文摘

人类诱导多能干细胞(hiPSC)提供了一个突破的方法,帮助克服伦理和过敏的挑战在应用神经干细胞(nsc)靶向癌症基因治疗。然而,tumor-tropic容量hiPSC-derived nsc (hiPS-NSCs)仍然还有很大的提升空间。在这里,我们试图促进hiPS-NSCs的肿瘤趋向性通过操纵的活动集群内生mir - 199 a / 214 hypoxia-stimulated参与调节的细胞迁移。我们首先开发了一个baculovirus-delivered CRISPR干扰(CRISPRi)系统,sterically封锁了E-box元素的子mir - 199 a / 214集群RNA-guided催化地死Cas9 (dCas9)。然后我们这个CRISPRi系统应用于hiPS-NSCs并成功地抑制mir - 199 a的表达- 5 - p, mir - 199 - a - 3 - p, microRNA基因簇和mir - 214。同时,目标相关的表达水平的监管hypoxia-stimulated细胞迁移,如HIF1A,满足,和MAPK1调节。进一步迁移化验表明,目标抑制mir - 199 a / 214集群显著增强的肿瘤趋向性hiPS-NSCs体外和体内。这些发现说明小说中的CRISPRi应用NSC-based tumor-targeted基因疗法。

1。介绍

过去十年见证了发展和应用神经干细胞(nsc)作为小说的基因传递载体靶向癌症基因治疗从基础研究到临床应用(1]。nsc成体干细胞,multipotency分化成神经元,星形胶质细胞,少突胶质细胞,在整个中枢神经系统三个主要神经血统。当脑部肿瘤存在,nsc能够通过大脑实质迁移到家里的肿瘤病灶,包括原始站点和远处转移网站(2]。这种tumor-tropic行为报道被趋化因子释放低氧刺激肿瘤通过信号通路如SDF-1 / CXCR4和HGF / c-Met [3]。在动物肿瘤模型,nsc的先天tumor-tropic财产已被广泛用于靶向治疗基因不仅脑瘤(4,5),但也给其他传播转移性系统性政府实体肿瘤(6- - - - - -8]。人类诱导多能干细胞的可用性(hiPSC)技术解决了nsc的伦理和过敏问题在临床应用9,10]。然而,进一步的体内研究表明人类的tumor-tropic迁徙能力iPSC-derived nsc (hiPS-NSCs)仍然还有很大的改善空间10,11]。

描述,mir - 199 a - 5 - p, mir - 199 - a - 3 - p, mir - 214,这是coexpressed mir - 199 a / 214的集群1号染色体上的负调节低氧诱导细胞迁移HIF-1的差别,通过对这些基因α和c-Met信号12- - - - - -15]。在我们之前的研究中,这些小分子核糖核酸中最丰富的小分子核糖核酸hiPS-NSCs [5,8]。因此,我们假设抑制mir - 199 a / 214集群可能对肿瘤低氧条件下提高hiPS-NSCs迁移。靶向抑制小分子核糖核酸可以通过很多方式来实现,如anti-miR寡核苷酸(AMOs), microRNA海绵,和基因敲除;然而,阿莫斯和microRNA海绵缺乏鲁棒性的短长度(~ 22元)成熟的小分子核糖核酸使他们更拒绝退化,和基因敲除技术困难和不可逆转的16,17]。因此,更多的经济、精确和有效的方法抑制微rna表达。

最近,经常聚集空间短回文的重复序列(CRISPR)系统已经开发成一个强大的工具为目标基因组编辑(18,19]。在此系统中,CRISPR-associated 9 (Cas9)核酸酶是由single-guide RNA (sgRNA) 20-nt指南组成的序列和一个辅助transactivating通过碱基对序列互补基因组特定位点引入双链断裂(双边带)。sgRNA目标站点的选择受到的要求一个“NGG”protospace相邻主题(PAM)序列3′末端。CRISPR系统可以用来抑制微rna表达引起循环的破坏区域,帽子处理网站,或Drosha处理网站在一个特定的microRNA基因(20.,21];然而,microRNA基因簇,它将需要设计一些sgRNAs目标每个基因。另外,microRNA基因簇可以淘汰CRISPR系统通过基因缺失或同源重组(人力资源)22,23];然而,基因缺失需要设计2 sgRNAs和人力资源需要构建一个额外的捐赠者向量。

