文摘

诱导多能干细胞的发展(万能)使得细胞重编程机制的研究。在这里,我们研究了H2A的动态分布。Z在诱导重编程与染色质免疫沉淀反应深度测序(ChIP-Seq)。我们发现H2A。Z倾向于积累在转录起始站点(TSS)和合并高的基因转录活动。和H2A去分析。Z合并基因表示,大多数基因参与染色质组装或拆卸和染色质修饰MEF和第七天样品,不是万能的。此外,我们发现H2A整合的最高水平。Z在TSS第七天样品相比mef和万能。去分析,只有结合基因在第七天也显示染色质重塑的作用。因此,我们推测H2A。Z may be responsible for chromatin remodeling to enhance the access of transcription factors to genes important for pluripotency. This study therefore provides a deeper understanding of the mechanisms underlying induced reprogramming.

1。介绍

诱导多能干细胞的发展(iPSC)技术,于2006年首次报道由高桥和山中(1)促进了伟大的进步在干细胞生物学领域。重新编码躯体细胞使之达到多能状态的能力增强了我们理解潜在核重编程的机制、调节细胞具备干细胞再生医学和疾病治疗,并催生了新方法(2,3]。然而,尽管iPSC技术提供了前所未有的机遇,供者细胞重新获得多能性的精确分子步骤仍有些不明原因(4]。此外,很多问题(5)周围的效率和稳定诱导重编程过程需要解决。

一些研究已经提供了洞察在重组基因表达模式的变化(6- - - - - -8]。然而,供者细胞之间的差异和万能干细胞,胚胎干细胞(ESCs)和细胞则存在于基因表达的表观遗传水平以及[9,10]。动态影响转录模式通过改变染色质结构的可访问性转录因子或其他调控蛋白DNA通过宽容改造机械。独特的ESC的表观遗传状态特征是作为一个高阶染色质结构(12),这表明染色质蛋白质的高动力性的可塑性可能是负责维持多能性。此外,重塑复合物和组蛋白变体可以影响染色质的结构和细胞命运。例如,brahma-associated因子(BAF)复合物有助于稳定、组织记忆细胞命运的11,13),而组蛋白变体替换可以通过批判性调控干细胞分化决定基因表达谱(14]。然而,一个动态的染色质状态是否会导致细胞命运的变化在iPSC发展尚不清楚。

将特定的组蛋白变体构成染色质结构的变化在重构转录控制是至关重要的。其中最高度进化H2A守恒的组蛋白变体。Z,这变种负责独特的染色质结构特点。H2A。Z具有tetramer-dimer对接域(15),通常是丰富的转录起始点(TSS)的基因,并通过转录激活在基因调控中扮演关键角色(4,16]。H2A。Z也被卷入染色质调节过程以及建立染色质边界的核小体交换和polycomb镇压[4,17]。然而,这些看似不同的功能之间的关系和诱导多能细胞的重组仍然是模糊的。如何理解不同的组蛋白变体基因表达模式,最终影响细胞命运将加强我们对诱导重编程的理解。

为此,我们探索了H2A。Z三个细胞的全基因组沉积剖面样品代表不同的重组阶段从小鼠胚胎成纤维细胞(mef)则使用染色质免疫沉淀反应(芯片)加上高通量测序(ChIP-Seq)。我们确定了H2A激烈的浓缩。Z在过渡时期沉积特征作为iPSC从7天。H2A的考试。Z动力学在这个过渡时期增进了我们对角色的理解的组蛋白变体在促进诱导重编程。我们的研究结果发现H2A。Z的表型可塑性可能导致染色质的结构,从而提高转录因子进入DNA和导致重新编程的细胞状态。

