文摘

虽然可以生成神经干细胞(NSC)从体细胞重编程技术与转录因子、临床使用的患者NSC治疗人类疾病仍然是难以捉摸的。与病毒转导相关联的风险障碍向量诱导诱变,从未分化的干细胞,肿瘤形成和转录factors-induced基因组不稳定。在这里,我们描述一个病毒vector-free和更有效的方法来诱导小鼠成纤维细胞在NSC使用小分子。小molecule-induced神经干细胞(股市)细胞相似NSC在形态、基因表达模式,自我更新,兴奋性和multipotency。此外,股市细胞能够分化为星形胶质细胞,功能神经元和少突胶质细胞在体外和在活的有机体内。因此,我们建立了一个新奇的办法有效地诱导神经干细胞(iNSC)成纤维细胞只使用小分子在不改变基因组。这样的化学感应消除了风险与当前技术,如使用病毒载体或致癌因素的诱导。因此,这种技术可能使NSC能够用于临床医学内各种应用程序。

1。介绍

最近,成纤维细胞被重组成诱导神经干细胞(iNSC)转录因子(1- - - - - -5),使神经干细胞(NSC)治疗神经退行性疾病的可行性。然而,临床使用的患者NSC治疗人类疾病仍然是难以捉摸的,主要是由于与病毒有关的风险传导载体用于感应。多项研究表明,某些小分子可以直接修改表观遗传学和提高体细胞重编程通过调节信号通路。例如,丙戊酸(VPA)抑制组蛋白脱乙酰酶和重编程效率提高了小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)诱导多能干细胞(iPS)细胞(6]。RG108是DNA甲基转移酶抑制剂,可以改善MEF成“诱导多能性”细胞的效率(7]。维生素C (VC)是由加双氧酶反应的辅因子包括胶原prolyl羟化酶,低氧诱导因子(HIF), prolyl羟化酶,和组蛋白demethylases已经发现提高代老鼠和人类iPS (8]。BIX01294, G9a HMTase抑制剂,可以提高细胞重编程的效率(9]。A83-01强烈抑制ALK4 5和7,只有弱抑制ALK1, 2, 3, 6,似乎抑制TGF -β通过抑制全身epithelial-to-mesenchymal过渡Smad2磷酸化(10]。CHIR99021是糖原合酶激酶的抑制剂3β(GSK3β),防止GSK3β连环蛋白的磷酸化β并激活Wnt信号(11,12]。PD0325901 MEK抑制剂可以抑制MAPK / ERK信号通路促进小鼠胚胎干细胞(ESC)自我更新(11,13,14]。此外,“诱导多能性”细胞诱导小鼠成纤维细胞的八个小分子不使用任何转录因子(15]。

NSC修复神经退行性疾病有很强的潜力,提高再生受损神经系统(7,16),但是仍然没有一个病毒转导向量免费方法获得足够数量的NSC个性化的治疗。这里,我们决定只使用小分子,在有潜在危险的转导向量,可以诱导小鼠成纤维细胞NSC。

2。材料和方法

动物伦理已经批准的弗林德斯大学动物伦理委员会和南澳大利亚病理学动物伦理委员会。

2.1。细胞培养

小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和tail-tip成纤维细胞(TTF)隔绝C57 / BL6老鼠如前所述[17]。MEF和TTF培养在DMEM(生命技术)含有10%的边后卫(技术),50单位/毫升青霉素,50μg / mL链霉素(技术)。