扩大CRISPR工具包转录调节、催化地死Cas9 (dCas9)是由突变两种核酸酶域Cas9 [24]。这仍然可以引导到特定的基因突变位点sgRNAs但失去DNA分裂活动。系统可以利用导数sterically占领特定基因的启动子或基因的身体,从而阻止转录的招聘机械或转录的伸长,叫做CRISPR干扰(CRISPRi)。它将更方便抑制microRNA基因簇使用CRISPRi因为它需要设计只有1 sgRNA集群目标基因的启动子区域(20.]。此外,CRISPRi的抑制作用是可逆的。

这里我们试图抑制mir - 199 a / 214集群使用CRISPRi系统对肿瘤低氧条件下促进hiPS-NSC迁移。我们的数据表明,CRISPRi系统成功地抑制mir - 199 a的表达- 5 - p, mir - 199 - a - 3 - p,和mir - 214在hiPS-NSCs和显著提高他们的肿瘤趋向性体外和体内。

2。材料和方法

2.1。细胞重新编程和分化

人类nonintegrating iPSC (epi-hiPSC)生成和特征如前所述[25]。总之,oriP / EBNA1-based pCEP4游离向量(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)表达Oct4 Sox2, Klf4, L-Myc, Lin28 cotransfected 1×10⁶人包皮成纤维细胞(微孔,贝德福德,妈,美国)。细胞被镀上人工基底膜(BD,富兰克林湖,新泽西,美国)涂布10毫米盘和培养的成纤维细胞中。24小时后,介质取代N2B27中补充100 ng / mL bFGF和改变了每隔一天,15天。然后中取代mTeSR1介质(干细胞技术,温哥华,加拿大),每天变化。新兴的殖民地被选到新的扩张和表征Matrigel-coated菜肴。

nsc来自epi-hiPSC线和特征如前所述11]。总之,hiPSC殖民地被机械切割分离。然后,hiPSCs被分离成单个细胞悬液使用TrypLE游离酶表达(表达载体)和镀到0.1% gelatin-coated 6-well 1×10的密度板⁶每在NSC培养基培养,细胞,这是一个1:1的混合物DMEM / F12(表达载体)补充2% B27(表达载体),2毫米谷酰胺,50 U /毫升青霉素、50µ20 g / mL链霉素,ng / mL EGF (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),和20 ng / mL bFGF的表达载体。经过1个月的扩张,一个均匀的细胞群与典型双相NSC形态。

2.2。细胞培养

鼠标转移性乳腺癌细胞系4 t1是购自美国类型文化集合(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。4 t1-luc细胞系是购自卡尺(美国加利福尼亚州山景城)。4 t1和4 t1-luc细胞系维持1640年RPMI介质(Sigma-Aldrich)补充10%胎牛血清的边后卫,2毫米谷酰胺,50 U /毫升青霉素,50µ克/毫升链霉素。缺氧治疗,细胞培养在缺氧孵化室(干细胞的技术)充满了厌氧气体混合物94% N₂,5%的公司₂,1%的人啊₂。

2.3。碱性磷酸酶(美联社)染色和免疫染色

AP染色,细胞被固定为90%的酒精2分钟,洗了三次PBS和沾BCIP /电视台在黑暗中30分钟。疣状,细胞被固定在4.0%多聚甲醛20分钟,permeabilized 0.5% Tween-20 30分钟,潜伏在一夜之间主要抗体,并与二次孵化抗体(英杰公司)为1小时。细胞核被DAPI复染色。细胞倒置的共焦显微镜成像。本研究中使用的主要抗体OCT4 (Abcam 1: 500年,剑桥,妈,美国),巢蛋白(1:100年,微孔),GFAP(1: 500年,微孔)β微管蛋白3(1:500,微孔)。

2.4。CRISPRi建筑设计和向量

包含U6-Chimeric的片段和CBh-hSpCas9表达盒从pX330质粒克隆pFastBac1质粒。创建dCas9, D10A H840A突变引入的RuvC1和海航核酸酶域hSpCas9使用QuikChange多基因定点诱变工具包(美国Stratagene拉霍亚,CA)。由此产生的质粒被称为pFB / dCas9和用作模板来构建baculovirus-delivered CRISPRi系统。

搜索最优sgRNA CRISPRi目标站点,启动子区域的序列(357个基点−−1 bp)包含一个E-box元素mir - 199 a / 214集群从UCSC基因组浏览器(检索http://genome.ucsc.edu/)[26]。的候选人sgRNA目标站点覆盖E-box元素(CATCTG)筛选使用优化CRISPR设计(http://crispr.mit.edu/)[27]。选择sgRNA目标序列插入到pFB / dCas9质粒如前所述[28)和由此产生的结构被称为CRISPRi向量在下面。空pFB / dCas9质粒是用作控制向量。

