文摘

长非编码rna (lncRNA)被认为是重要的监管机构多样化的生物过程,如转录调控、干细胞增殖和分化。先前的研究已经表明,lncRNA -ANCR(不定积分ncRNA)起着关键的作用在调节牙周韧带干细胞的增殖和成骨分化(PDLSCs)。然而,鲜为人知的作用ANCR在调节其他类型的牙科tissue-derived干细胞(DTSCs)行为(包括扩散和多家潜在的区别)。在这项研究中,我们调查了监管lncRNA——的影响ANCR增殖和分化(包括成骨、脂肪形成的和神经源性分化)DTSCs,包括牙髓干细胞(DPSCs) PDLSCs,干细胞从顶端的乳头的差别(SCAP)对这些lncRNA -ANCR。的差别,我们发现对这些ANCR施加什么影响DPSCs扩散和SCAP但促进成骨的,脂肪形成的,和DTSCs神经源性分化。这些数据提供了一个洞察长非编码RNA的监管效果ANCRDTSCs和说明ANCR是一个非常重要的调节因子在干细胞分化。

1。介绍

牙科tissue-derived干细胞(DTSCs)干细胞分离牙科组织自我增殖和多向分化潜能。牙髓干细胞(DPSCs)、牙周韧带干细胞(PDLSCs),并从顶端干细胞乳头(SCAP)三个重要DTSCs用于组织工程研究(1- - - - - -4]。希尔肯等人发现,DPSCs能够成骨的脂肪形成的,并通过不同的诱导方法[chondrogenic分化5]。金等人DPSCs诱导分化为成牙骨质细胞和neurocytes-like细胞(6]。Dissanayaka Janebodin发现DPSCs可以分化为血管内皮细胞,angiopoietic能力与一个angiopoietic因素刺激后7,8]。Seo等人结合PDLSCs HA / TCP和植入的复杂到裸鼠PDLSCs形成牙周膜和cementum-like组织(2]。Sonoyama等人播种PDLSCs SCAP混合细胞植入到HA / TCP和混合的复杂到年轻的猪细胞形成功能bioroot和牙周膜(9]。

很多因素,包括生长因子、炎症因子,和小分子核糖核酸,扮演了一个重要的角色在调节的增殖和分化DTSCs(表1)[7,10- - - - - -25]。刻苦钻研后DTSCs microrna的监管作用,学者们发现,许多非编码rna的增殖和分化的关键调节因素DTSCs [14- - - - - -16]。

而93%的人类基因组DNA翻译成RNA, RNA转录成蛋白质的只有2%。大部分的DNA是翻译成非编码rna (26]。长非编码RNA (lncRNA)曾被公认为无用的转录噪声(27]。近年来,科学家们发现他们是非常重要的在调节表观遗传,转录和转录后的基因表达(26- - - - - -31日]。不定积分非编码RNA (ANCR)是一种新发现的lncRNA干细胞分化过程中表达下调,使表皮干细胞或成骨细胞细胞处于未分化的细胞状态。消耗ANCRprogenitor-containing人群,没有任何其他的刺激,导致快速分化和基因诱导(32]。朱镕基和徐发现表达下调ANCR针对促进成骨细胞分化EZH2和规范Runx2表达式[33]。此外,我们的先前的研究还表明,ANCR促进了PDLSCs[的成骨分化34]。在这个实验中,我们使用RNA干扰表达下调ANCR表达式,进一步分析的监管功能ANCRDTSCs的增殖和分化,这将提供一个横向比较的视野的监管功能ANCRDTSCs。

2。材料和方法

2.1。样本收集和细胞培养

健康影响第三臼齿收集从19到29岁之间的成年人第四军医大学的牙科医院。所有拔牙进行了伦理委员会的批准下,口腔医学院第四军医大学(批准号irb -转速2014 - 018)。知情同意是获得所有科目和方法进行依法批准的指导方针。组织从牙髓、牙周韧带和顶端乳头被孤立的从每个摩尔,如前所述[1- - - - - -3,35]。简单,组织轻轻的在分离和消化解决方案由3毫克/毫升的胶原酶I型(美国表达载体)和4毫克/毫升的dispase(美国表达载体)40分钟37°C。通过获得的细胞悬液是通过一个70 -解决方案μm过滤器。然后,1×10⁴细胞被播种到每个6-well板。α修改鹰的介质(α美国表达载体mem)补充10%胎牛血清(美国HyClone), 100 mol / L的L-ascorbic酸2-phosphate(美国σ),2更易/ L谷酰胺(美国σ),100 U /毫升的青霉素,100μ克/毫升的链霉素(美国Gibco)作为细胞的标准培养介质在37°C公司为5%₂。每2 - 3天中被改变。有限稀释技术应用和单个细胞被播种到96孔板来获取单个细胞衍生的殖民地。confluency到达80%,许多这些single-colony-derived线路通道1:3比例进一步培养。

