文摘

我们之前报道的隔离和文化人类乳腺上皮细胞具有干细胞特征(I型HBEC)减少乳房成形术使用MSU-1媒介。随后,我们开发出了几种不同的正常成人干细胞类型从不同的组织使用K-NAC媒介。在这项研究中,我们确定这是否低钙K-NAC中抗氧化剂(N-acetyl-L-cysteine和L-ascorbic acid-2-phosphate)是一个更好的媒介来培育人类乳腺上皮细胞。结果清楚地表明,K-NAC介质是更好的媒介长期增长(累积人口翻番水平介于30 - 40)的正常乳腺上皮细胞表达干细胞表型。这些乳腺干细胞的特点包括差距交界细胞间缺乏沟通,Oct-4表达式,能够分化成基底上皮细胞和形成瀑样显示乳腺导管和终端开花如结构。因此,这个新方法的类型我HBECs乳腺发展在将来的研究中是非常有用的,乳腺致癌作用,化学预防和治疗癌症。

1。介绍

干细胞是未分化的细胞自我更新和分化能力高。干细胞研究已成为生物医学研究的一个主要关注其潜在的细胞修复和再生医学的关键作用和致癌作用。

在乳房中,有两种上皮细胞谱系,肌上皮和导管上皮细胞,来源于干细胞(1,2]。这些细胞构成了乳腺,形成导管和lobuloalveolar结构(1,3,4]。在妇女,乳腺是一个动态的器官,从怀孕会经受一系列的改变,哺乳期,退化5,6]。干细胞也被认为是乳腺癌的起源(7]。因此,乳腺癌干细胞是重要的乳房发育的机理研究,致癌化学预防,和癌症治疗。

我们之前已经开发出了一个孤立的细胞培养方法和文化的两种类型的正常的人类乳腺上皮细胞(HBECs)减少乳房成形术(8]。这两种类型的细胞,I型和II型HBECs,都进行了广泛的特点,发现在表型之间有着本质的不同。II型HBECs表达maspin和基底上皮细胞标记,细胞角蛋白14 (CK14) [8]。相比之下,I型HBECs表达雌激素受体和导管上皮细胞标记,即上皮膜抗原(EMA), CK18和CK19 [8]。值得注意的是,I型HBECs显示许多干细胞特性。其中包括(1)缺乏差距交界细胞间通信(GJIC) [7,8];(2)胚胎和成年干细胞标记物的表达,Oct-4;(3)能够分化成基底(II型HBECs)和鲁米那(acini-forming)上皮细胞(8];(4)锚固能力的独立成长和形成萌芽/导管瀑样[9]。此外,I型HBECs更容易发现端粒酶激活,不灭,强有力的证据和肿瘤转换,致癌作用的干细胞理论(见参考这些特征(7])。步进式的肿瘤干细胞提供了一个体外模型的转换乳腺癌的进展(9),包括乳腺癌干细胞标记CD44的出现+/ CD24−(10,11]。

虽然这些HBECs泌乳生物学和致癌作用的研究是有用的,这些细胞培养在MSU-1介质扩散潜力有限(~ 3段)8]。HBECs这些研究之后,我们报道的发展几个人类成体干细胞从不同的组织,也就是说,肝,胃,羊水,子宫内膜和脂肪间充质干细胞(12- - - - - -16]。发展中这些干细胞的成功主要是归因于使用低钙中(0.09毫米)(K-NAC介质)含有抗氧化剂,N-acetyl-L-cysteine (NAC)和L-ascorbic acid-2-phosphate (Asc-2P),可以改变细胞的氧化还原状态,促进干细胞主要转录因子的表达。在这项研究中,我们进行了实验,以确定K-NAC媒介是媒介更好地提高I型HBECs的自我更新能力,同时保存了这些细胞的干细胞的表达特征。

