文摘

介绍和目标。一氧化氮(NO)可以触发心脏胚胎干细胞的分化(ESCs),指示一个心原性的函数没有合成的酶(s) (NOS)。然而,NO / NOS的参与下游效应器可溶性guanylyl环化酶(国网公司)和cGMP激活蛋白激酶(PKG-I)更少的定义。因此,我们评估的参与整个NO / NOS /国网公司/ PKG-I心脏分化过程中路径。方法。鼠标的ESCs被悬滴向心脏谱系分化方法21天。NOS /国网公司/ PKG-I通路研究量化基因,蛋白质,酶的活动,在分化和抑制的影响。击败拟胚体的百分比(mEBs)作为cardiogenesis指数进行评估。结果与讨论。酶的基因和蛋白表达增加在分化与独特的动力学和蛋白质具有酶功能。外生管理没有加速而封锁PKG-I强烈cardiogenesis放缓。只在早期阶段,国网公司是有效抑制NOS封锁无效。号/国网公司/ PKG-I通路,PKG-I似乎在心脏成熟发挥突出的作用。结论。我们得出结论,外生管理没有和其他药理策略能够增加PKG-I的活动提供了新的工具来调查,促进分化的心脏发生的前兆。

1。介绍和研究的目的

一氧化氮(NO)、生物活性自由基,是哺乳动物细胞的胞内和胞间信使[1,2),它的信号级联中起着重要的调节作用在许多生理和病理条件下(1,3]。除了它的公认功能endothelium-derived平滑肌松弛(4[]、突触传递和免疫反应的5),不也是一个心脏功能的关键调节器通过调制兴奋收缩偶联的6,7)和心肌增长(8]。

没有是由三种不同的酶(即神经元、诱导和内皮一氧化氮合酶,nNOS,进气阀打开,和以挪士)和行为直接或间接通过刺激可溶性鸟苷酸环化酶(国网公司),heterodimeric酶,随后形成的环磷鸟苷(cGMP)。其他直接影响,cGMP激活蛋白激酶G I型(PKG-I)丝氨酸/苏氨酸激酶发挥许多监管职能中心(9]。在心肌组织激活水平低NO / NOS /国网公司/ PKG-I信号增加收缩性,而高水平发挥负性肌力作用[7]。在此设置许多PKG-I功能性蛋白质基质,包括l型钙通道和受磷(拉钮),在磷酸化形式缓解其抑制作用sarcoendoplasmic Ca-ATPasi 2型(SERCA2),提高钙吸收到sarcoendoplasmic网(SR)和减少胞质钙(自由10,11]。

越来越多的证据指向的参与活性氧(ROS),如没有,氢氧自由基(OH⁻)、过氧化氢(H₂O₂)和超氧化物阴离子()作为重要的触发心脏胚胎干细胞的分化(ESCs) [12,13]。在干细胞和祖细胞,生理需要的细胞内ROS水平维持基因组稳定和增加扩散/迁移功能(14,15]。此外,这套面积和合作者16]表明,活性氧以及不可能参与cardiomyogenesis。此外,治疗老鼠ESCs(制)和抗坏血酸上调NADPH氧化酶亚型,进而磷酸化以挪士和增加cGMP的形成导致增强心脏分化未分化的体细胞。有趣的是,许多研究表明NO / NOS /国网公司/ PKG-I通路发挥心血管效应在缺血再灌注损伤17),提供基础假设NO / NOS /公司治理文化/ PKG-I途径可能参与心脏干细胞分化的居民。

在EZ1制,以挪士(mNos3),国网公司(mGuCy)基因表达在心脏分化的早期阶段(18]。此外,治疗酶斯卡灵和人类的ESCs NO-donors和国网公司催化剂单独或组合增加心脏的mRNA表达特定的转录因子Nkx2.5和肌球蛋白轻链2,暗示可能心原性的角色没有/国网公司/ PKG-I通路在未分化的前体细胞19]。最近,任何捐助者不S-nitrosocysteine证明加强心脏分化和自发收缩D3制(20.),确凿的心原性的函数的假设没有/国网公司通路的下游效应PKG-I。

测试这个假设我们使用CGR8制诱导分化向心脏血统和评估的参与整个信号通路NO / NOS /国网公司/ PKG-I分化过程。我们的数据提供了证据支持的假设外生NO-donors管理,有可能促进心脏分化的心脏发生的前兆。

