在活的有机体内跟踪系统进行同种异体骨髓间充质干细胞在正常大鼠通过生物荧光成像

文摘

最近,越来越多的间充质干细胞(msc)作为灵丹妙药多种类型的疾病有效的治疗。许多发表的临床试验证明msc的非常积极的治疗效果。然而,当一个特定的代理,但是很少有研究关注msc的动态分布在活的有机体内管理。在这项研究中,我们跟踪系统移植同种异体骨髓间充质干细胞(bmsc)在正常大鼠通过实时荧光成像(BLI)。体外器官成像,免疫组织化学(包含IHC)和rt - pcr进行验证bmsc的组织学分布。我们的研究结果表明,bmsc的背侧皮肤除了肺和肾脏尾静脉注射后,不能检测到14天后。同种异体bmsc主要不是薄壁组织的器官而是出现皮下结缔组织和脂肪组织在健康老鼠。没有明显MSCs-related除了瞬态中性粒细胞减少的不利影响。这些研究结果将为更好的理解提供实验证据bmsc的biocharacteristics。

1。介绍

间充质干细胞(msc)是自我更新,多能祖细胞分化成多种中胚层细胞系的潜力。许多动物模型展示了非凡的热带,nonimmunogenic,免疫抑制这些细胞在受伤组织的特点1,2]。由于其性能的可访问性和方便的扩张,临床研究msc增加了在过去的20年中。msc被描述为一个有前途的来源的细胞治疗各种复杂的疾病,如移植物抗宿主病(3,4),心脑血管疾病(5),脊髓损伤(6,7),肝脏疾病(8),和呼吸道疾病9,10]。虽然有关于达成共识在体外msc的特点,突出问题msc的本地化和持久性在活的有机体内后管理。此外,这些外来细胞注射安全是另一个主要障碍在临床设置。

生物荧光成像(BLI)检测细胞发出的可见光发光酶标记,荧光素酶等,这些酶的反应与他们特定的发光底物(11]。BLI可以无创跟踪luciferase-transduced细胞植入动物生活在真正的时间。这种方法的实质效用已经促进了设计使用msc在各种动物模型的治疗策略,包括肿瘤的疾病模型,缺血reperfusion-induced急性肾损伤(AKI),心肌损伤、中风和其他疾病(12- - - - - -15]。然而,可见光在组织渗透的深度是有限的。因此,这种技术主要用于成像的小动物,如老鼠。在这里,我们表明,生物荧光成像可以显示动态信息详细的分布和取向bmsc的大鼠模型。更有趣的是,我们发现的归航器官bmsc的老鼠不一样的老鼠。此外,我们进行了安全评价的bmsc的组织学和血清学试验,以提供一个使用这些干细胞的实验基础研究。

2。材料和方法

2.1。慢病毒载体和BMSC转导

骨髓msc是孤立的正常Wistar鼠从Cyagen购买生物科学。根据最小标准国际社会提出的细胞治疗(ISCT) [16),细胞受到流式细胞术检查特定的表面抗原的表达(图S1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/3970942)。bmsc显示一个典型的MSC形态,表现出一个呈形状或平面多边形的外观。他们塑料附着和维护组织培养瓶。当bmsc汇合的大约80到90%,他们分离trypsin-EDTA和分裂1:2的比例。

的culture-expanded bmsc被播种在six-well盘子1×10的密度⁵细胞每口井。24小时后,中被删除,取而代之的是生长介质和聚凝胺溶液(1毫升每口井)。聚凝胺添加在最后一集中5μ克/毫升。慢病毒载体表达GFP和荧光素酶基因(从GENECHEM购买,中国上海)解冻并添加的感染复数4。8 h的孵化后,介质被新的取代介质,瓶是回到了孵化器。三天后,量化转导效率,Luc-GFP-BMSCs沾染了赫斯特33342年(FANBO,北京)5分钟。然后,细胞可视化和分析使用一个倒置荧光显微镜(DMI 3000 b、徕卡、德国)在五个随机选择的领域的观点。

