文摘

背景。骨组织工程支架(耳背式)可以装载不同来源的干细胞和祖细胞(SPC)来改善骨生成。SPC在骨髓,脂肪组织和其他组织。对脂肪细胞的成骨的潜在文化扩张,贴壁细胞(A-CEAC)。本研究比较在活的有机体内A-CEAC和骨髓衍生文化之间成骨的能力扩大,贴壁细胞(BM-CEAC)。方法。A-CEAC和BM-CEAC隔绝五女羊和播种前羟磷灰石颗粒在免疫缺陷小鼠皮下植入。剂量的细胞在植入0.5×10⁶,1.0×10⁶,或1.5×10⁶A-CEAC和0.5×10⁶分别BM-CEAC。八周后,骨体积与组织总量(BV /电视)使用histomorphometry量化。新骨是评估使用人类起源波形蛋白抗体染色(HVIM)。结果。BM-CEAC BV /电视产生了显著高于任何A-CEAC集团和A-CEAC组之间的差异没有统计学意义。HVIM抗体染色成功用于识别羊细胞在这个模型。结论。A-CEAC BM-CEAC能够形成骨骼,BM-CEAC BV /电视产生了显著高于任何A-CEAC组。在体外治疗提高成骨能力A-CEAC建议进一步研究绵羊的骨组织工程。

1。介绍

在骨科和颅面外科手术,重建骨缺陷从创伤、肿瘤、感染、松动假体组件,或外科手术提供了一个医学的挑战。与骨移植治疗骨缺损历来援助治疗,目前的黄金标准是自体髂骨移植(1]。自体是综合分析、论述和成骨的但与供应有限和捐助网站发病率(1]。同种异体移植物可以松质或皮质移植或软化骨基质。综合分析和论述,在大量和不与施主能级发病率相关。然而,同种异体移植物不是成骨和携带疾病传播的风险。的缺点动机自体和同种异体骨替代品的发展(1- - - - - -3]。骨替代品包括一个支架,通常含有钙或其他矿物质(4]。支架与细胞因子和细胞可以加载,提高骨生成和血管生成5,6]。

成骨细胞(骨细胞和成骨细胞)源自SPC,位于组织(7]。MSC是plastic-adherent SPC的子集在文化、可以分化成组织不同的血统,阳性标记CD105, CD73,和CD45 CD90和消极,CD34, CD14或CD11b CD79α或CD19 HLA-DR [8]。MSC可以接受分化成组织与组织无关,他们原本居住,MSC从一个组织可能是有用的在另一个极端,和MSC骨替代品不需要来自骨头和可能收获从脂肪组织7,9]。与骨髓相比,脂肪组织更容易检索,往往可以收获数量丰富,A-CEAC显示低水平的衰老,可以扩展到更高的段落在体外相比BM-CEAC [10- - - - - -12]。这使得脂肪组织的有吸引力的替代品,骨髓来源的程控骨替代品,只要A-CEAC成骨的能力比BM-CEAC类似或更好。许多研究探讨不同A-CEAC支架;然而,一些研究比较A-CEAC BM-CEAC对在活的有机体内骨形成能力很低,不同物种,细胞使用,表征方法,支架,模型,和定量评估,从而使直接比较困难(13,14]。BM-CEAC目前用于临床的设置(15]。

骨科研究羊是一个常用的模型有几个原因:骨骼大小足够大来执行复杂的骨科手术和医疗器械和生物材料测试;寿命短足以执行老年性骨关节炎和骨质疏松症等疾病的研究16];和他们的骨重建与人类的17]。很少有人了解A-CEAC耳背式。据我们所知,只有一项研究比较了绵羊的A-CEAC BM-CEAC对在活的有机体内骨形成;此外,比较了在一个原位环境18]。绵羊的A-CEAC和BM-CEAC尚未对异位骨形成评估内在成骨的能力,这将带来新的信息绵羊的A-CEAC。