2.2。股市细胞的诱导

MEF (TTF被播种在1.4×10⁵每35毫米盘前涂上支线细胞感应。MEF(通道1 - 3)与丝裂霉素C治疗(10μg / mL)为2.5个小时,然后洗了三次1×PBS最后培养干细胞培养基对馈线细胞在一夜之间。干细胞信号通路调制器小分子PD0325901 CHIR99021, A83-01被用来启动感应。表观遗传调制器小分子丙戊酸,Bix01294, RG108选择提高感应效率和细胞衰老调制器小分子维生素C是用来减少在诱导细胞死亡18]。这些细胞被诱导在6周期。第一天,细胞诱导干细胞培养基(SCM) (DMEM补充15%的边后卫,1%不重要的氨基酸(技术)、谷酰胺(生命技术)1%,50个单位/毫升青霉素,50μg / mL链霉素,0.1毫米β巯基乙醇(技术)和1000毫升⁻¹白血病抑制因子(生活)(微孔)含有小分子(丙戊酸,1μM;Bix01294 1μM;RG108, 0.04μM;PD0325901 1μM;CHIR99021 3μM;维生素C, 25μM;A83-01, 2.5μ米)。这些细胞被培养在SCM在接下来的两天。然后,循环重复5次。接下来,细胞通道和悬浮在1毫升SCM(至于每35毫米盘),然后做一滴20μL暂停文化在培养皿,补充图所示可以在网上http://dx.doi.org/10.1155/2016/4304916。最后,这些细胞被培养在神经干细胞培养基(DMEM / F12(生命技术)补充B-27(1: 50,生活技术),50个单位/毫升青霉素,50μg / mL链霉素,8毫米消息灵通的缓冲区,20 ng / mL EGF和10 ng / mL bFGF)在培养皿中两个星期。至于feeder-free感应,细胞被播种在5×10⁵每35毫米盘涂上PDL细胞(10μg / mL)(σ)37°C两个小时。细胞培养在含有Bix01294 SCM, RG108, PD0325901 2周;在一天中被改变。殖民地在诱导过程中出现。NSC的殖民地在培养皿中培养介质为另一个两个星期。本机NSC在培养的新生小鼠的大脑NSC介质像前面描述的那样积极的控制(19]。所有的小分子来自Stemgent。

2.3。分析器RT - PCR和RT PCR数组

总RNA提取使用RNeasy迷你包(试剂盒)对列DNA消化。总RNA (500 ng)转换为互补脱氧核糖核酸上标三世直接互补脱氧核糖核酸合成系统(技术)。使用引物PCR是由30个周期描述的补充表。分析器RT PCR阵列进行了使用鼠标神经发生和NSC PCR数组(试剂盒)。

2.4。碱性磷酸酶(ALP)和免疫荧光染色

ES培养基添加NS和股市一夜之间细胞。碱性磷酸酶染色法是根据生产的协议(罗氏)。免疫细胞化学染色,细胞被洗1×PBS然后用4%多聚甲醛固定10分钟。与1×PBS洗两次后,细胞permeabilized Triton x - 100 20分钟为0.1%。细胞被洗两次,封锁在PBS溶液含有1%的边后卫和4% BSA 1小时。初级抗体稀释在阻断缓冲区和申请室温1小时或隔夜在4°C。主要的抗体被用于以下稀释:Sox2(微孔,1:200、鼠标),Olig2(微孔,1:500年,兔子),GFAP (Dako 1: 400年,兔子),Map2 (Osenses 1: 1000年,兔子),巢蛋白(圣克鲁斯生物技术1:300年,鼠标),Oct4 (N-19)(圣克鲁斯生物技术,1:500年,山羊),Vamp2 (Osenses 1: 2000年,兔子),NeuN (Biosensis 1: 500年,鼠标),Alpha-tubulin(σ1:1000年,老鼠)和O4(微孔,1:200年,鼠标),和Ki67 (Abcam 1: 100年,兔子)。细胞被洗了三次与1×PBS然后应用二次荧光抗体(1:1000年,Cy3或alexa - 488)和10μg / mL DAPI室温1小时。

2.5。流式细胞仪分析

TTF细胞分离和孵化FBS-PBS 2%解决方案与抗体我共轭FITC (Biosensis, 1: 6、鼠标)冰半小时。这些细胞被洗在冰冷的2% FBS-PBS流式细胞仪的三倍。积极的分数是评估通过流式细胞仪(贝克曼库尔特史诗是HyperSort,使用世博会MultiComp软件版本1.2 b(美国贝克曼库尔特、迈阿密、FL))与一个空白的控制。