2.2。Multilineage分化Luc-GFP-BMSCs

Cultured-expanded Luc-GFP-BMSCs通道6被用来评估在体外分化能力的细胞按照制造商的建议(美国Cyagen生物科学)。脂肪形成的感应,Luc-GFP-BMSCs subculture-expanded six-well板块在2×10⁴细胞/厘米²生长培养基中含10%胎牛血清和5% penicillin-streptomycin以及谷氨酰胺。这些细胞被美联储confluency每三天,直到他们达到100%。然后,生长介质改为2毫升的感应中,其中包括胎牛血清,penicillin-streptomycin,谷氨酰胺,胰岛素,罗格列酮和地塞米松。三天后,媒介被维护中含胎牛血清,取代penicillin-streptomycin和胰岛素。24小时后,介质被改变回感应介质,感应/维护的周期重复了三次。经过五周期的感应/维护,在维护培养基培养细胞的一个额外的三天。三个星期后,脂肪细胞被染色后观察油红o .诱导成骨分化,Luc-GFP-BMSCs被播种在生长介质的密度3×10⁴细胞/厘米²一天在37°C公司5%₂湿润孵化器。然后,生长培养基从每个吸气和2毫升的成骨分化中含胎牛血清,penicillin-streptomycin,谷氨酰胺,抗坏血酸盐,β添加了甘油磷酸盐,地塞米松,媒介是改变每三天。三周后,这些细胞被固定为2毫升4%的甲醛溶液和茜素红染色。

2.3。动物

成年雄性Wistar鼠称重g是由军事医学科学院实验动物中心的中国人民解放军。老鼠的温度保持在一个动物实验室25°C,美联储与商业啮齿动物食物和免费的水,和被允许适应一个星期。所有的动物获得了人道关怀的遵守指导实验室动物保健和使用的由美国国立卫生研究院出版。研究实验动物伦理委员会批准的协议的附属医院,中国人民武装警察部队后勤学院。

2.4。在体外成像

评估转导bmsc的荧光素酶的表达,不同数量的Luc-GFP-BMSCs(0.1, 0.2, 0.3, 0.4,和0.5×10⁴/)被播种到100年的96孔板μL生长介质,D-luciferin解决方案(D-luciferin, 150年μg / mL,黄金生物技术公司,美国)在室温下添加。10分钟的孵化后,使用一个细胞成像在活的有机体内成像系统(新)(美国IVISSPE PerkinElmer)。生物荧光信号进行了分析使用生活图像软件4.5。

2.5。在活的有机体内成像的Luc-GFP-BMSCs

Luc-GFP-BMSCs (2×10⁶)悬浮在1毫升的磷酸盐(PBS)注入大鼠的尾静脉,这组标记Luc-GFP-BMSC移植组(Luc-GFP-BMSCs集团)。磷酸盐仅被用作控制。为在活的有机体内成像目标细胞,老鼠与2%戊巴比妥钠麻醉(50毫克/公斤)和腹腔内注射D-luciferin(150毫克/公斤体重)10分钟前成像。然后,动物被放置在成像室。在活的有机体内BLI执行在1.5,2.5,18日和22 h和1,2,3、7、10、14、Luc-GFP-BMSC注入后30天。感兴趣区域(roi)使用生活手动绘制图像4.5软件(卡尺生命科学)发出的相对信号强度进行评估。光子辐射的实验动物表示为光子每秒每平方厘米每球面度roi。动物被成像的一个月,之后,他们牺牲了,他们的组织被收获PCR和包含IHC分析。

定位细胞归巢视觉,收购后立即注射四天后,摄影图像在活的有机体内,五个动物被牺牲了。的皮肤,脊柱,和其他器官被移除,放置在培养皿中。BLI Luc-GFP-BMSCs组织进行识别。然后,组织显示BLI信号固定在4%多聚甲醛进一步包含IHC分析。

2.6。免疫组织化学

验证的组织学分布Luc-GFP-BMSCs移植后,组织固定在4%多聚甲醛是脱水和嵌入在石蜡。石蜡包埋的5μ米准备在poly-L-lysine-coated幻灯片根据标准协议。幻灯片是孵化与anti-GFP抗体(Abcam、伦敦、英格兰)稀释1:50 PBS一夜之间在4°C。为初级抗体检测,一只老鼠免疫组织化学(ABC)工具包(ZSGB-BIO,北京)使用。部分是沾一点装备。用苏木精复染色了。GFP-positive光显微镜下细胞被算在六个大功率领域三个部分和得分基于是否组织相关。