Baculoviral向量携带CRISPRi系统或控制构造生产和传播在Sf9昆虫细胞根据Bac-to-Bac杆状病毒表达系统手册(表达载体)。hiPS-NSCs被转导与baculoviral向量在一夜之间感染复数NSC 100点状单位每个细胞的媒介。

2.5。qPCR

microRNA qPCR,小RNA孤立使用PureLink microRNA隔离设备(表达载体)和处理已经没有dna涡轮细胞DNase(美国Ambion、奥斯汀、TX)。然后使用Ncode玻利亚尾矿和互补脱氧核糖核酸合成进行律很微互补脱氧核糖核酸合成装备(表达载体)。远期qPCR分析引物设计基于已知的成熟的微rna序列,与额外的3 A s 3′末端提高扩增特异性(补充表在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/3598542)。反向引物的通用引物表达SYBR绿色微rna存在工具包(表达载体)。确定绝对拷贝数,标准曲线生成使用合成LIN-4 RNA寡核苷酸。mRNA qRCR,总RNA提取使用试剂盒(表达载体)和使用上标三世第一链合成第一链cDNA合成系统rt - pcr(表达载体)。1μL (cDNA使用PCR反应混合受到PCR扩增SuperMix(表达载体)。正向和反向引物的qPCR分析补充表中列出。GAPDH作为内部参考基因相对量化。qPCR进行iQ5 rt - pcr检测系统(美国BioRad伯克利分校CA)。所有的反应都是一式三份。

2.6。体外Boyden室细胞迁移试验

体外迁移化验使用4 t1细胞作为引诱剂,进行与BD猎鹰Boyden室高温超导FluoroBlok 24-well多井插入系统。4 t1细胞被播种到24-well同伴盘子Opti-MEM(表达载体)的密度2.5×10⁵细胞每口井。只用于油井DMEM空白组。HiPS-NSCs被贴上Calcein-AM(表达载体)。标记hiPS-NSCs是悬浮在Opti-MEM和播种Boyden室transwell插入5×10的密度⁴细胞每插入。经过24小时的文化37°C在常氧或缺氧条件下,荧光hiPS-NSCs底部一侧的插入(代表迁移细胞)计数和迁移率计算。所有实验在6复制。

2.7。动物实验

所有动物工作是按照协议完成机构的动物保健和使用委员会的批准。进入体内的肿瘤趋向性hiPS-NSCs,乳腺癌肺转移的小鼠模型建立了如前所述[29日]。六个女无胸腺的裸体BALB / c小鼠(体重20克,年龄6 - 8周)被用于分析。对肺转移的形成,1×10⁵200年4 t1-luc细胞µL PBS /动物是通过尾静脉注入小鼠。肿瘤接种后一个星期,小鼠随机分为2组。CRISPRi或控制的hiPS-NSCs转导baculoviral向量被标以5µ克/毫升的DiR(卡钳)一夜之间,其次是与PBS三次洗涤。标记细胞,1×10⁶200年µL PBS /动物,通过尾静脉注入小鼠。第二天,发光信号4 t1-luc细胞获得使用新成像系统的发射滤波器560海里(卡钳)腹腔内注射后D-luciferin(100毫克/公斤,Promega,麦迪逊,WI,美国);的荧光信号DiR-labeled hiPS-NSCs是使用相同的系统,一个很酷的CCD相机和一个协调小组过滤器(卡钳)。评价体内DiR-labeled hiPS-NSC分布、体外成像进行9器官:肺、肝、脾、肾、心、脑、胃、脊椎和股骨。图像和测量发光和荧光信号的获取和分析使用生活图像3.2软件(卡钳)。

2.8。统计分析

所有数据都表示为平均数±标准差。统计学意义上的差异是由成对的,双尾学生的t以及。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。生成和表征Epi-hiPSCs和国家安全委员会

创建一个epi-hiPSC从包皮成纤维细胞电穿孔的游离向量表达重组因子Oct4、Sox2, Klf4 L-Myc, Lin28。epi-hiPSC行被AP染色特征,为多能性标记Oct4疣状,胚状体体分化(图1(一))。然后nsc来自上述epi-hiPSCs简单附着单层培养的方法和特征为巢蛋白免疫染色,nsc的早期标志(图1 (b))。顺序撤离bFGF和EGF后,他们生成的混合人口胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)——积极的神经胶质细胞β三世tubulin-positive神经元(图1 (b))。因此,epi-hiPSC-derived nsc举行multipotency分化成胶质细胞和神经元。