2.2。Immunophenotype分析

DTSCs沾干细胞表面标记和流式细胞仪分析了如前所述[16]。简单地说,识别DTSCs的表型,5×10⁵细胞在第三段孵化和藻红蛋白(PE)共轭对人类单克隆抗体CD29、CD34、CD45、CD90、和CD146或Allophycocyanin (APC)共轭对人类单克隆抗体STRO-1根据制造商的指示。孵化过程进行避光在4°C 1 h。与PBS洗涤后,细胞受到流仪分析。

2.3。慢病毒感染

的第三段self-inactivating慢病毒载体是购自神经元生物技术(上海神经元生物科技有限公司,上海,中国。向量含有嘌呤霉素标记和U6 PolIII启动子,使得寡核苷酸编码的引入短发卡rna(成分)和包含人工合成的寡核苷酸ANCR(加入NCBI NR_024031.1)目标序列拼接变体(GCTGACCCTTACCCTGAATAC)。克隆的序列合成、退火和结扎AgeI之间的pLKD-CMV-G慢病毒载体和EcoRI U6启动子后酶的网站。寡核苷酸序列5′-CCGGGCTGACCCTTACCCTGAATACCTCGAGGTATTCAGGGTAAGGGTCAGCTTTTTT-3′(意义);和5′- AATTCAAAAAAGCTGACCCTTACCCTGAATACCTCGAGGTATTCAGGGTAAGGGTCAGC-3′(反义)。DTSCs镀在通道3的密度5×10⁴细胞/到6-well板块。3天的细胞培养以及重组慢病毒编码的成分ANCR在感染复数(MOI) 10αmem补充10%的边后卫含5毫克/毫升37°C和5%的聚凝胺有限公司₂。细胞被山肩在25厘米²烧瓶在90%αmem, 10%的边后卫,5μ克/毫升的嘌呤霉素和培养在37°C公司为5%₂和恒定的湿度。的ANCR表达后ANCR核糖核酸干扰(RNAi)检查中存在的分析。细胞成功地感染特定ANCRrnai被指定为DPSC /ANCRrnai PDLSC /ANCRrnai, SCAP /ANCRrnai,而野生型DTSCs被指定为DPSC / wt, PDLSC / wt,和SCAP / wt慢病毒和细胞感染控制向量指定为DPSC /向量,PDLSC /向量,SCAP /向量。

2.4。细胞生存能力分析(CCK8工具包)

细胞被播种成两个96孔板的密度约1×10⁴细胞每口井。试验进行24 h后播种,持续了7天;数据是在同一时间点收集的每一天。细胞计数Kit-8 (CCK8)被用来执行这个实验。细胞的数量每口井的测试吸光度(450海里)的减少WST-8在指定的时间点。

2.5。细胞生存能力分析(Edu工具包)

细胞被播种成两个96孔板的密度约1×10⁴每口井的细胞对数生长期和培育。然后,细胞进行可行性分析与Edu工具包(RiboBio,中国)作为制造商的指令。简单地说,50μM 5-ethynyl-2′脱氧尿苷(Edu)添加到培养基和细胞培养2小时。洗两次PBS和多聚甲醛固定后,细胞核被沾染了阿波罗567年,赫斯特33342年。然后,细胞成像与激光扫描共焦显微镜(德国蔡司)在550 nm和350 nm)在相同的愿景。然后,同样的视觉图像的重叠在一个图像。细胞计数是由图像J。

2.6。碱性磷酸酶(ALP)活性量化

细胞被播种到96孔板约1×10⁵细胞每口井。播种后24 h,媒介是变成标准成骨诱导分化培养基(50毫克/毫升的抗坏血酸(美国σ)),10更易/ L beta-glycerophosphate(美国边界网关协议,σ)和10 ng / mL的地塞米松稀释10%的边后卫αmem。高山量化分析了在3、6、9、12、15、18、21天使用碱性磷酸酶测定量化工具(建成,中国)。结果测量spectrophotometrically波长520 nm,根据制造商的指示。