此外,我们发现通过包含IHC GFP-positive细胞在组织验证的先进的组织学分布Luc-GFP-BMSCs在移植后的一天。

2.7。rt - pcr

提取总RNA PCR与RNeasy工具包(Solarbio科技,北京),包括DNase消化步骤排除污染的DNA。使用定量逆转录执行脚本工具(TIANGEN生物技术,北京)1 h在37°C。目标基因的引物序列如下:萤火虫luciferase-F: ACTGGGACGAAGACGAACAC和萤火虫luciferase-R: GGCGACGTAATCCACGATCT。PCR进行相对量化的目标基因拷贝数的关系β肌动蛋白成绩单。

2.8。血液采样

检查系统性应对野生型BMSC移植、血液收集麻醉大鼠下腔静脉的一天(天集团;),四天(为期4天组;),或者一个月(月组;)野生型bmsc移植后。只与PBS对照组,注射(对照组;)检查。血清浓度的血液尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)使用自动干化学分析方法测定(体外5600集成系统,约翰逊,美国)。血常规测试进行了测量与自动血液分析仪(SYSMEX xn - 1000、日本)。

2.9。组织病理学评价

从天收集的组织样本,为期4天,月组固定在10%福尔马林,随后嵌入在石蜡后标准的方法。部分的厚度5μm是切割和安装在玻璃幻灯片,然后deparaffinized。最后,幻灯片被苏木精和伊红染色())。幻灯片重新标记使用阿拉伯数字,其次是双盲检查两个病理学家。

2.10。统计分析

所有提交的数据表示为平均值±标准偏差(SD)。使用SPSS 22.0版进行了统计分析。区别不同群体使用学生的检查以及和方差分析。值< 0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。转导的bmsc

bmsc孵化在six-well板1×10⁵感染后细胞/ 24小时,4×10⁵Lenti-Luc-GFP-lentivirus粒子(MOI = 4)。经过3天的孵化,转导效率大约是76.45%,作为荧光显微镜(图评估下1(一))。转导bmsc与野生型之间没有区别bmsc的形态。GFP的表达是稳定不变的文化条件下至少60天。

3.2。在体外描述多能的能力

确认multilineage Luc-GFP-BMSCs的分化能力,Luc-GFP-BMSCs分化成细胞的能力显示脂肪形成的和骨量减少模式进行了研究。Luc-GFP-BMSCs通道6可以分化成脂肪细胞,证明了油红O染色(图1 (b)),成骨细胞,通过评估茜素红染色(图1 (c))。此外,分化的细胞仍稳定表达GFP(数字1 (b)和1 (c))。

3.3。在体外成像

荧光素酶的活性是通过生物荧光成像评估(BLI)(图1 (d))。如图1 (e)不同数量的细胞的成像在体外揭示BLI信号和细胞之间的线性相关数字(),这表明报告基因可以用于跟踪和量化的bmsc移植小动物生活。

3.4。动态分布的bmsc监控新系统后政府在正常大鼠

接下来,我们注入Luc-GFP-BMSCs成正常Wistar鼠通过尾静脉注射,然后动态地监测生物荧光成像的荧光素酶活性的新。如图2,劳保局图像结果表明bmsc送到完全免疫活性的同种异体主机主要居住在肺部和下背部区域(数据2(一)和2(c))。肺部BLI信号下降随着时间的推移,在注射后三天缺席在活的有机体内。在仰卧位和成像位置,我们发现bmsc尾静脉注射后迁移到背部。有两个峰劳保局信号在背部,静脉注射后在24小时和7天。成像信号下降随着时间的推移,完全没有移植后14天(数字2(b)和2(d))。一个月后,我们仍然没有找到任何动物的信号。

3.5。bmsc移植的组织分布

评估Luc-GFP-BMSCs的分布在注射后不同器官,我们给老鼠注射D-luciferase腹腔内和孤立各种老鼠的器官,包括肺、肾脏、心脏、肠、肝、背部的皮肤,脊柱,Luc-GFP-BMSCs脾静脉注射后4天。在这些器官BLI信号进行了评估,结果表明,积极的信号中检测到肺、肾脏、和皮肤的正常大鼠(数据的支持3(一个)和3 (b))。