这些数据已经被国会的部分作为一个抽象的欧洲心脏病学会基础心血管科学委员会在佛罗伦萨举行的2016年7月8 - 10 (21]。

2。材料和方法

2.1。小鼠胚胎干细胞的文化

小鼠胚胎干细胞(制)的CGR8使用(22]。细胞在37°C和5%传播有限公司₂格拉斯哥在明胶涂层菜,使用最低基本培养基BHK-21 (G-MEM BHK-21),补充10%胎牛血清(的边后卫)(GIBCO表达载体,米兰,意大利),谷氨酰胺2毫米,0.1毫米2-mercaptoethanol, 1毫米丙酮酸钠,1%不重要的氨基酸,1%青霉素和链霉素(西格玛奥德里奇、米兰、意大利),和1000单位/毫升的白血病抑制因子(生活,10μg / mL;微孔、意大利米兰)。细胞培养的所有其他产品购买从GIBCO表达载体。分裂之前,文化被胰蛋白酶/ EDTA(西格玛奥德里奇)在室温下30 - 60秒,以消除分化细胞。这些文化条件允许CGR8制round-growing保持未分化表型特征,紧密,refrangent殖民地。

2.2。ESCs CGR8分化成胚状体的身体控制条件

CGR8制是分化使用悬滴法[23]。滴区分中包含600个细胞被播种的盖子细菌学的菜肴。当盘子被关闭,这使得细胞在悬浮聚合和成长(2天),最终形成老鼠拟胚体(mEBs)。分化培养基,在控制条件下,由媒介G-MEM BHK21补充10%的边后卫,谷氨酰胺2毫米,0.1毫米2-mercaptoethanol, 1毫米丙酮酸钠、青霉素和链霉素不必要的氨基酸,1%和1%。此后,mEBs resuspended在分化培养基和悬浮生长在细菌学上的菜4天。第六天,mEBs镀在明胶涂层菜肴,附呈。从电镀24-36 h后,心脏分化是可辨认的自发收缩的发生区域。mEBs被倒置显微镜每天监测;殴打mEBs从7天算21 (D7-D21)。mEBs成熟之后,根据实验协议不超过21天。

2.3。药物管理NO-Donors或没有通路抑制剂在CGR8 ESCs的分化成胚状体的身体

平行实验,CGR8制在控制条件和分化的存在任何捐助者不或NO-sGC-PKG-I通路的抑制剂。药物管理从天0(悬滴形成)的实验,每2天更新媒体:1、4:3 6-Dianhydro-D-glucitol 5-nitrate(单硝酸异山梨酯是50μM,西格玛奥德里奇)属于防心绞痛的药物类临床用于治疗心绞痛的预防,食管痉挛,作为任何捐助者不心脏衰竭。1 h - (1、2、4) Oxadiazolo [4, 3] quinoxalin-1-one (ODQ 1μM,西格玛奥德里奇)是一个具有高度选择性,不可逆转,heme-site抑制剂的可溶性guanylyl环化酶(国网公司)。 -Methyl-L-arginine (L-NMA, 100μM -西格玛奥德里奇)是最常用的抑制剂之一的一氧化氮合酶(NOS)。5823 KT (1μM,西格玛奥德里奇)是PKG-I的选择性抑制剂。

2.4。具备干细胞的分子表达特定和NOS-sGC-PKG-I通路基因和心脏

总RNA的隔离,逆转录(RT)和实时PCR (Q-PCR)。采mEBs样本在不同跨度为分化的分子评估通过RNA提取,反转录,使用定量实时PCR和基因表达分析(Q-PCR)。

总RNA隔绝mEBs使用NucleoSpin®RNA工具包(Macherey-Nagel, Duren,德国)。随后,互补DNA(互补)合成了1g总RNA使用iScript™互补脱氧核糖核酸合成装备(Bio-Rad、米兰、意大利)。所有这些步骤进行根据制造商的指示。

实时定量PCR (Q-PCR)使用默认thermocycler执行程序对所有基因:1分钟95°C的预培养紧随其后40周期为15秒95°C, 1分钟60°C和15秒95°C, 1分钟60°C, 1分钟95°C。个人实时PCR反应进行了10μL卷在一个96孔板(应用生物系统公司™,伦敦,英国)包含2μL RNAse-free水,1μL意义和反义引物(Bio-Rad),和5μL iTaq™SYBR®绿色环球Supermix (Bio-Rad) + 2μng / L的cDNA样本(5μL)。每个实验重复一式三份,和定量PCR分析与三角洲Ct-method一式三份和分析。鼠标Glyceraldehyde-3-Phosphate脱氢酶(mGapdh)是用于内部规范化。结果分析了假设100%的最大价值在每个实验中基因表达。引物的扩增子上下文序列表1中列出的年代(见补充资料在网上http://dx.doi.org/10.1155/2016/2868323)。