2。结果

2.1。动态H2A的入住率。Z变体在iPSC发展

调查是否H2A组蛋白变体。Z是参与重组mef万能,我们利用ChIP-Seq技术检查的动态chromatin-bound H2A。Z诱导重编程过程中。我们之前的报告显示鼠标万能(m-iPSCs)成功地生成的异位表达下Oct3/4, Sox2, Klf4(商船)在Vc [18]。重要的是,有聚合细胞出现在第七天,总是成为iPSC克隆。初始细胞MEF,第七天细胞(MEF诱导为7天,聚集细胞被用于后续的分析),和万能(MEF接受14天感应的克隆)代表收集重编程过程的不同阶段来满足ChIP-Seq。

为了避免假阳性数据从H2A由于非特异性。Z抗体,我们检查了抗体与一个普通的实验由免疫球蛋白抗体芯片实现。DNA与H2A沉积。Z抗体实现芯片是量子化的存在。hoxa11基因、hoxb1特别喜爱,zfpm2 lrx2, pax5 neurog1, hoxb2选择UCSC的数据库和报告(19)与H2A免疫沉淀反应。独立Z和免疫球蛋白抗体,然后测试中存在相同的引物(图S1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/3162363)。

我们取得了超过20 Mb清洁每细胞样本数据集(表输出1)。读是对齐到一个参考基因组老鼠基因组mm9相结合。使用SOAP 2.21软件,我们选择有效映射读取详细表2。进一步选择映射到独特的基因组区域的读取基于精确映射注释“子”,“UTR”,“cd,”和“基因间”精制数据集(表2)。使用mac 1.4.0 [20.软件,我们确定了23818、13744和14768年的峰值MEF,第七天,和iPSC细胞样本,分别(表3)。山峰在基因间的优先下降,启动子,基因内区和5′UTR区域MEF和iPSC细胞样本(数据1(一)和1 (c))。独特,31.55%的山峰被发现在第七天细胞启动子样本多基因间区域(23.64%)和其他基因组区域。当然,山峰在第七天启动子区域的比例(31.55%)高于MEF(26.55%)和iPSC (25.04%)。

我们知道,不同的基因区域包含一个不同数量的基地。为了消除非特异性结合的影响,我们评估的相对浓缩的山峰在遗传元素根据比率[(芯片测序峰的数量在一个地区/芯片总数在基因组测序峰)/(一个地区的全基因组基地数量/全基因组总数基地)]。图1 (d)表明大部分山峰特别都映射到推广者优先,而小的山峰被映射的地区包括“下游”5′UTR,和cd,而一些山峰被映射到其他人,包括基因内区、3′UTR,基因间区域。有趣的是,H2A。Z占领更多的DNA序列在发展期间启动子MEF第七天,但从这些网站与iPSC形成(图1 (d))。

2.2。H2A。Z是沉积在TSS地区诱导重编程

深入调查H2A的沉积。Z在启动子区域在整个基因组,我们比较H2A的存在。Z带注释的基因区域5 kb上游和下游5 kb tss和规范化读入三种细胞类型。我们发现H2A。Z是丰富TSS的两边,用小滴的TSS站点(图2(一个))。然而,平均归一化读取无名转录终止网站(苔丝)附近的变化(图2 (b))。这些双峰值曲线和相对枯竭分布的H2A风格。Z是在协议与另一个报告21,22),证明结果是可信和H2A表示。Z优先存款上游tss。与上面的结果一致,第七天H2A细胞平均水平最高。Z占用,则最低。

在mRNA表达水平,这种免疫反应基因(基因表达水平:最高的第七天MEF和万能)相比是明显的18]。然而,基因与乙酰化作用有关,染色质组装和细胞周期与高H2A沉积。Z入住率(图S2)。这些数据表明细胞感染引起的商船病毒载体通过帮助H2A改变细胞命运。Z的访问表观遗传学因素。

检查H2A浓缩的之间的关系。Z在染色质和基因表达水平,我们H2A相比。Z入住率和基因表达数据从我们以前的报告18在不同的基因。然后我们分离基因分成四类基于表达水平和H2A显示。Z tss左右水平。这表明,所有三个样本,H2A。Z显示高入住率侧翼tss在高表达和表达基因和降低与减少转录基因(图3)。这个建议将H2A之间的相关性。Z TSS和基因表达在iPSC的发展。