本研究旨在探讨A-CEAC骨生成使用BM-CEAC骨生成基线。本研究的目的是使用皮下免疫缺陷小鼠模型(19)(1)评估的有效性A-CEAC骨形成,(2)之间的比较骨形成绵羊的A-CEAC BM-CEAC,和(3)比较不同剂量之间的骨形成A-CEAC看看播种A-CEAC进一步提高骨生成。此外,我们调查是否标记为人类波形蛋白(HVIM)可以用来识别绵羊的细胞植入,从而揭示细胞的起源。

我们假设A-CEAC可以形成新骨在这个模型中,A-CEAC可以形成新的骨BM-CEAC BV /电视一样,播种A-CEAC近改善骨生成,HVIM histomorphometry细胞可以用来识别羊。

2。材料和方法

2.1。研究设计

A-CEAC和BM-CEAC隔绝绵羊的脂肪组织或髂骨送气音,文化扩张,播种在羟磷灰石(HA)颗粒。老鼠被分为两组。在鼠标组1、颗粒播种BM-CEAC(表示BM-CEAC)植入在左袋,和颗粒播种A-CEAC(表示A-CEAC1)植入正确的袋。在鼠标组2中,颗粒被播种A-CEAC左袋和(A-CEAC2表示)为正确的袋A-CEAC (A-CEAC3表示)。老鼠和植入组如表所示1。图中概述的工作流1。

2.2。动物

五女羊(特塞尔绵羊/的哥品种,2 - 7岁)被收购为供体羊两个月前手术适应环境。

十四免疫缺陷(NOD.CB17 -/ J)小鼠(7 - 8周的年龄)从查尔斯河,获得Saint-Germain-sur-l 'Arbresle,法国,手术前一周。他们有免费消毒饲料(Altromin 1342鼠/鼠标、Brogaarden Lynge,是丹麦)和水。

本研究通过丹麦动物实验检查员(2012-15-2934-00704),遵循国家和机构的指导方针。

2.3。A-CEAC隔离和扩张

皮下脂肪组织是切除从左腰侧的羊。Analgosedation初始化与咪达唑仑(b·布劳恩医疗、外柯林斯、丹麦)1.0毫克/公斤与氯胺酮静脉输液和维护(Ballerup Intervet丹麦,丹麦)和咪达唑仑静脉输液在8:1比例,局部麻醉是通过使用利多卡因5毫升南卡罗来纳州。(Amgros,哥本哈根,丹麦)。通过皮肤小切口是,8克脂肪组织切除,切口封闭层。

A-CEAC隔离是如前所述[20.]。简单地说,脂肪组织是清洗和切碎的广泛。组织与0.35% II型胶原酶消化(沃辛顿、英国)37°C 60分钟,洗两次,透过100μm细胞过滤器获取单个细胞悬液。

血红细胞溶菌作用后,细胞在DMEM培养补充10%胎牛血清(的边后卫;penicillin-streptomycin Sigma-Aldrich,哥本哈根,丹麦),1% (PS;Sigma-Aldrich), 4毫米谷酰胺(Lonza,哥本哈根,丹麦)两个段落和汇集。

2.4。BM-CEAC隔离和扩张

从髂骨骨髓是吸气的供体羊如前所述[21]。吸入是密度梯度离心使用Histopaque™梯度(Sigma-Aldrich)获得单核细胞和Gibcoα的基本培养基培养10%的边后卫,Penicillin-Streptomycin-Glutamine 1%, 1%的1 M消息灵通的缓冲区,和1%的100毫米丙酮酸钠(所有Gibco产品)两个段落。细胞的解决方案在低温贮藏−80°C一个月直到支架制备。在复兴,细胞扩大如上所述一段和汇集。

2.5。克隆形成单位分析

克隆形成单位化验(CFU-f)进行测量的患病率在最初的骨髓干细胞和祖细胞吸入或脂肪组织样本7]。一个样品从每个骨髓吸入或脂肪组织间质血管分数被CFU-f化验前文化扩张。100000个细胞从骨髓吸入或10000细胞脂肪间质血管分数被播种在T80烧瓶内,介质改变7天后,CFU-f染色进行3天以后。集群至少50细胞被认为是殖民地。骨髓CFU-f样品,所有殖民地都计算在内。脂肪组织CFU-f随机抽样的样本统计分析表面,使用网格计算。

