCs淋巴细胞增殖。所有组的msc诱导淋巴细胞抑制的影响。此外,文化被分为两组:文化有或没有干扰素-γ刺激。DFSCs是最有效的抑制淋巴细胞在文化中有或没有干扰素-γ。因此,干细胞表现出抑制T淋巴细胞增殖的影响,与其他研究协议。第一次,我们发现这些细胞表现出最高的免疫抑制效应的存在干扰素-γ。此外,免疫抑制的效率了,DPSCs, DFSCs比较。

coculture之后,一些先前的报道表明,msc抑制T淋巴细胞,但T淋巴细胞的生存增加,细胞凋亡减少(42]。我们还展示了淋巴细胞凋亡的抑制。此外,我们进行了Fas / Fas配体分析来研究细胞凋亡。我们评估了三种类型的牙科msc和比较他们的cocultures淋巴细胞。结果表明,所有的牙科msc抑制T淋巴细胞凋亡。在cocultures干扰素-γ刺激和DFSCs培养没有干扰素-γ的抑制T淋巴细胞凋亡明显减少。此外,当与其他牙科msc相比,cocultures棚屋显示表达式的Fas配体(CD178)显著抑制干扰素的刺激γ。

Demircan和他的同事们发现,牙齿干细胞和T细胞增殖cocultures增加CD4的比率⁺要具体⁺T细胞(41]。流仪分析cocultures透露,CD4细胞的数量⁺FoxP3⁺Treg细胞与淋巴细胞增加文化有无msc。另外,干扰素,γ刺激增加CD4的数量⁺FoxP3⁺Treg细胞。的抑制效应DFSCs,棚屋和DPSCs也相比。DFSCs和DFSCs干扰素-γ模拟表现出最高的CD4细胞的增加⁺FoxP3⁺Treg细胞与其他牙科msc。

Demircan和他的同事们发现,牙齿干细胞和T细胞增殖cocultures增加干扰素-的水平γ细胞因子(41]。此外,我们分析了细胞因子il - 4和il - 10的水平。coculturing后,收集上清液,细胞因子进行了分析。牙msc抑制il - 4和干扰素的表达γ,而il - 10的表达增加。il - 10是由巨噬细胞和T淋巴细胞分泌,抑制il - 12的表达,干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α(43,44]。在我们的研究中,msc il - 10的表达和抑制干扰素,增加γ。

5。结论

在这项研究中,我们检测了免疫的影响,健康的捐赠者DPSCs, DFSCs淋巴细胞体外。我们发现DFSCs只是访问和孤立和能够分化成其他细胞相比更有效地与其他牙科msc。棚屋,DFSCs DPSCs抑制淋巴细胞增殖,增加Treg细胞,减少il - 4和干扰素-γ水平,增加il - 10的水平。此外,DFSCs表现出更高的对免疫系统细胞免疫调节的影响。在刺激与干扰素γ,DFSCs表现出免疫调节功能,建议他们可以用于治疗自身免疫,炎症和过敏性疾病。

利益冲突

作者没有利益冲突声明。

承认

这项工作是支持的马尔马拉BAPKO没有大学研究项目。凹陷- c - ylp - 050614 - 0225。