2。材料和方法

2.1。人类乳腺上皮细胞的文化

三个正常的人类乳腺上皮细胞(HBEC)文化(指定HBEC30, HBEC31, HBEC35)孤立从三个不同的女性(23岁,21日,43岁的职责。)在减少乳房成形术在兰辛麻雀医院,MI。患者的书面同意接收和使用HBEC是密歇根州立大学的机构审查委员会批准。MSU-1介质补充剂和过程用于开发两种类型(类型I, II型)的正常HBECs从最初的文化已报告之前(8]。一个星期后,输入我HBECs使胰蛋白酶化液态氮的实验或存储。三种细胞培养基在这项研究中,MSU-1介质(80.2毫米Asc-2P]有或没有补充(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)和2毫米NAC(σA8199)(没有规范,MSU-1介质是指后者没有补充南汽和Asc-2P),和153年修改MCDB介质(Keratinocyte-SFM GIBCO-Invitrogen公司,卡尔斯巴德,CA)和0.2毫米Asc-2P补充2毫米NAC(称为K-NAC介质)16]。生长因子/ K-NAC介质的荷尔蒙rEGF (5 ng / mL),牛脑垂体提取物(50μg / mL)、胰岛素(5μg / mL),氢化可的松(74 ng / mL),和3,3′,5-triiodo-D.L。甲状腺原氨酸( )(6.7 ng / mL)。

2.2。累积人口翻倍水平

累积人口翻番水平(cpdl)持续的亚文化和增长从一个已知数量的细胞(1×105)计算确定I型HBECs的增殖潜力。每个subcultivation cpdl细胞计数的计算通过使用方程: ,在那里 和 分别是初始的和最终的细胞数量和ln是自然对数。

2.3。差距联接的细胞间通讯

交界细胞间通讯的差距(GJIC)研究了刮加载/染料转移技术在我们的实验室17]。染料转移细胞之间使用尼康Eclipse TE300紫外荧光显微镜观察和记录由数码相机连接到电脑。

2.4。免疫化学分析

疣状,细胞生长在35毫米板与磷酸盐缓冲盐水洗(PBS)和4%多聚甲醛固定的PBS 20分钟。与PBS冲洗后,这些细胞被permeabilized (BSA triton x - 100 0.5%, 2%,和0.05% NaN3 PBS) 10分钟。细胞被孵化与主抗体[anti-Oct-4(1: 200稀释,Chemicon公司,泰梅库拉,CA), anti-CK18 (Sigma-Aldrich 1: 200年,圣路易斯,密苏里州,美国),anti-CK19 (Sigma-Aldrich 1: 200年,圣路易斯,密苏里州,美国),anti-CK-14 (Sigma-Aldrich 1: 200年,圣路易斯,密苏里州,美国),anti-Maspin (BD Biosciences-Pharmingen 1: 100年,圣何塞CA美国),和anti-EMA(1: 100)这是一个礼物从m·g·奥梅罗德博士(癌症研究学院,皇家癌症医院,萨顿,萨里,英国)]在PBS /卫/ BSA在一夜之间25°C。第二天,这些细胞被孵化与二次抗体共轭FITC PBS /特里同为1小时/ BSA缓冲区25°C。与PBS彻底清洗后,相位图像和荧光的细胞被观察和记录使用尼康Eclipse TE 300显微镜数码相机和电脑连接。

2.5。西方墨点法

蛋白质提取20% SDS裂解解决方案包含几个蛋白酶和磷酸酶抑制剂(1毫米phenylmethylsulfonyl氟化物,1毫米亮抑酶肽,antipain 1毫米,0.1毫米抑肽酶,0.1毫米原钒酸钠,氟化钠和5毫米)。蛋白质浓度测定用Biorad量化工具(Biorad、钙、美国)。相同数量的蛋白质(15μg / lane)分离12% sds - page和从凝胶转移到PVDF膜(微孔集团,贝德福德,MA)。使用单克隆抗体进行免疫印迹(anti-Oct-4、anti-CK18 anti-CK19, anti-CK-14, anti-Maspin,和anti-EMA)。随后被孵化与辣根peroxidase-conjugated二级抗体检测和ECL化学发光检测试剂(美国IL Amersham有限公司)。膜暴露在x射线胶片的15秒到1分钟。