明显,转录因子Oct4、Nanog Klf4, cMyc, sox2, Lin28通常用来满足诱导重编程。在他们的DNA序列,H2A的浓缩。Z是动态和复杂的(图S3)。然而,数据显示,H2A入住率最高的。Z的上游地区Nanog Lin28单独。宽整个序列,高峰是在诱导重编程从下游到上游转移。多能性基因的表达水平是调节诱导重编程过程中,它表明H2A。Z有利于激活这些基因的动态占用。有可能的是,H2A的浓缩。Z在cMyc TSS动态地从上游转移。引人注目的是,这些地区的入住率保持更高的水平在整个诱导重编程。Nanog和Oct4峰值总是出现在cd地区沉积H2A。Z在第七天。这个数据支持绑定Oct4和H2A之间。Z下游(23]。与这些转录因子,浓缩Sox2没有最高水平TSS地区日7;然而,有继续占用TSS和te地区在7天。它指控H2A监管这些多能性基因的表达。Z可能依赖于不同的行为风格的动态占用。

2.3。H2A。通过染色质重塑Z占用导致诱导重编程

H2A。Z核小体在启动子和基因组成的身体影响核小体的稳定性和转录状态(16],上述结果表明,H2A。Z偏好合并高表达基因在TSS在体细胞重编程(图3);我们推测H2A的合并。Z可以调节绑定的表达基因,然后推动重组。调查H2A的功能。Z入住率在诱导体细胞重编程,我们选择基因发现H2A。Z沉积体内基因启动子或地区三个细胞样本(表S1-S3)。我们确定了12281个基因被H2A占领。mef Z, 9598个基因在第七天细胞,7944个基因在万能。通过生物过程分析H2A上执行。Z相关的基因,有116万能干细胞生物学过程,168年第七天细胞,和237年mef(表S4-S6)。这些基因H2A。Z occupied in MEFs were more various in gene ontology than both Day 7 cells and iPSCs. It indicated that H2A.Z deposited more widely at the first time and eventually located on limited scale. For this biological processes analysis, the terms gene expression, regulation of gene expression, transcription, and regulation of transcription ranked much higher in iPSCs than in Day 7 cells and MEFs. None of the genes occupied by H2A.Z were involved in chromatin modification, assembly, or disassembly in iPSCs, but genes involved in these processes were occupied by H2A.Z in Day 7 cells and MEFs (Figure4)。

大多数基因被H2A占领。Z在所有三个细胞类型参与代谢过程。在相同的生物学过程主要出现在对面的十大细胞类型,“基因表达”的标签出现在第七天细胞。这表明基因被H2A占领。Z在第七天更参与基因表达(图5)。进一步分析发现,2200个基因只在mef占领,478个基因只在第七天细胞,1067个基因只在万能(图6(一))。H2A。Z提高特定公司在第七天(数字1和2)。因此,我们推测H2A浓缩的增加。Z在第七天可能会改变特定基因的表达,然后推动重组。生物过程分析与H2A进行478个基因。Z公司只有在第七天细胞。我们发现他们主要是参与大分子复杂装配和组织,包括DNA包装、染色质组装或拆卸,protein-DNA复杂装配(图6 (b))。这表明H2A。Z往往占据特定基因,特别是参与表观遗传因子基因的调控影响染色质结构后7天。

3所示。讨论

H2A。Z是进化保守分子序列和结构(24),改变染色质结构通过其沉积在DNA结合位点。除了选择绑定的组蛋白变体H2A引起染色质结构。Z,其他监管元素的访问可以由核小体的动力学状态。我们的数据表明,H2A组蛋白变体。Z总是存在活跃基因的启动子在诱导体细胞重编程(ISCR)(图3)。最近的报告(25支持H2A。Z可以独立存款的复制,优先丰富活跃基因的启动子。这TSS的访问可能负责活跃基因的功能(26和灭活基因提供一个可行的核小体与活性启动子(27]。之前报道的数据显示,被激活的基因被H2A高度占领。Z, genesis豪华干细胞的自我更新(23]。这是符合H2A的角色。Z在促进细胞则通过其沉积的一代在ISCR推动者整个基因组。