此外,我们发现GFP-positive细胞器官表现出BLI信号通过免疫组织化学验证Luc-GFP-BMSCs的先进的组织学分布。包含IHC进行肺、肾和背侧皮肤组织。在Luc-GFP-BMSCs移植后一天,GFP-positive细胞被发现在血管和肺泡之间的连接区域。尽管仍有BLI信号检测在肺孤立在注射后4天,IHC结果表明,阳性细胞主要是位于结缔组织和脂肪组织的门pulmonis,但不是肺(图3 (c))。同样,bmsc是位于肾门的结缔组织和脂肪组织,而不是肾实质。在皮肤组织,GFP-positive细胞主要出现在皮下结缔组织和脂肪组织(图3 (c))。与BLI结果一致,最大数量的GFP-positive肺部细胞被发现在一天后注入(图3 (d)),四天后,GFP-positive背皮肤细胞的数量大于在其他器官(图3 (e))。rt - pcr结果还验证Luc-GFP-BMSCs在上面的器官组织的存在:肺、肾脏、皮肤(图3 (f))。此外,一致在活的有机体内特定器官的成像结果,BMSC殖民被rt - pcr和包含IHC检测(未找到数据4(一)和4 (b))。

3.6。安全性评价

没有死亡发生在实验小组,呼吸困难的临床症状没有出现在整个实验。形态学分析未能发现任何肿瘤或肿瘤的动物。他染色证明没有天MSC归航器官发育不良,为期4天,月组(图5)。此外,如表所示1没有显著差异,肾脏和肝脏的生物标记()实验之间的组织和控制。血常规检查后证实白细胞计数减少,尤其是中性粒细胞(),导致淋巴细胞的比例(相对增加)在为期4天的集团与控制。然而,一个月后,中性粒细胞计数恢复正常,没有明显不同(表比控制2)。

4所示。讨论

细胞疗法目前预计将提供治疗各种疾病的短期有效的常规疗法在临床的设置(17]。在临床实践中,免疫反应,完美的供者细胞是自体(13]。然而,自体的细胞有明显的缺点。例如,在血液或免疫系统的疾病,患者自己的细胞不适合应用程序。由于显示低表达的免疫抗原,同种异体msc是一个有吸引力的细胞资源为各种复杂、难治性疾病(18]。本研究采用同种异体细胞,我们选择静脉注射移植途径密切模仿临床设置,这条路线是常用的人类。

有争议的导航功能系统综合管理。命运的bmsc活体动物和许多因素有关,如它们的起源、细胞的数量和交付路线。跟踪研究已经证明,人类或过敏bmsc移植最初居住在肺部,然后出口到肝脏和脾脏在SCID小鼠19,20.]。Eggenhofer等人发现过敏小鼠bmsc没有迁移后除了肺部静脉输液(21]。bmsc的差异分布在这些研究可能与细胞的起源,宿主动物类型,应用检测方法。与上述研究不同,我们过敏bmsc注入正常大鼠(一个更大的动物主题)。我们的研究结果表明,大多数的bmsc本地化到肺部,肾脏和疏松结缔组织的上皮细胞下后尾静脉注射。根据先前的研究,大量的IV-injected bmsc被困在第一过滤器官丰富的毛细血管因为暂停bmsc的平均大小是大于毛细血管的22]。在这项工作中,我们发现bmsc是倾向于接受被动聚集在肺和肾脏系统注入后,但是归航的上皮细胞可能是一个活跃的现象。bmsc不是循环细胞,必须附着在细胞外基质为生存和增长。因此,当这些细胞被退出这种情况下,他们可能被跟踪使用某些细胞外matrix-derived生存信号。关于他们的二次分配,bmsc主要集中在疏松结缔组织和脂肪组织上皮细胞。即使在肺和肾脏,他们并没有出现在薄壁组织,但在门的结缔组织和脂肪组织pulmonis和肾门在注射后4天。

通过从仰卧位和俯卧姿势,我们首先发现背皮肤是另一个器官吸引msc。包含IHC试验表明,Luc-GFP-BMSCs位于背侧皮肤的疏松结缔组织。考虑到bmsc容易分化成脂肪细胞在体外,我们假设企业综合管理是由信号的脂肪细胞和细胞外基质疏松结缔组织方便bmsc穿过和增殖。不同的肌肉组织(心脏和骨骼肌)疏松结缔组织有更多空间,可能适合居住的msc。此外,真皮成纤维细胞分泌基质细胞衍生因子- 1,一个关键的趋化因子的新兵循环通过SDF-1 mscα/ CXCR4途径[23,24]。原因的bmsc的选择性招聘背侧皮肤,我们不能给出一个确切的解释,这可能需要进一步的研究来回答这一现象在我们的研究。