2.6。支架的制备

鼠标手术前一天,细胞被播种到脚手架颗粒在生长介质截止注射器如前所述[19]。支架是HA颗粒直径1.0 - -2.5毫米(ENGIPORE, Fin-Ceramica、斑鸠、意大利)的特点是高孔隙度相对于总量高达90%。

在播种之前,细胞使胰蛋白酶化和计算,适当的细胞的数量在300年被停职μL生长介质和装上无菌HA颗粒(描述19]。支架是孵化24小时(37°C, 5%的公司₂植入前)。

2.7。异位小鼠模型

四个植入皮下注射在每个鼠标根据以前的报告19]。手术那天,小鼠麻醉(100毫克/公斤氯胺酮(Ballerup Intervet Ketaminol 10日,丹麦),10毫克/公斤甲苯噻嗪(Rompun兽医、拜耳、德国)和异氟烷(巴克斯特,Søborg,丹麦)),根据表和支架放置在袋1。切口关闭,老鼠分开了7天,然后放置3 - 4人为一组,直到终止研究。

8周后观察,小鼠安乐死颈椎脱位,植入康复并放置在4%中性缓冲福尔马林48小时。

2.8。组织学和Histomorphometry

植入物在12.5%乙二胺四乙酸(EDTA;脱钙默克公司生命科学、Hellerup、丹麦)十天,嵌入在石蜡。三个串行部分削减100、200和300μm到植入总共九个部分。部分deparaffinized,沾haematoxylin-eosin(他),盲法,评价以随机的顺序相同的研究员。最好在每个解剖层次,这两个部分进行分析和平均。骨的体积(BV)、纤维组织(Fb.V),骨髓(Ma.V)和剩余颗粒(Gr.V)量化相对于组织总量(电视)使用stereological软件(newCAST™, Visiopharm,丹麦)。

中等水平的额外部分沾HVIM(热科学、克隆SP20,猫。没有rm - 9120)检测绵羊的细胞,与绵羊的HVIM显示交叉反应细胞。

2.9。统计分析和样本大小的计算

统计分析使用占据14 (StataCorp,大学城,德克萨斯州,美国)。正常和方差齐性,Shapiro-Wilk测试和列文的测试使用,分别。异方差的数据,我们使用了韦尔奇t以及评估两两组之间的差异。降低第一类错误的风险,显著性水平是减少使用Bonferroni调整。被认为具有统计显著性差异(对应于在Bonferroni调整成对比较4组)。

样本大小对植入物是根据计算(22]。接受错误的风险第一和第二类型设置为5%和20%,分别。最小的相关差异被设置为70%,标准差是基于现有的数据设置为58% (21]。这将导致11植入物,因此应该被包括在每组。每个老鼠携带2植入从2组,所以总共6老鼠应该被包括在每组。我们包括每组7只老鼠由于辍学和植入物迁移的风险,给每组共有14植入。

3所示。结果

平均CFU-f从所有的羊数为4.96%±9.52间质血管分数和骨髓吸入0.07%±0.02。

一些植入物迁移和合并与另一个植入在观察期间,被排除在外。剩余数量的植入物在每个A-CEAC组10,14 BM-CEAC组。

BV /电视,Fb。V /电视,Gr.V /电视,和马。V /电视如图2。显著提高BV /电视相比,BM-CEAC植入物被发现A-CEAC组。A-CEAC组相比,BM-CEAC组包含至少10倍BV /电视。A-CEAC组之间,0.5×10⁶A-CEAC BV /电视包含略高于其他A-CEAC组;然而,这种差异没有统计学意义。在所有样品,目前附近观察骨组织支架。样本中较低的BV /电视、纤维组织主导的地区毗邻残余颗粒。所有组织样本,除了一个来自A-CEAC3集团骨化和血管化的迹象。Gr.V /电视没有差别。BM-CEAC组包含更高的马。V /电视,既是红色和黄色的骨髓。代表性样本如图所示3(A-CEAC1图3(一个),A-CEAC2图3 (b),A-CEAC3图3 (c),BM-CEAC图3 (d))。