2.7。茜素红染色和量化

细胞被播种到24-well板的密度约1×10⁵细胞每分开。达到80%的细胞融合后,介质是变成标准成骨分化诱导介质,然后培养3周。感应介质改变每3天。最后,细胞染色茜素红染色(pH = 4.1)的解决方案,量化根据先前描述的方法(10]。

2.8。油红O染色

细胞被播种到24-well板的密度约1×10⁵细胞每口井。达到80%的细胞融合后,介质是变成标准去感应介质(0.5更易/ L methylisobutylxanthine(美国σ),1更易/ L的地塞米松,10μ美国g / mL的胰岛素(σ),和200年μ美国mol / L的吲哚美辛(σ)),然后培养另一个3周。感应介质改变每3天。最后,细胞被沾油红O染色溶液和显微镜下观察下相衬(德国蔡司)。

2.9。免疫荧光

细胞被播种到约1×10共焦盘子⁵细胞每口井。坚持后,培养介质变成神经源性分化诱导介质(美国Gibco)包含20 ng / mL的EGF(美国Calbiochem)和20 ng / mL bFGF(美国Calbiochem),然后培养2周。感应介质改变每3天。最后,细胞被沾染了鼠标反βIII-TUBULIN美国主要抗体(细胞信号技术)的浓度1:100。隔夜孵化后,细胞染色DyLight 405(美国ThermoFisher)的浓度1:50 -赫斯特染料的浓度(RiboBio,中国)1:100。然后,细胞成像与激光扫描共焦显微镜(德国蔡司)。

2.10。定量实时聚合酶链反应(Q-PCR)

细胞被播种到60毫米菜肴。80%的融合,细胞诱导成骨的/脂肪形成的神经源性分化中2周。然后,从细胞总RNA提取使用试剂盒试剂(豆类、日本)和逆转录反应是使用豆类逆转录酶工具包执行(豆类、日本)。使用标准执行实时PCR SYBR绿色PCR试剂盒(豆类、日本)协议在应用生物系统公司7500实时PCR系统(美国应用生物系统公司),根据制造商的指示。β肌动蛋白作为一个内部参考。的mRNA表达成骨、脂肪形成的神经源性标记基因进行了分析。分析了每个样本一式三份。的值被用来确定的相对表达水平。结果表示为。基因名称和引物序列如表所示2。

2.11。统计分析

每个实验进行至少三次,除非另有指示。数据报告为均值±SD(标准差)。的意义实验和对照组之间的差异是由使用事后分析方差分析。的值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。描述和ANCRDTSCs干涉

Immunophenotype分析表明,分离DPSCs(图1(一)),PDLSCs(图1(b)), SCAP(图1(c))CD29, CD90 CD146,和STRO-1积极和CD34和CD45负的。Q-PCR分析感染后3天。结果表明,ANCR明显撞倒了吗ANCR特殊技能lentivirus-delivered成分ANCRrnai组与对照组相比在DPSCs(图(wt和向量)1(d)), PDLSCs(图1(e))和SCAP(图1(f))。

3.2。的影响ANCR在DTSC rnai扩散

细胞生存能力分析使用CCK8工具包进行量化DTSCs扩散。结果表明,细胞的增长率PDLSC /ANCRrnai组与对照组相比增加(图2(b))。然而,表达下调ANCR对DPSCs几乎没有什么影响(图2(一))和SCAP(图2(c))扩散。确认这个结果,我们使用Edu工具包来分析细胞的生存能力。结果表明,有更多PDLSC / ANCR-RNAi细胞(图2(e))在S期细胞(紫色)比控制。然而,几乎没有区别ANCRrnai细胞和控制细胞在DPSCs(图2(d))和南非(图2(f))。细胞计数的形象J证实这个结果(图2(g))。总之,表达下调ANCR促进了细胞的可行性PDLSCs但没有影响DPSCs和SCAP的细胞生存能力。

3.3。Downregulation的ANCR促进了DTSCs的成骨分化

高山活动量化显示表达下调ANCR增加高山在DTSCs分泌。一个显著差异出现在天9在DPSCs(图3(一))和SCAP(图3(c)),但直到一天12在PDLSCs(图3(b))。茜素红染色显示ANCRrnai比对照组细胞分泌更多的矿化矩阵。量化显示DPSC /的吸光度ANCRrnai细胞(图3(d))是双重的高于对照组的吸光度PDLSC /ANCRrnai(图3(e))和SCAP /ANCRrnai(图3(f))细胞是单一的高于对照组。Q-PCR显示所有的成骨的标记基因(高山,BSP,OCN)是调节ANCRrnai细胞(数据3(g) -3(我))。