2.6。在体外股市细胞的分化

细胞被播种在0.5×10⁴在一个自由人民党(10μg / mL) /层粘连蛋白(10μg / mL)(σ)涂4板。自发分化,细胞培养在NS细胞培养基含有N2(技术)没有EGF和bFGF一个或三个星期。成熟神经元的分化,单一的股市在neurobasal培养基培养细胞(技术)包含B27(2%)(技术),GlutaMAX(2毫米)(技术)和dibutyryl营(0.5毫米)(σ)四个星期。至于特定星形胶质细胞分化、细胞培养在neurobasal中包含1×N2 1×B27,和1%的边后卫为3周。神经元分化,细胞培养neurobasal中包含1×N2, 1×B27, 1%的边后卫,5μM forskolin, 1毫米视黄酸了两周,然后neurobasal中包含1×N2, 1×B27, 1%的边后卫,10 ng / mL BNDF,和10 ng / mL GDNF 2周。细胞在DMEM / F12培养包含1×N2, 10 ng / mL bFGF, 10 ng / mL PDGF-AA 5μM forskolin 5天然后在0.2毫米维生素C和30 ng / mL T3特定少突细胞分化为3周。

2.7。股市细胞的分化在活的有机体内

分离股市细胞被标以慢病毒EGFP向量和总量的3μL (10⁵/μL)的侧脑室注入大脑裸体幼崽(6幼崽)岁的3天。大脑收集注射生理盐水灌注后6周后,固定在periodate-lysine-paraformaldehyde 24小时(20.),用PBS洗净,浸泡在30%蔗糖48小时,分为30μm日冕部分。大脑部分应用了Sox2(神经干细胞),ki67(增殖细胞),GFAP(星形胶质细胞),Map2(神经元),NeuN(神经元),和Olig2(寡树突胶质细胞)使用前面描述的方法(21]。

2.8。电生理学

全细胞膜片钳进行分化细胞使用HEKA EPC-10膜片钳放大器和补丁大师软件(HEKA Electronik, Lambrecht /法尔兹,德国)。补丁吸量管救出硼硅玻璃和火抛光,3 - 5 MΩ的阻力。内部解决方案包含以下(毫米):氯化钠、10;氯化钾,145;消息灵通的,10;MgCl₂,1;1,EGTA调整pH值7.3。外部解决方案包含以下(毫米):氯化钠,135;氯化钾,2.8;消息灵通的,10;MgCl₂,1;CaCl₂,2;和葡萄糖10调整与氢氧化钠pH值7.4。测量钠⁺和K⁺电流电压钳模式执行,利用一个协议与电压的步骤−70 + 70 mV (10 mV增量),20或100女士,女士从持有−80 mV的潜力。串联电阻补偿至少70%。动作电位记录在current-clamp模式中,如果需要注入电流- pA。电压显示没有调整液体接界电势。

3所示。结果

3.1。小Molecule-Induced神经干细胞(股市)细胞可以从MEF 7小分子的结合

我们选择的候选小分子向NSC重组成纤维细胞。小分子的结合(丙戊酸,1μM;Bix01294 1μM;RG108, 0.04μM;PD0325901 1μM;CHIR9901 3μM;维生素C, 25μM;A83-01, 2.5μ发现米)诱导小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)出谋划策。考虑到太多的转录因子的表达是有害的多能细胞的自我更新(17),我们设计了一个感应6-cycle协议过程(补充图)。成纤维细胞培养或者在小分子有干细胞培养基(SMSCM) 1天在干细胞培养基(SCM)没有小分子为周期1,周期2天重复了额外的5倍。第六周期后,细胞的悬浮培养2天然后在NSC培养基2周。之前没有殖民地在诱导过程中暂停文化。有一个殖民地在每个悬浮培养后下降。然后是殖民地在NSC培养基培养两周。MEF负了Sox2、巢蛋白和SSEA-1后几个段落(补充图)。为了消除神经嵴干细胞从老鼠的皮肤22),仅MEF - Sox2, SSEA-1,巢蛋白用于感应。使用7小分子诱导,股市(SMINS-MEF-7)细胞能够稳定和同质的扩大超过两年没有显著减少,自我更新能力和形态上区别经典NSC暂停文化在培养皿或附加poly-D-lysine (10μg / mL) /层粘连蛋白(10μ克/毫升)或人工基底膜涂布在高密度细胞培养菜(1×10⁵/厘米²)(补充数据和B和图)。首先,我们玷污了殖民地的高山,他们积极的(补充图)。然后我们测试了典型NSC标记Sox2巢蛋白;他们也积极(数字和D)。