2.5。表达NOS3、国网公司和PKG-I mEBs成熟期间蛋白质

通过免疫印迹分析蛋白质含量进行了分析。在不同的成熟的日子里,mEBs与100年收集μL冷磷酸盐(PBS)和均质裂解缓冲包含50 mM Tris-HCl pH值8.0,150毫米氯化钠,1毫米EDTA,特里同x - 100 0.5%,完整的蛋白酶抑制剂(罗氏诊断、米兰、意大利)。匀浆在冰上孵化20分钟。然后,悬架是用冰波超声发生器的45分钟。离心后(12000×g 10分钟4°C),包含100整除μg(8%的丙烯酰胺NOS3)或50μg总蛋白质(10%的丙烯酰胺国网公司和PKG-I)涂抹在sds - page。蛋白质被发现使用兔子policlonal anti-NOS3(以挪士;1:1000;美国圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX),小鼠单克隆anti-sGC -β1(1:1000年,圣克鲁斯生物技术)和兔多克隆anti-PKG-I(1: 1000年,细胞信号,丹弗斯,妈,美国)主要抗血清和相应的二次抗体。光密度分析“ImageJ”软件和结果规范化GAPDH免疫反应性(1000:兔抗血清、细胞信号)作为内部控制。使用bicinchoninic酸测定总蛋白进行量化(BCA法)。Bicinchoninic酸和CuSO₄解决方案从西格玛奥德里奇被购买。

2.6。号和sCG活动

环磷鸟苷细胞NOS和国网公司活动的内容被评估为标志。14天mEBs洗了温暖的杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM),与100年孵化μM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX),非特异性抑制剂的营地和cGMP磷酸二酯酶(IBMX-DMEM) 15分钟在37°C。然后,mEBs治疗根据表1总量的10毫升。

所有的药物都溶解在IBMX-DMEM和孵化了37°C。治疗结束时,mEBs迅速冻结在−20°C到使用和维护。cGMP (pg /毫克的总蛋白质)是通过测量酶联免疫试剂盒(恩佐生命科学,英国埃克塞特)。简而言之,mEBs于200年恢复μL冰水,用冰波超声发生器的30分钟,然后离心机(12000×g 10分钟4°C)。二十μL样本用于蛋白质的测定(BCA法)。每个样本酸化(200μL盐酸0.1,15分钟后在室温下),涡流,然后离心机(12000×g 10分钟4°C)。cGMP量测量使用酶联免疫试剂盒根据制造商的协议和吸光度是读Wallac维克多分光光度计(珀金埃尔默,米兰,意大利)。IBMX和S-nitroso-N-acetyl-DL-penicillamine(提前S-nitrosothiol作为任何捐助者不)从西格玛奥德里奇被购买。

2.7。PKG-I活动

评估PKG-I活动,丝氨酸/苏氨酸磷酸化蛋白质(包含−1或+ 1苯丙氨酸和色氨酸残基)测量。简单地说,在天14 mEBs洗DMEM和孵化IBMX-DMEM 15分钟在37°C。然后,mEBs治疗根据表2总量的10毫升。

所有药物溶解在IBMX-DMEM和孵化了37°C,然后mEBs然后迅速冻结在液态氮在−20°C到使用和维护。整除的细胞蛋白(20μg)涂抹在10%的丙烯酰胺凝胶和丝氨酸/苏氨酸磷酸化蛋白质显示使用兔子anti-phospho-serine /苏氨酸(1000:兔抗血清,Abcam,剑桥,英国)。光密度分析使用“ImageJ”软件和结果规范化GAPDH和内部控制免疫反应性。如果样品密度(GAPDH规范化)在每个实验设置为100%。整除相同的细胞蛋白(50μg)涂抹在10%的丙烯酰胺凝胶和分析了PKG-I已经描述。membrane-permeant,稳定催化剂PKG-I Sp-8-pCPT-PET-cGMPS (cgmp)是获得生物测井,生命科学学院(德国不来梅)。

2.8。剂量LDH酶斯卡灵的条件培养基

组织损伤后细胞LDH释放。自从LDH是一个相当稳定的酶,它已被广泛用于评估细胞损伤和中毒。mEBs从第0天保持在100年的存在μM L-NMA, 1μM ODQ, 1μM KT5823,或控制条件和上层清液收集在不同天的分化和冷冻直到使用。的酶LDH mEBs上层清液是由乳酸脱氢酶活力测定评估工具包(西格玛奥德里奇)后,制造商的方向。NADH是专门检测到比色测定使用Wallac维克多分光光度计(450海里)。