3.4。Downregulation的ANCR促进了DTSCs的脂肪形成的分化

油红O染色显示,表达下调ANCR促进脂肪形成的分化DPSCs(图4(一)),PDLSCs(图4(b)), SCAP(图4(c))。Q-PCR显示所有的脂肪形成的标记基因(PPARγ2和C / EBPα)是调节在DPSCs(图4(d)), PDLSCs(图4(e))和SCAP(图4(f))。

3.5。Downregulation的ANCR促进了DTSCs的神经源性分化

免疫荧光显示更强的βIII-TUBULIN表达DPSC /ANCRrnai(图5(一)),PDLSC /ANCRrnai(图5(b)), SCAP /ANCRrnai(图5(c))细胞比控制。经过两个星期的感应,细胞形态学DPSC /ANCRrnai和PDLSC /ANCRrnai细胞与对照组相比发生了很大的变化。DPSC /ANCRrnai细胞是由一个轴突连接/ dendron-like从胞体结构,扩展。细胞形态学PDLSC /ANCRrnai细胞成为不规则的三角形或椭圆形。然而,几乎没有SCAP的细胞形态学的变化ANCRrnai细胞。Q-PCR显示βIII-TUBULIN,GAP43,NEFL,巢蛋白调节DPSC /ANCRrnai细胞(图5(d))与对照组相比。在PDLSC /ANCRrnai细胞(图5(e)),βIII-TUBULIN和巢蛋白调节,而GAP43和NEFL与对照组相比没有变化。SCAP /ANCRrnai细胞(图5(f)),βIII-TUBULIN,NEFL,巢蛋白调节,而GAP43与对照组相比没有变化。

4所示。讨论

相比其他间充质干细胞(msc)来源于骨髓、脂肪组织、外周血、脐带血,msc源自牙科组织有明显优势的轻松访问至少侵入性程序没有任何伦理问题(36]。能够进行自我更新和multidifferentiation DTSCs的最引人注目的特点,使它们特别适合于组织工程和基因治疗应用。使用前DTSCs临床药物治疗的能力在体外应该考虑扩张和分化。一系列因素参与调节DTSCs分化和增殖37]。这里我们使用一个横向比较分析调查长非编码RNA的作用ANCR在调节体外扩张和分化DTSCs的三种类型,包括DPSCs PDLSCs, SCAP。

在成骨的情况下,ANCRrnai细胞高度矿化与对照组相比,证明了量化的茜素红染色,以及高山活动。这些结果的差别表明,对这些基因ANCR可能促进DTSCs成骨分化。从而进一步证实成骨分化,我们选择评估几个成骨相关基因的表达(包括OCN,BSP,高山)。OCN完全由成骨细胞分泌,经常用作骨形成过程(一个标记38]。其基因表达是公认的在后期增加成骨细胞的分化(39]。BSP矿化组织的一个组成部分,如骨,象牙质,钙化软骨,被认为是一个特定的标志成骨细胞(40]。的基因表达OCN,BSP,高山调节的ANCRrnai细胞与对照组相比。综上所述,我们推测的成骨分化DTSCs被下调ANCR由移植实现OCN,BSP,高山。

Downregulation的ANCR促进了脂肪形成的差异化DTSCs证明了油红O染色和确认PPAR -γ2和C / EBPα表达式。有更多的脂质滴DTSCs /形式ANCRrnai细胞与对照组相比。的基因表达PPAR -γ2和C / EBPα调节的差别后,对这些吗ANCR。PPARγ2被称为转录因子的定向分化的preadipocytes明确表示在脂肪细胞分化的早期阶段。这是一个脂肪形成的分化的关键因素。C / EBPα适用于PPARγ2促进脂肪形成的分化(41]。我们推测,促进脂肪形成的分化表达下调所致ANCR由移植实现PPARγ2和C / EBPα。

βIII-TUBULIN通常确认为神经细胞的结构蛋白。它起着至关重要的作用在神经源性分化的过程42]。神经源性分化诱导的两周后,我们检查的免疫荧光染色βIII-TUBULIN。与对照组相比,DPSC /的形态ANCRrnai细胞和PDLSC /ANCRrnai细胞明显改变。DPSC /的形态ANCRrnai细胞类似于neuronal-like细胞。有几个axon-like结构从与相邻细胞的胞体。的形态学PDLSC /ANCRrnai细胞从长梭形细胞变成不规则的三角形或椭圆形,没有axon-like结构,控制细胞的形态变得细长。同样长而薄的形态学观察SCAP /ANCRrnai细胞和对照组。SCAP /几乎没有区别ANCRrnai细胞和对照组。的红色荧光βIII-TUBULIN后变得更加明显ANCR在DPSCs downregulation PDLSCs, SCAP。