H2A。Z是认为便于组装或拆卸的染色质和增加转录活动。在酵母,H2A。Z通常位于活动发起人在核小体,艾滋病在提供正确的架构转录激活(28]。我们的数据表明,许多H2A。Z占领基因参与生物过程相关的细胞的基因表达在所有三个样品检查。先前的报道已经证实乙酰化H2A通常出现在活跃的核小体(29日),这些乙酰化蛋白可以招募蛋白复合物调控基因转录(30.]。很显然,基因被H2A占领。Z可以很容易地标记为活跃和H2a之间这种组合。z和DNA区域可能是信号重组乙酰酶复合物的招聘。此外,H2A。Z是一个共激活剂所需的完整的组蛋白乙酰化作用,这有助于获得基因启动子转录因子(30.]。我们的数据表明H2A。Z也许有强烈影响的规定通过其沉积在ISCR tss基因表达。H2A强烈支持这一概念。Z作为标记的活跃转录在其分布在整个基因组,它促进和参与染色质结构的规定31日]。

增加H2A的绑定。Z中检测出基因表达在更高层次ISCR(图3)。这表明H2A的存在。Z的染色质结构可能协助招聘转录机械,可能不仅艾滋病外源基因转录因子结合所需的多能性,而且还维持干细胞的表观遗传状态(32]。之前的数据显示,压力反应发生在重编程过程的开始(8]。在这里,我们发现H2A。Z在基因丰富的生物过程对缺氧反应,氧含量,对类固醇激素的刺激做出反应,调节细胞凋亡,调节细胞死亡在ISCR的开始。同样,占领的一组特定基因只出现在第七天细胞染色质组装。我们的数据表明,占领了基因在第七天细胞总数下降,这些细胞的基因只占据数量是最低(图6(一))。然而,H2A的浓缩。Z在第七天细胞基因启动子区域是最高的(数据1 (d)和2(一个))。此外,占领了基因的数量现在MEF和第七天细胞数量大于出现在第七天细胞和万能。这表明H2A。Z往往占据了较小的和专门的基因重组期间,H2A子集。Z相关基因收到最多的浓缩在第七天细胞启动子。

改变是一个过程涉及到表观遗传修饰和基因表达的变化。之前的数据表明,mef和第七天细胞共享一个相似的转录谱(18),而万能的转录谱是逆转,转录因子超表达可以支持upregulation表观遗传因子基因(18]。H2A。Z可以作为商标在开放的染色质推动者;它可以通过PRC2招募/ MLL复合物(33)或被OCT4辅活化因子(23]。和组蛋白乙酰化作用也可能作为活跃在全基因组基因标记设置招聘RNA聚合酶II启动子(34)重建基因表达模式。H2A。Z占领p300-bound多能性基因的增强子支持全球变化(23),这表明H2A。Z是预测的主动标记染色质重塑和提供访问表观遗传因子或转录因子结合位点。我们推测,H2A的浓缩。Z在少数特殊基因的启动子区域在第七天细胞可能代表重组期间转换的起始阶段。首先,增强H2A整合。Z在特定基因的TSS在第七天细胞可以改变染色质结构对当地规模(31日),提供一个访问对表观遗传或转录因子结合位点施加的影响。然后,改变了特定基因的表达,可以改变染色质结构的整个基因组(数字4和6 (b))。最后,大量的基因的表达改变促进重组,伴随着公司在染色质浓缩履行表观遗传重编程(图S4)。然而,这些预测都是H2A研究仅仅是一个起点。在ISCR Z,确切的功能仍在等待更多的实验证据证实。

4所示。材料和方法

4.1。道德声明

动物实验进行了在一个特定的无菌动物设施的评估和认证协会认可的实验室动物保健。所有动物协议被批准的动物保健和使用委员会模式动物研究中心,国家资源中心的主机突变小鼠在中国,南京大学。