3.2。有针对性的抑制mir - 199 a / 214在nsc CRISPRi集群的系统

在视图中,mir - 199 - 5 - p, mir - 199 - a - 3 - p,和mir - 214 mir - 199 a / 214集群目标HIF-1α和c-Met信号通路发挥重要作用在低氧诱导细胞迁移(图2(一个))[12- - - - - -15),我们试图开发CRISPRi系统抑制这microRNA基因簇的表达。根据文献,地区之间357 bp和−−1 bp的启动子,包含一个E-box元素(CATCTG),需要驱动的转录集群(mir - 199 a / 21430.];因此,这个区域的序列检索和筛选的候选人sgRNA目标站点覆盖E-box元素。只有一个候选人被发现:“TAACGTTACACTAAAACATCTGG”位置−344(图2 (b))。因为先前的研究表明,CRISPR系统可能容忍目标不匹配(1 - 331日,32),我们进一步调查其非目标3不匹配或更少。我们发现候选人只有2与3不匹配和非目标这些不相干的不靠近任何蛋白质编码区或转录因子结合位点(至少300个基点——和下游)。因此,候选人被选为CRISPRi目标。

杆状病毒来有效地交付CRISPRi系统针对E-box hiPS-NSCs元素或控制向量。MicroRNA qPCR进行访问的绝对表达水平mir - 199 a - 5 - p, mir - 199 - a - 3 - p,和mir - 214与CRISPRi hiPS-NSCs转导系统和缺氧条件下(图2 (c))。符合我们之前的研究(5,8],mir - 199 a的表达水平——5 - p, mir - 199 - a - 3 - p,和mir - 214 hiPS-NSCs常氧条件下非常高但是在缺氧条件下表达下调30% - -50%。CRISPRi系统就可以下调32% - -48%的微rna表达水平hiPS-NSCs常氧条件下。令人印象深刻的是,CRISPRi系统进一步微rna水平降低33% -45%低氧条件下。因此,我们CRISPRi系统针对E-box元素的子mir - 199 a / 214集群成功抑制mir - 199 a - 5 - p, mir - 199 - a - 3 - p,和在缺氧条件下hiPS-NSCs mir - 214的表达。

3.3。抑制mir - 199 a / 214集群促进NSC体外肿瘤趋向性

然后我们进一步调查是否抑制mir - 199 a / 214集群可以去阻遏hypoxia-related信号通路,促进hiPS-NSC在缺氧条件下迁移。报道微rna信使rna表达水平的目标,HIF1A,满足,和MAPK1 qPCR衡量。趋化因子受体CXCR4是作为HIF-1的另一个重要目标α低氧诱导细胞迁移对肿瘤(图3(一个))。结果表明,在常氧条件下,这些目标基因调节1.8 -2.2倍后抑制mir - 199 a / 214年hiPS-NSCs集群。在缺氧条件下,这些基因的表达水平升高仅仅1.2 3.3 -4.5倍-2.7倍但抑制mir - 199 a / 214的集群。

接下来,体外迁徙能力hiPS-NSCs 4 t1,老鼠转移性乳腺癌细胞系,评估了Boyden室细胞迁移实验(图3 (b))。结果表明,在常氧条件下,抑制mir - 199 a / 214集群没有增加hiPS-NSCs向4 t1细胞的迁移率。这可能是由于缺乏趋化因子释放的癌细胞在常氧条件下。在缺氧条件下,抑制mir - 199 a / 214集群提升hiPS-NSCs向4 t1细胞的迁移率从40%降至60%。综上所述,我们的结果表明,在抑制mir - 199 a / 214集群通过CRISPRi可以显著改善肿瘤的趋向性hiPS-NSCs在缺氧条件下体外。

3.4。抑制mir - 199 a / 214集群提高NSC体内肿瘤的趋向性

进一步检查是否抑制mir - 199 a / 214集群可以改善体内hiPS-NSC肿瘤趋向性,动物研究是使用鼠标进行乳腺癌肺转移模型。总之,4 t1-luc转移性乳腺癌细胞接种BALB / c小鼠通过尾静脉注射。1周后,建立了肺转移和小鼠随机分为2组。然后用CRISPRi hiPS-NSCs转导系统或控制向量被DiR标记,通过尾静脉注入小鼠,分别。第二天,全身发光和荧光图像被确认存在4 t1-luc肿瘤和DiR-labeled hiPS-NSCs(图4(一),补充图)。然后,体外器官成像进行调查hiPS-NSCs的体内分布。9的发光和荧光信号的器官,包括肺、肝、脾、肾、心、脑、胃、脊椎和股骨,收购和量化(图4 (b),补充图)。发光信号确认4 t1-luc肿瘤肺转移建立了。荧光信号表明hiPS-NSCs两组可以在肺转移。然而,在对照组中,只有大约12%的hiPS-NSCs肺,但是大约75%和10%的肝脏和脾脏细胞被分心。同时,CRISPRi组中,超过70%的hiPS-NSCs迁移到肺,只有大约18%的细胞去肝脏(图4 (c),补充图)。总之,抑制mir - 199 a / 214年CRISPRi显著增强hiPS-NSCs体内的肿瘤趋向性。