2.6。诱导分化的类型我HBEC II型HBEC

I型HBECs K-NAC介质中接种霍乱毒素的存在(1 ng / mL, Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)诱导分化的类型我HBECs II型HBECs 14天。每隔一天中被改变。

2.7。乳腺导管Coculture瀑样形成的两个HBEC细胞类型

1:2中I型和II型HBECs细胞数量比接种在poly-D-lysine (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)涂层板。细胞开始形成的混合瀑样在一夜之间,被允许长为4周。

2.8。统计分析

结果显示从至少三个独立的实验。治疗的意义区别Mann-Whitney测试评估的非参数统计,使用SPSS Windows 13.0统计程序。的 值< 0.05被认为是重要的。所有的统计数据都是平均数±标准差。

3所示。结果

3.1。我HBECs培养在不同的媒体类型的形态

正常的人类乳腺上皮细胞是由减少乳房成形术组织的三个不同的女人。I型HBECs最初开发的MSU-1中5%的边后卫亚文化和生长在两个不同的媒体,即MSU-1和K-NAC媒介。形态、类型我HBECs MSU-1中与相邻variable-shaped细胞形成的殖民地和平滑限制边界在一周(图1(一))。相比之下,I型HBECs生长在K-NAC介质和更均匀的分散在细胞形状(鹅卵石嵌入)(图1 (b))。不同媒介的形态是可逆的在变化(数据没有显示)。

(一)
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(c)
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图1
I型HBECs镀在MSU-1培养基培养,(a)形成菌落光滑和限制边界,殖民地的细胞是连续的和variable-shaped, I型HBECs生长在K-NAC分散介质(b)。(c)的增殖潜力类型在K-NAC培养基培养我HBECs: cpdl = 38.5, 42.8,和22.4,分别为HBEC30 HBEC31, HBEC35。
3.2。增殖潜力类型我在K-NAC HBECs培养介质

I型HBECs K-NAC的培养基培养显示更高的增殖能力和增长超过40天文化,实现共38.5 cpdl 42天,42.8 cpdl 67天,和22.4 cpdl在42天,分别HBEC30 HBEC31, HBEC35(图1 (c))。这些细胞的增殖能力K-NAC介质比这更高的I型HBECs生长在MSU-1中我们观察到。

3.3。抗氧化剂增强I型和II型HBECs扩散

I型HBECs在三种培养基培养,也就是说,MSU-1,与南汽/ Asc-2P MSU-1 K-NAC媒介。3通道后,I型的平均cpdl HBECs (HBEC30、HBEC31 HBEC35)开发的K-NAC介质(cpdl 30.5)高于MSU-1介质和MSU-1介质与南汽/ Asc-2P (cpdl 13.6和20.8,分别地。)(图2(一个))。平均cpdl MSU-1 II型HBECs发达的媒介与南汽/ Asc-2P (cpdl 20.3)高于MSU-1媒介(cpdl 13.4)(图2 (b))。这些结果表明,南汽和Asc-2P可以显著提高了I型和II型HBECs的增殖潜力。

(一)
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(b)
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图2
我HBECs类型的抗氧化剂增强扩散。(a)的平均cpdl HBEC30, HBEC31, HBEC35发达K-NAC介质(cpdl 30.5)高于MSU-1中、MSU-1介质与南汽/ Asc-2P (cpdl 13.6和20.8,分别地。 )。(b)的平均cpdl MSU-1 II型HBECs发达的媒介与南汽/ Asc-2P (cpdl 20.3)高于MSU-1介质(cpdl 13.4) ( )。
3.4。差距联接的细胞间通讯类型的我在K-NAC HBECs培养介质

癌细胞和许多人类成体干细胞已被证明缺乏差距交界细胞间通信(GJIC) [7,18]。相反,正常的体细胞在GJIC主管。确定类型我HBECs发达K-NAC中能够GJIC刮加载/染料转移技术(17)是用于检查汇合的I型HBECs生长在在不同cpdl K-NAC介质。结果显示,I型HBECs K-NAC介质在不同开发的cpdl(1、18、24和29)缺乏GJIC(数字3(一个)- - - - - -3 (d)),类似的类型我HBECs MSU-1开发的媒介。