4.2。细胞培养

C57BL6 mef来自胚胎13.5天的小鼠胚胎(35修改和维护在杜尔贝科的鹰的介质(DMEM、高葡萄糖)含10%胎牛血清。ESCs和万能干细胞培养γ辐照mef ES中包含淘汰赛DMEM补充20%击倒血清替代品,0.1毫米NEAA, 2毫米谷酰胺、丙酮酸钠1毫米,0.1毫米β巯基乙醇50 U和50毫克/毫升青霉素、链霉素、和1000 U /毫升白血病抑制因子(美国微孔,Billerica的)。所有其他试剂从英杰公司购买公司(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。

4.3。iPSC代

Plat-E细胞转染在80%融合PMX-based逆转录病毒载体(Addgene、剑桥、马、美国)包含小鼠Oct4、Sox2, Klf4互补使用Lipofectamine 2000(表达载体)。上层清液是收获病毒转染后48小时。mef通道2或3被播种密度3500 - 5000细胞/厘米²和孵化筛选病毒上清液含有等量的三个转录因子(Oct4、Sox2 Klf4) (36),5μ克/毫升聚凝胺。十二小时后,媒介逐渐取代ESC中补充了50μg / mL Vc (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)使用为期四天的逐步过程(37,38]。和诱导细胞克隆碱性磷酸酶(美联社)积极发展与三个主要的畸胎瘤体内生殖细胞层。此外,m-iPSC克隆仍然保持正常核型和可以表达典型的多功能基因标记,如SSEA-1 Nanog, Oct4 [18]。

4.4。ChIP-Seq

Anti-H2A。Z抗体(mAb)是用于免疫沉淀反应。细胞()与新鲜1%甲醛固定在37°C的10分钟和细胞溶解SDS裂解缓冲。细胞核是resuspended和用冰200 - 1000个基点的染色质的DNA。共有50个μL Dynal蛋白G珠子,5μ克的抗体,用染色质在一夜之间被孵化在4°C。沉淀immunocomplexes蛋白酶K 65°C治疗,疗程2 h和DNA纯化试剂盒快速聚合酶链反应(PCR)净化设备(试剂盒,杜塞尔多夫,德国)。DNA芯片放大,与适配器的结扎,re-paired DNA一端。150年英国石油公司DNA片段分离得到琼脂凝胶和测序Solexa Illumina公司2 g基因分析仪。

4.5。ChIP-Seq分析

Solexa管道分析描述(39]。ChIP-Seq数据处理和参考基因组mm9保持一致。SOAP 2.21软件被用来将36个核苷酸序列标签映射到鼠标基因组有两个不匹配。首先,原始数据从测序仪Illumina公司HiSeq2000获得,并通过质量控制和过滤干净的数据提取分析过程,然后实现了独特的映射读取分析一致。mac 1.4.0软件被用来识别H2A的丰富的山峰。Z占领的网站。程序参数设置如下:值< 10⁻⁴32、模型褶皱,频带宽度的老鼠基因组的300个基点。启动子被定义为2 kb上游所有注释tss和“下游”是指该地区2 kb下游测试网站。复合块所产生的平均价值在200个基点的窗户。浓缩的统计学意义()确定基于背景分布的随机读取特定为每个独立的全基因组芯片分析。

4.6。基因本体论

基因本体论分析与大卫(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)。EntrezGene id用于生物过程的浓缩的生成统计数据分类的基础上,背景上的所有代表基因列表启动子芯片设计。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

浮东,振威歌,秦文君Yu是相等的贡献者。

确认

作者要感谢本白(上海Genergy生物技术。有限公司)的技术援助。这项研究受到了项目培育新品种的转基因技术(没有。zx08006 2008 - 003),中国国家的重点工程项目(973项目没有基础研究和发展。2010 cb945404),中国国家自然科学基金的浮东(81300553)。

补充材料