接下来我们测试NSC标记基因的表达的逆转录PCR (rt - PCR)。细胞与成纤维细胞相比,SMINS-MEF-7表示NSC包括标记基因Sox2,GFAP、和Olig2(补充图)。就像NSC, SMINS-MEF-7细胞不表达多能性基因Oct4和Nanog(图)。为了进一步评估NSC的相关基因的表达谱,我们进行了一个分析相关的84个基因老鼠神经发生和NSC分析器使用RT PCR数组。与MEF相比,23基因调节的3 - 1543倍和13个基因表达下调至少三倍SMINS-MEF-7细胞(图所示和补充表)。切口(23,24],Wnt [25],BMP [26,27),嘘28已知)信号通路调节NSC属性。在调节基因,Dll1,Notch2,Hey1,和Pou3f3参与的信号通路,嘘嘘的信号通路Bmp2和Bmp15BMP信号通路。表达下调的基因,Hey2和Heyl参与的信号通路,木钉在BMP信号通路民主党Wnt信号通路。十个基因包括Notch2,嘘,和Fgf2在SMINS-MEF-7调节相比,本机NSC(图和补充表)。

确认multipotency股市的细胞,我们执行在体外分化化验。SMINS-MEF-7细胞能够自发分化为星形胶质细胞(GFAP-positive细胞,%),神经元(Map2-positive细胞,%),或者少突胶质细胞(O4-positive细胞,%)(补充数据,,)。此外,SMINS-MEF-7细胞能够表达成熟神经标记VAMP2和NeuN成熟神经元的分化培养基(图)。这些结果表明,像原生NSC,股市细胞多能干细胞在体外。

3.2。股市细胞可以从Tail-Tip获得成纤维细胞(TTF) 3小分子的结合

接下来我们检查这对股市的生成小分子是重要的细胞通过撤军的个人小分子组合。我们发现小分子Bix01294 RG108, PD0325901感应的发生很重要。进一步确认协议的有效性获得股市细胞来自成纤维细胞,消除潜在的污染来自烹饪和神经嵴干细胞,我们孤立TTF从成年老鼠尾巴被剥夺了皮肤。为了进一步消除可能的神经嵴细胞的污染TTF, TTF和我fluorescence-labelled抗体按流式细胞仪。只有0.1% TTF细胞p75-positive细胞3通道后(补充图)。只有p75-negative TTF细胞用于感应。MEF一样,TTF也强劲形式neurospheres经过6周期的感应协议与这三种小分子、Bix01294 RG108,和PD0325901。这些股市(SMINS-TTF-3)细胞类似于本机NSC在形态学数据1(一)和1 (b))。Sox2 SMINS-TTF-3细胞也表达了NSC标记,巢蛋白和高山(数字1 (c)- - - - - -1 (d)和补充图)。接下来我们测试NSC基因的表达通过逆转录PCR (rt - PCR)。包括SMINS-TTF-3细胞表达NSC标记基因Sox2,GFAP,Olig2,和Gli2(图1 (e))成纤维细胞相比,它并没有显示这个表达式。类似于NSC, SMINS-TTF-3细胞不表达多能性基因Oct4和Nanog(图1 (e))。此外,SMINS3细胞没有显示多能标记Oct4 ICC(补充图)。最后,我们执行在体外分化化验。SMINS-TTF-3细胞能够分化为星形胶质细胞(GFAP-positive细胞,%),神经元(Map2-positive细胞,%),或者少突胶质细胞(O4-positive细胞,%)(图2)。此外,SMINS-TTF-3细胞能够表达成熟神经元标记Vamp2和NeuN成熟神经元的分化培养基(图3(一个))。检查是否股市细胞包含馈线,股市细胞后通过5为纤维母细胞染色Alpha-tubulin标志。我们没有找到任何Alpha-tubulin阳性细胞在股市细胞(补充图),这表明股市没有支线细胞污染的细胞后诱导。