BM-CEAC样本(对应图3 (d))沾HVIM图可用4。样本的皮肤(图5(一个)肌肉(图)5 (b)),脂肪组织(图5 (c)),骨(图5 (d))从控制鼠标,以及一个植入细胞(图5 (e)与细胞(图)和一个植入5 (f))染色没有主要抗体,都对HVIM不利。负样本如图5。剩余的支架通常被连接到HVIM +组织(骨或纤维组织),并没有发现HVIM +组织地区没有残余颗粒。植入物在整个封装在HVIM−纤维组织,肌肉或脂肪组织,用树枝达到植入,有时分离地区HVIM +组织。所有骨骼组织渗透HVIM +细胞,骨细胞也都HVIM +。纤维组织是HVIM +或HVIM−。所有领域的骨髓HVIM−。HVIM +组织才发现残余颗粒有关。所有HVIM染色标本进行评估。我们没有区分红色和黄色骨髓。

4所示。讨论

我们旨在评估A-CEAC BM-CEAC内在在活的有机体内成骨的能力和选择不执行任何在体外植入前分化。我们选择的黄金标准内在成骨的能力在原位和异位骨形成模型模型,消除可能从驻留成骨细胞骨形成23]。这项研究表明可以诱导骨形成使用A-CEAC和BM-CEAC从羊,BM-CEAC形成明显比A-CEAC骨,播种A-CEAC近不改善骨生成,此外,对HVIM抗体染色可用于确定羊细胞植入小鼠。

国际社会细胞疗法(ISCT)提出一套最低限度的标准描述MSC (8]。没有达到这些标准。本研究中使用的细胞plastic-adherent但不区分不同的血统或按表面标记排序。Multilineage分化已被他人使用所示类似的隔离技术(18),表面和表面标记不被认为是相关的,相关表面抗原的抗体尚未验证的羊。细胞在这项研究中,使用引用A-CEAC和BM-CEAC文化扩张,获得使用一个类似的协议获得MSC (24- - - - - -26]。关于细胞特征标准在其他研究中比较内在成骨的能力A-CEAC和BM-CEAC之间(见表1),所有使用的依从性,大多数使用CD105 +, CD90 +、CD45−, CD34−,只有少数使用分化,没有履行总MSC ISCT[定义的标准8]。这表明缺乏标准化和定性和定量评估的文献,研究直接比较困难。

尽管BM-CEAC形成骨明显多于A-CEAC,一些骨头是存在于所有A-CEAC植入但从A-CEAC3组。分散在A-CEAC标本,多个领域的特点是低细胞密度和伊红染色比纤维组织被发现(见图的中心3(一个))。这些区域被认为是在这个分析和纤维组织不符合骨组织。似乎这些地区进行成矿研究的终止,和长期的观察期间可能会产生更多的骨头(27]。然而,长期观察期间在多大程度上影响骨是未知的。

区别BV /电视跨A-CEAC组不显著。略低BV /电视观察A-CEAC2和A-CEAC3团体A-CEAC1相比。初步调查这种差异将寻求识别细胞的数量与植入前颗粒。在这项研究中,细胞被播种在颗粒的假设所有细胞都坚持颗粒,这个假设没有得到证实。

我们不包括空(颗粒)对照组在这项研究。我们实验室曾表明,空控制包含少于0.2% BV /电视使用相同的支架和动物(21]。因此,配对设计空控制在每个鼠标每只老鼠基线osteogenesis-or空集团整体基线osteogenesis-would对本文提供的结果几乎没有影响。同时,骨细胞HVIM +,以及消极的面板图5所有骨组织被认为是绵羊的起源。

一些植入物迁移和合并与另一个植入物和被排除在外,A-CEAC组和植入物的数量低于我们的力量计算。而辍学在这个大小没有预期,我们不认为减少辍学将结果在一个不太重要的方向。