4所示。讨论

恶性肿瘤的预后不良主要是由于这些肿瘤的能力渗透到人体和无效的传统治疗方法,如手术和广播,化疗,消除传播肿瘤。显然,迫切需要开发新型治疗方法来克服当前癌症治疗的局限性。nsc不仅能够在nonneural脑瘤也实体肿瘤的起源(2,11]。在动物肿瘤模型中,肿瘤趋向性nsc的广泛探索靶向抗癌药物的群众原发肿瘤和肿瘤远处转移(6,7]。1期临床试验使用人类NSC行交付自杀基因多形性成胶质细胞瘤复发是目前正在进行的城市希望杜阿尔特医疗中心,加利福尼亚(1]。

nsc的巨大潜力在癌症基因治疗的重要性凸显了一个健壮的、大规模的可靠来源,标准化生产人类nsc满足良好的临床实践的要求。hiPSC技术提供了一个可访问的可用性,稳定产生无限量的nsc来源细胞疗法(33,34]。hiPSCs绕过了道德关心的同时,使用人类胚胎干细胞(35)的安全问题由同种异体移植的免疫排斥反应。尽管hiPSCs很有吸引力的潜在临床应用,仍有许多安全问题的细胞重新编程方法。传统的慢病毒和逆转录病毒载体能够提供大多数人类细胞的重编程因子有效类型(8,10];然而,病毒基因组整合到宿主基因组可能会引入意想不到的突变,因此不适合临床使用。为了规避这个问题,这里我们使用游离向量来生成一个nonintegrating epi-hiPSC线。nsc来源于这epi-hiPSC线也有良好的肿瘤趋向性,可以由杆状病毒转基因。

据我们所知,这是第一个试图利用杆状病毒向nsc CRISPRi系统交付。昆虫杆状病毒是一种病毒,但能够有效地转换人类细胞。与传统人类病毒载体,如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒本身是无法在人类细胞中复制,没有检测到现有免疫杆状病毒在人类;因此,它被广泛地利用作为临床应用的新型基因传递向量(36,37]。值得注意的是,baculoviral向量的另一个特点是大型载货能力,28 kb。考虑到Cas9基因大小相对较大(~ 4 kb),一个更大的向量将允许一个更复杂的CRISPR-based系统的设计和扩张CRISPR工具包使用dCas9-effector融合蛋白。

更重要的是,动物实验使用乳腺癌肺转移小鼠模型已经证明有针对性的抑制mir - 199 a / 214集群CRISPRi显著增强hiPS-NSCs体内的肿瘤趋向性。肿瘤微环境通常是缺氧由于肿瘤细胞的增殖率高。肿瘤细胞释放细胞因子SDF-1和HGF刺激血管生成等支持肿瘤生长。静脉注射后,NSC向量将通过器官通过循环系统。他们应该感觉SDF-1和HGF梯度迁移通过小静脉的墙进入肿瘤组织。然而,SDF-1 / CXCR4和HGF / c-Met信号通路由米尔负监管在nsc - 199 a / 214集群。在动物实验中,我们证明了,通过抑制mir - 199 a / 214集群,NSC向量的比例明显高于迁移到肿瘤组织。在以前的动物研究中,它已经被NSC观察到非标靶治疗基因表达向量将严重危害健康的器官6];因此,增强肿瘤趋向性NSC-mediated癌症基因治疗成功的关键。

5。结论

我们已经开发出一种baculovirus-delivered CRISPRi系统专门抑制mir - 199 a / 214集群1号染色体通过阻断E-box在启动子区域。有针对性的抑制mir - 199 a / 214集群nsc显著提高他们的肿瘤趋向性体外和体内。

相互竞争的利益

所有作者没有利益冲突声明。

作者的贡献

Yumei罗和徐Xuehu同样这项工作。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(81401206,81401206,U1132005)、广东省科技计划项目,中国(2016 a030308011 2016 b090918130 2014 a020212357 a030312012 2014和2013 b051000087),科学和信息技术的关键项目广州市(201508020258、201400000003 - 4和201400000004 - 4),和广州市医疗科技计划(20141 a011091)。

补充材料