3.3。股市细胞可以分化成神经元功能

接下来,我们检查是否股市细胞可以分化成神经元功能。细胞分化SMINS-TTF-3显示积极的成熟神经元标记(图3(一个))。此外,一小部分显示一个独特的表型分化SMINS3细胞类似于成熟的神经元。电生理分析证明−静止膜电位mV (在这些细胞含有快速灭活内Na⁺电流除了慢慢灭活外K⁺电流(图3 (b)和3 (c))。动作电位是自发的或在这些细胞能够唤起注入电流脉冲注入(图3 (d))。大多数neural-like分化细胞表现出不同的表型,用更积极的静止膜电位,只有K⁺式向外电流没有向内Na⁺电流或诱发动作电位(补充图)。这表明股市细胞能分化成神经元功能。

3.4。股市细胞可以分化的神经细胞谱系在活的有机体内

评估是否股市细胞能够存活并分化成神经细胞谱系在活的有机体内,SMINS-TTF-3细胞被标记与绿色荧光蛋白(GFP)慢病毒EGFP向量,并移植到侧脑室的裸体幼崽。只有少数GFP⁺细胞被Sox2(图4(一))和Ki67(图4 (b))积极在移植后6周,这意味着几乎所有的股市细胞分化的神经细胞谱系在活的有机体内。GFP⁺细胞从侧脑室与长途迁移到实质,并结合宿主脑组织(补充图)。此外,股市细胞阳性星形胶质细胞标记GFAP(图4 (c))、神经标记Map2和NeuN(数字4 (d)和4 (e)),和少突细胞标记Olig2(图4 (f))。这些数据表明,股市细胞能够分化的神经细胞谱系在活的有机体内。

3.5。感应效率

很难计算感应因为特殊的感应过程的效率。没有殖民地出现下降之前暂停的文化。每一滴水暂停后形成一个殖民地文化。所以我们计算有多少细胞形式每下降一个殖民地。我们发现的最小细胞数量是50,形成一个殖民地。因此,感应是高达2%的效率。2%是一个相对的诱导效率与悬浮培养细胞方法部分中描述。感应效率的更好的方法是使用感应Sox2-EGFP成纤维细胞的未来。

3.6。Feeder-Free SMINS3 (FF SMINS3)

股市细胞含有支线细胞最初的几个段落,将来会影响国家安全委员会应用程序。我们试图把馈线与一些菜基质细胞。这是发现poly-D-lysine (PDL)可以取代支线细胞在诱导。此外,诱导细胞形成的殖民地自由人民党在诱导过程中,因此,馈线自由协议不需要执行暂停下降集落形成的文化。的feeder-free SMINS3 NSC标记巢蛋白阳性,Sox2(图5(一个))。此外,这些细胞能够分化为星形胶质细胞(图5 (b)),神经元(数字5 (c)和5 (d)),和少突胶质细胞(图5 (e)在特定的分化培养基。所有这些数据表明feeder-free SMINS3 NSC。