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图3
差距联接的细胞间通讯类型的我在K-NAC HBECs培养介质研究了路西法的黄色刮加载/染料转移技术。结果表明,I型HBECs在早期和中间通道(cpdl = 1、18和24)(a - c)缺乏染料转移。在后面的通道(cpdl 29) (d)、I型HBECs显示染料转移非常有限。观察同一区域的细胞相衬下(左)或荧光显微镜(右)。
3.5。类型的干细胞标记物的表达我在K-NAC HBECs培养介质

疣状,Oct-4发现表达我在K-NAC HBECs发达型介质。CK18、CK19和EMA明确表示在腔的上皮细胞也表达了在这些类型我HBECs。这些生物标志物也表达了我在MSU-1 HBECs发达型介质正如我们之前报道的(8]。I型HBECs培养K-NAC和MSU-1媒体没有表达maspin和CK14(基底上皮细胞标记),与II型HBECs强烈积极的在表达(图4)。Maspin,蛋白酶抑制剂基因,被认为是肿瘤抑制基因基于微分显示研究表明其在正常细胞中表达,而不是肿瘤干细胞(19- - - - - -21]。从免疫染色研究证实这些结果,两个细胞系(HBEC30和HBEC31)开发的两种不同的媒体测试6的表达标记(Oct-4 CK14, CK18、CK19, EMA,和maspin)通过免疫印迹分析。这些结果证实,I型HBECs生长在K-NAC和MSU-1媒介表达所有标记除了CK14和maspin蛋白质(图5)。Oct-4,通用干细胞标记,始终表达了I型HBECs发达在K-NAC介质(图5)。这些数据清楚地表明,I型HBECs K-NAC媒介表达Oct-4发达,CK18、CK19, EMA但不是CK14 maspin,类似于我在MSU-1 HBECs发达型介质。


图4
疣状,I型HBECs K-NAC和MSU-1培养基培养发现表达Oct-4, CK18、CK19和教育津贴,但不是maspin和CK14。II型HBECs表示Oct-4 maspin, CK14但不CK18、CK19和EMA检测到免疫染色。

图5
免疫印迹分析Oct-4, CK18、CK19在HBECs EMA, maspin, CK14表达式。巷1:II型HBEC30 MSU-1中等发达;巷2:I型HBEC30 MSU-1中等发达;巷3:I型HBEC30 K-NAC开发的介质(cpdl = 27);巷4:II型HBEC31 MSU-1中等发达;巷5:I型HBEC31 MSU-1中等发达;巷6:I型HBEC31 K-NAC开发的介质(cpdl = 18);巷7:I型HBEC31 K-NAC开发的介质(cpdl = 24);巷8:I型HBEC31 K-NAC开发的介质(cpdl = 29)。
3.6。I型HBECs分化成II型HBECs霍乱毒素

早期通过I型HBECs (HBEC30和HBEC31)在K-NAC培养中没有或霍乱毒素的存在。经过14天的文化媒介与霍乱毒素、I型的典型形态HBECs已经变成了II型HBEC。图6表明,I型HBECs发达与霍乱毒素K-NAC介质表示CK14和maspin(图6道4和8),类似于II型HBECs(图6,通道2和6)。结果提供的证据表明,霍乱毒素能够诱导分化的类型我HBECs II型HBECs报道之前(8]。


图6
分化诱导的I型HBECs发达K-NAC介质由II型HBECs霍乱毒素。巷1:I型HBEC30 MSU-1中等发达;巷2:II型HBEC30 MSU-1中等发达;巷3:I型HBEC30 K-NAC中等发达;巷4:I型HBEC30发达K-NAC介质与霍乱毒素(14天);巷5:I型HBEC31 MSU-1中等发达;巷6:II型HBEC31 MSU-1中等发达;巷7:I型HBEC31 K-NAC中等发达;巷8:I型HBEC31发达K-NAC介质与霍乱毒素(14天)。
3.7。在体外形成乳腺瀑样