以前,人们认为msc修复受损组织通过分化转移机制(25),和有针对性的运送路线的细胞因此受伤的器官是必不可少的有效疗法。这些细胞也通常被认为是一个著名的地标的所有形式的细胞疗法的进步。导致骨髓间充质集中在更多的受伤的组织,研究人员尝试不同的喷射策略,导致延误msc的其他目标过滤器官。然而,持续的嫁接和移植msc分化在活的有机体内很少被发现。许多调查人员发现,移植msc显示短生存在活的有机体内,他们对疾病产生相当大的影响,不依赖于细胞归巢目标器官的数量(26,27]。的生命移植msc在活的有机体内太短,解释的重要功能改进梗塞的器官的分化。因此,MSC行政管理路线似乎没有在临床应用中一样重要。因此,通过静脉注射可能就足够了。

我们的数据使用BLI从BMSC移植生存的后续研究表明,伴着无法长期生存。这些结果类似于先前的研究。有三种可能的解释观察到的企业综合管理的本地化。(1)间充质细胞粘附细胞外基质产生张力的完整性,这是一种生理细胞细胞分化过程是必要的,生存和增长。相比之下,在血液管理和悬架后,msc失去cell /矩阵相互作用,这将导致程序性死亡。这种类型的细胞凋亡被认为是女性(28]。我们认为,女性可能扮演重要的角色在msc的消失在这种情况下,因为msc不是循环细胞生存和需要细胞外matrix-derived信号,和脉管系统的剥夺这些信号可能诱发女性。(2)在目前的研究中,我们采用免疫活性的老鼠没有免疫抑制药物的应用在整个实验。先天免疫系统,负责移植细胞的清除,可能激活同种异体msc。一些研究者认为,msc本身不会引起免疫反应,但胎牛血清(的边后卫),这是广泛应用于细胞培养,不能删除使用磷酸盐,刺激免疫原性(29日]。在临床环境中,为了避免这种风险,应考虑采用自体血清,人们已经发现,人类血清自体msc的结果更多的快速扩张(30.]。(3)肾脏代谢器官有丰富的血液流动。众所周知,许多药物的排泄与肾脏功能密切相关。我们的数据表明,bmsc移植肾脏,然后从这个器官消失。另一项研究[31日)提供直接证据,1%的bmsc出现在肾小球和管周毛细血管TUNEL阳性。在一起,这些发现表明,这个过程可能导致数量下降的bmsc后管理。持续的消耗非常小的细胞的数量最终导致所有细胞的消失。然而,在这项工作,而不是肾小球毛细血管,我们发现bmsc管周毛细血管周围的疏松结缔组织。它是未知的,如果这种情况偶尔发生或与不同的采样时间。可能是肾代表一个次生代谢途径,但并不是主要的。因此,大,随机、安慰剂对照进行临床前动物试验需要解决的问题在msc。

目前的研究还调查了短期和中期同种异体BMSC移植的安全性。与药品不同,我们无法生产msc完全遵守实验室的有关规定32]。然而,我们做了所有可能的BMSC移植后试图避免潜在的不良事件,例如细菌污染,使用细胞不到60天的潜伏期和不超过10通道文化。实验群体随访后一天,四天,一个月,所有的动物表现出缺乏肿瘤发生和受伤的组织。组织学分析实验小组表明,所有的动物都没有显示任何增生或组织炎症。实验组之间没有显著差异和控制的肾脏和肝脏的生物标记。尽管注入msc被发现导致减少中性粒细胞计数在注射后4天,样品尺寸太小,不足以得出明确结论是否同种异体BMSC移植导致白细胞计数减少。然而,我们认为应该小心,因为观察到的现象,和大样本的统计分析与MSC-based疗法相关的血液细胞计数数据需要评估未来的长期安全。

总之,我们的结果表明,系统管理的综合健康老鼠是短暂的和主要转移到肺部,肾脏,背部的皮肤。有趣的是,在组织学分析,综合显示亲油性。他们在脂肪组织,收集和少量位于血管周围的疏松结缔组织的门pulmonis和肾门。这种分布格局的原因并不完全理解。安全评价未能发现任何副作用的动物在短时间内。因此,bmsc可能是一个理想的细胞疗法在临床前动物实验和候选人,随后,临床试验,但长期随访安全评估是必要的。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(81202105,81202105)和天津科技项目(14 zcdzsy00033 15 jcybjc28500, 13 jcqnjc12900 - 2013)。

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