大量的研究相比A-CEAC BM-CEAC对骨形成(见表2)。异位成骨的能力比较2的研究。织锦等人相比人类A-CEAC BM-CEAC对磷酸三钙在免疫缺陷小鼠皮下注射8到12周。他们观察新骨更频繁地在BM-CEAC标本比A-CEAC标本(意义没有描述),他们观察新骨A-CEAC标本更频繁地比8周后(12周后27]。哈亚希等人相比,老鼠A-CEAC BM-CEAC HA磁盘上皮下注射6周,发现BM-CEAC形成骨明显多于A-CEAC评估μCT (28]。在组织学评估,哈亚希等人也在观察新骨BM-CEAC标本和没有A-CEAC标本。这两项研究利用类似的支架和皮下环境与当前的研究,这些研究和当前的研究显示比从A-CEAC从BM-CEAC骨形成。

原位成骨的能力也比较研究。乔等人创建了一个节段股骨缺损在老鼠和人类A-CEAC播种或BM-CEAC HA / TCP缸植入(29日]。12周后,显著提高BV /电视观察BM-CEAC相比A-CEAC评估μCT。传统的x射线显示无显著差异。康等人创建了一个节段半径相比,狗和缺陷A-CEAC和TCP脚手架上BM-CEAC 20周31日]。传统的x射线和histomorphometry显示组间显著差异。尼迈耶等人创建了一个节段相比,羊胫骨缺损A-CEAC BM-CEAC在矿化胶原支架26周(18]。评估常规x射线和histomorphometry, A-CEAC不如BM-CEAC BV /电视。这三个节段性缺损模型研究都显示,A-CEAC可能不如BM-CEAC当比较BV /电视。宫崎骏等人创建了一个脊柱融合模型大鼠使用人类A-CEAC或BM-CEAC胶原蛋白海绵(33]。8周后,μCT并没有透露A-CEAC和BM-CEAC团体之间的显著差异。温家宝对胶原蛋白等人利用人类A-CEAC或BM-CEAC凝胶在大鼠颅盖的缺陷(32]。8周后,没有发现显著差异之间A-CEAC和BM-CEAC组织评估传统的x射线。综上所述,一些证据宣布BM-CEAC优于A-CEAC关于骨形成能力,而另一些微不足道的差异。

BM-CEAC相比,A-CEAC可能不如在骨形成由于(1)更强的承诺nonbone形成细胞谱系或(2)不如新血管形成的属性。强骨形成细胞谱系的承诺可能会通过在体外分化,在支架植入前长期培养,转染或使用细胞因子释放支架。使用脚手架与官能团类似原生细胞外基质可能提供解决这两个问题(34]。澄清是否可以应用于骨羊A-CEAC替代品,进一步的调查A-CEAC的成骨的能力的提高是必要的。

这些结果不转化为临床有几个原因。本研究旨在回答研究问题相关的基础科学,因此需要更改两个物种和样本大小可翻译给人类。人类和猕猴之间的一些差异在成骨的能力已经被证明,人类和羊之间的差异,据我们所知,没有研究[35]。

5。结论

A-CEAC播种在HA颗粒BV /电视产生了显著低于BM-CEAC八周后在免疫缺陷小鼠皮下注射。这可能是由于强大的承诺比BM-CEAC A-CEAC nonbone形成细胞系。A-CEAC浓度为0.5×10⁶细胞产生较高BV /电视比A-CEAC 1.0×10⁶或1.5×10⁶,但这种差异没有统计学意义。人类波形蛋白抗体染色成功用于识别绵羊的细胞植入。因此,绵羊的细胞不需要预处理与识别标签技术在植入物在这个模型。A-CEAC和BM-CEAC能够形成骨骼,和骨组织被发现在所有组织学样品但从1.5×10⁶A-CEAC组。尽管A-CEAC能够形成新骨,一些在体外治疗提高成骨的能力是绵羊的骨组织工程中提出了进一步的研究。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者要感谢实验室技术员Gitte Reinberg和孤独的克里斯琴森援助,Fin-Ceramica(斑鸠、意大利)请提供支架,生物医学实验室的工作人员来处理和照顾动物。作者想表达真诚的谢意向丹麦委员会独立研究,医学科学(马里兰州DFF - 4004 - 00256),为资助这项研究。