I型HBECs K-NAC开发的中型和II型HBECs使胰蛋白酶化,在1到2比cocultured poly-D-lysine涂覆盘子。这些细胞开始总在一夜之间,形成乳腺瀑样2周(数字7(一)和7 (b))。两种类型的能力poly-D-lysine HBECs形成乳腺瀑样的涂层板是类似于以前观察到的9]。孵化后4周,这些发现乳腺瀑样开发许多乳腺导管和终端开花如结构(图7 (c))。

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图7
两种类型的HBECs (I型HBECs发达K-NAC介质和II型HBECs 1: 2的比例)在poly-D-lysine接种覆盖板。(a, b)镀14天之后,这些细胞形成乳腺瀑样。(c)孵化后28天,发现这些瀑样开发许多乳腺导管和终端开花如结构。

4所示。讨论和结论

促使本研究的主要原因是我们不满的低增殖潜力类型我HBECs MSU-1中、我们的发现K-NAC介质可以支持许多人类和哺乳动物成体干细胞的生长和延长寿命(如人类肝脏干细胞,50 cpdl;人类羊膜fluid-derived间充质干细胞,大约78 cpdl;人类脂肪间充质干细胞,35 cpdl) (12,14,16]。

的生长类型的比较研究我使用这两个媒体,HBECs MSU-1 K-NAC,透露了一些相似点和不同点在这些细胞表型。相似之处包括(1)缺乏gap-junctional细胞间通讯(图3),许多干细胞和肿瘤细胞的标志(7,8,15,16,18,22,23];(2)干细胞的表达和导管上皮细胞标记(即。Oct-4, CK18、CK19和EMA)(数据4和5)类似于之前的研究7];(3)诱导分化的类型我HBECs II型HBECs霍乱毒素,循环AMP-inducing代理(图6);(4)形成乳腺瀑样的能力显示导管和终端开花如结构poly-D-lysine涂层板(图7);(5)缺乏CK14和maspin的表达。CK14明确表示在基底上皮细胞和II型HBECs而maspin已被认为是一种肿瘤抑制基因。

表型的差异表达类型我生长在MSU-1 HBECs K-NAC中被观察到。首先,如图1细胞的形态学和殖民地是不同的。与相邻variable-shaped细胞和限制殖民地MSU-1中,细胞生长在K-NAC介质分散和类似于II型HBECs发达MSU-1介质中更均匀和鹅卵石stone-shaped [8]。二、最重要的区别是扩散的潜力。I型HBECs K-NAC中一直表现出更高的增殖潜能和生成时间短(即。,Type I HBEC30: 38.5 cpdl in 42 days after 3 passages, Type I HBEC31: 42.8 cpdl in 67 days after 7 passages, and Type I HBEC35: 22.4 cpdl in 42 days after 3 passages) (Figure1 (c)),而相同的细胞生长在MSU-1介质(13.6 cpdl 40天)(图2(一个))。K-NAC介质的扩散增强效果可以归因于抗氧化剂Asc-2P和NAC可以改变细胞氧化还原,促进自我更新的前体细胞(24]。在这项研究中这些补充剂也发现提高I型和II型的cpdl HBECs MSU-1介质(数字2(一个)和2 (b))。南京汽车很容易脱去乙酰基细胞提取l -半胱氨酸收率,从而提高生产谷胱甘肽(25]。Asc-2P是一种稳定的前兆在细胞培养提供抗坏血酸(26,27]。抗坏血酸可以抗氧化或prooxidative(即。,reversible interconversion between ascorbate and dehydroascorbate) depending on its concentration and concentration of metal ions. The calcium concentration of K-NAC medium (0.09 mM) is lower than in MSU-1 medium (0.98 mM). This may also be responsible for the difference in proliferation potential, since high concentration of calcium may induce cell differentiation [28]。

本研究的主要结果是证明K-NAC媒介是更好的媒介支持增长的I型HBECs干细胞自我更新能力和持续表达高的特点相比,我们MSU-1介质或报告文学。因此,新方法的类型我HBECs将乳腺发展在将来的研究中是非常有用的,乳腺致癌作用,化学预防和治疗癌症。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作得到了郭总医院研究基金(批准号:100 - e - 004和105 - o - 11)。