4所示。讨论

重编程体细胞iNSC使NSC治疗可行。iNSC也有巨大的价值作为疾病发病机理的模型,药物筛选,和毒性测试。虽然可以生成NSC的ESCs或iPS (29日,30.),还有道德和安全问题,当这些细胞被用于细胞疗法的患者(30.- - - - - -32]。为了克服这些问题,一些科学家已经成功地诱导体细胞通过overexpressing iNSC转录因子(1- - - - - -5]。然而,他们都使用病毒载体引入转录因子基因进入宿主细胞,NSC疗法上的安全问题。此外,原癌基因致癌基因会导致大脑肿瘤发生从ips的衍生NS细胞移植4]。我们的研究表明,小鼠成纤维细胞可以有效地诱导成NSC仅使用小分子。这是第一个报告,可以从成纤维细胞诱导多功能干细胞不使用任何外生转录因子。在我们的实验中,股市细胞通过两年多来,仍然继续增殖附加或暂停文化。因此,股市细胞能够形成稳定的细胞系对干细胞疗法。我们的研究取得了一个重要的一步向定制个性化的治疗神经退行性疾病及其他神经系统疾病的病人,我们的方法可以消除有害的担忧基因组整合由病毒转导向量或致癌转录因子的引入。因此,这些股市细胞可能有直接的潜在神经系统疾病的临床治疗。

关注的一个问题是股市的起源来源细胞MEF和TTF。我们使用两种方法来消除可能的神经嵴污染。通过流式细胞仪方法,只有0.1% TTF细胞3通道p75-positive后。这些阳性细胞是最有可能来自p75-positive雪旺细胞或血管细胞,如内皮细胞和平滑肌细胞33]。其次,烹饪和神经嵴细胞被脱掉了TTF准备前的皮肤与酶消化。的诱导效率是2%,不太可能,股市p75-positive神经嵴细胞的细胞,它只占0.1%,并非用于流式细胞仪后的感应。综上所述,这些研究结果不支持神经嵴细胞的假设作为股市的原始细胞。要考虑另一个问题是是否股市细胞经过多能阶段。根据目前的数据,Oct4和Nanog表达在股市细胞不能被检测到。因此,我们的数据不支持这个概念。然而,我们推测,股市细胞可能通过部分多能阶段时,成为NSC NSC培养基中培养。

虽然重编程的机制仍然是未知的,这是有关DNA脱甲基,组蛋白脱甲基,乙酰化作用[34- - - - - -38]。的小分子,如VPA(组蛋白脱乙酰酶抑制剂),BIX01294 G9a (HMTase抑制剂)和RG108 (DNA甲基转移酶抑制剂),能增强重组。它是合理的重组成纤维细胞NSC在适当的条件下,这些小分子。据报道,MEK抑制剂PD0325901可以抑制MAPK / ERK信号通路促进小鼠ESC自我更新(11,13,14]。我们的数据也支持该报告,鼠标多能干细胞分化neuroectoderm通过阻断MAPK / ERK信号通路(39]。此外,我们的研究表明,信号通路如切口,嘘,BMP, Wnt很可能参与了这些小分子的成纤维细胞重编程。在未来这将是有价值的理解小分子影响每一个级距,嘘,BMP, Wnt通路。股市细胞也可能提供一个新颖的模型研究体细胞重编程的机制的成体干细胞。此外,它仍然未知是否这些小分子可以诱导人类成纤维细胞NSC。

利益冲突

没有利益冲突。

作者的贡献

周复新Yan-Chuang汉族人和构思的想法和设计实验。Yan-Chuang汉执行大部分的实验和写论文。Yoon Lim和李华进行rt - pcr实验。刘贾构建慢病毒载体和建造EGFP细胞株;Nimshitha Pavathuparambil Abdul Manaph杨和苗族进行细胞培养,流式细胞仪,并执行一些免疫细胞化学。Michael d . Duffieldl表现并分析了电生理学实验。达米安·j·基廷构思的电生理学实验,分析了电生理数据,修订。周复新监督项目和修订。

确认

作者感谢帕特里克•Falckh和西蒙·布鲁克斯的批判阅读纸和所有实验室成员的有益的讨论在研究过程中。这项研究是由NHMRC澳中培训奖学金(不支持。535093),NHMRC授予(没有。595937年),和南澳大利亚大学的专项基金。

补充材料