我们使用Q-PCR评估的基因表达βIII-TUBULIN,GAP43neurofilament-light多肽(NEFL),巢蛋白。的βIII-TUBULIN的差别是调节后对这些表达式ANCR在DTSCs。这些结果可以解释红色荧光的增加βIII-TUBULIN在DTSC /ANCRrnai细胞。巢蛋白中间丝蛋白,是一种重要的表面标记神经祖细胞(43]。Q-PCR显示巢蛋白表达下调后调节ANCR在DTSCs。GAP43或neuromodulin是一种特定的神经轴突膜蛋白,在axonogenesis[起着至关重要的作用44]。的表达GAP43是调节DPSCs PDLSCs和SCAP但没有明显不同。NEFL在轴突是一个关键的蛋白中间丝的形成也起着重要的作用在axonogenesis [21]。后ANCRdownregulation DPSCs,的表达NEFL增加超过50倍与对照组相比,表明DPSC /ANCR有很强的axonogenesis rnai细胞。然而,的表达NEFL大约是两倍高SCAP /ANCRrnai但与对照组相比,PDLSCs基本未变。我们发现的表达的变化GAP43和NEFL是按照形态学改变DTSCs /ANCRrnai细胞。从这些数据,我们得出结论,表达下调ANCR提升DTSCs神经源性分化和神经源性分化的潜力DPSCs被下调更明显增强ANCR与PDLSCs和SCAP相比。

至于扩散方面,监管的效果ANCR在三种类型的DTSCs是不同的。Downregulation的ANCR晋升的扩散PDLSCs但对DPSCs和SCAP扩散影响很小。我们使用cck-8和Edu化验证实这个结果。先前的研究表明,干细胞来源于牙科组织表现出不同的细胞增殖(3,45]。尽管大多数的干细胞从牙科组织表现出类似的呈形态学和单独使用能力在体外扩张,他们从不同领域的东方产后干细胞。干细胞领域指在活的有机体内或在体外干细胞微环境,维持干细胞处于静止状态(46,47]。然而,组织损伤后,周围的微环境与干细胞调节细胞命运。干细胞行为(自我更新和分化为组织再生)主要是由这些不同的微环境包括生长因子、细胞因子、细胞外基质成分,以及细胞信号通路(48]。老鼠的最近的一项研究表明,缺口信号通路起着至关重要的作用在控制DTSCs命运在牙齿发育(49]。此外,我们先前的研究发现ANCR促进增殖和成骨分化的PDLSCs通过激活规范Wnt信号通路(34]。规范化Wnt信号通路是一个古老的和广泛的进化途径参与成骨、脂肪形成的,神经源性干细胞的分化50]。它已经表明,表达下调ANCR促进成骨细胞分化的定位EZH2和规范Runx2表达式[33]。EZH2是一个关键的细胞内稳态和差异化监管机构与规范Wnt信号通路在干细胞(51]。基于这些研究,我们推测ANCR可能与EZH2通过规范Wnt信号通路,从而调节DTSCs分化。属于lncRNA,ANCR作为上游的监管网络。这是一个小说在调节干细胞的行为因素。因此,进一步深入调查应当进行充分评估lncRNA——的控制机制ANCR在DTSCs的增殖和分化,以及多个通路由之间的串扰ANCR。

5。结论

这项研究表明lncRNA -ANCR作为一个关键调节器DTSCs扩散和多家潜在的分化。Downregulation的ANCR提升PDLSCs的扩散,以及成骨的脂肪形成的,神经源性分化DTSCs (DPSCs、PDLSCs SCAP)。更多的工作需要调查通过调节相关基因和信号通路ANCR控制DTSCs行为。这项研究代表了一种进步提供一种新型调节器因素进一步研究更好地理解从牙科组织干细胞的行为。

相互竞争的利益

作者否认任何利益冲突。

作者的贡献

邃,小林陈,文凯江泽民同样贡献了这工作。

确认

本研究由国家自然科学基金支持的中国没有。81371139也没有。81470754)和国家关键技术研发项目Twelve-Five年度计划,中国科技部(2012 bai07b03)。