2.9。数据分析和统计

所有的数据都表示为平均值±标准平均误差(s.e.m)。离线数据分析是由使用起源9.1(美国马MicroCal软件Inc .)。统计分析是由使用方差分析,其次是Bonferroni事后测试。一个概率值小于0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。mNos3、mGuCy1b mPrkg1在制和心脏分化

基因表达分析mNos3、mGuCy1b mPrkg1心脏分化在未分化的制和执行。数据显示,mNos3、mGuCy1b mPrkg1表示在未分化的细胞处于非常低的水平,但他们集体增加心脏分化期间,尽管time-courses不同。mNos3(图1(一)显示一个钟形曲线,一个健壮的提高在第五天,第八天峰,一个关键的发展时期在体外心脏发生的过程。mGuCy1b和mPkg1强劲增长在第五天,第八天达到最大值,并维护这些表达式在年底前成熟过程(21天)。

在相同的准备,我们监测心脏分化制,分析基因表达谱的多能性(mOct4和mNanog),早期mesodermic (mBrachyury)和成熟心脏标记(mNkx2.5, mMef2c和mGata4)基因。过程后,多能性转录因子mOct4显然表达下调,正如预期的那样,表现出镜时间进程mPrkg1相比,mGuCy1b, mNos3在第一阶段(图1 (b))。类似于mOct4, mNanog表达式稳步下降(图1)在分化;相反,心脏转录因子mNkx2.5(图1 (b)),mGata4(图1 (b)),mMef2c(图1)从0到天8逐步调节,然后下降,之后一个钟形曲线几乎重合mNos3。中胚层标记mBrachyury显示瞬时表达式模式达到第二天(图1)。

3.2。sCG NOS3, PKG-I蛋白表达

在心脏分化的不同阶段,NOS3 sCG, PKG-I蛋白质含量进行评估通过免疫印迹分析。结果如图2(一个),2 (b),2 (c)。制所有的酶都检测不到;NOS3和PKG-I蛋白出现在第五天的分化,国网公司后来发现表情。NOS3最大水平8天然后拒绝,被检测到在第十天,基本上没有在16天(图2(一个))。sGC-1β在第十天明显,迅速增加到16天(图2 (b)在12天),显示出相似的价值观。最后,PKG-I显示较慢,在分化过程中逐步增加,到达了一个高原水平在一天第十天保持不变,直到16(图2 (c))。图2 (d)显示了蛋白质的叠加time-courses在整个分化过程。

3.3。可溶性GC和NOS酶的活动

评估国网公司和NOS酶的活动,我们估计cGMP生产在第14天在不同的实验条件,一个时间点,当蛋白质都明确表示(图3)。

60分钟后与IBMX孵化,在控制条件cGMP浓度0。.187 pmol /毫克的蛋白质。与L-NMA孵化后,NOS抑制剂,cGMP数量略下降到约60%,这表明在控制条件NOS基底活动能够引起温和,尽管检测,国网公司刺激。提前或不是,两个NO-donors,显著增加cGMP水平超过3次(3.80和3.25,分别地。)相比,控制。当吸附或添加在国网公司抑制剂ODQ的存在,增加了cGMP明显(临时)或强烈(是)预防,给值并不不同于控制。

3.4。PKG-I酶活性

PKG-I活动被磷酸化蛋白质的免疫印迹分析评估。数据4(一)和4 (b)面板显示代表磷酸化蛋白质的获得在不同的实验条件,由半定量的分析分析(图4 (c))。NO-donors(提前和并)显著增加蛋白质磷酸化与控制;同样,cGMP膜渗透cGMP显著增加蛋白质磷酸化250%(图4 (d))。PKG-I抑制剂KT 5823并没有大幅修改蛋白质磷酸化与基底条件相比,虽然显著预防50% cgmp引起的磷酸化(图4 (d))。

PGK-I蛋白质表达水平在每个实验样本用来量化检测磷酸化非常相似(图2 s),排除的可能性的差异磷酸化可以依赖PKG-I表达可变性。

3.5。功能评估的影响任何捐助者不号,国网公司,PKG-I抑制自发殴打微分拟胚体

评估的影响NO / NOS /国网公司/ PKG-I通路的功能标记心脏分化,我们评估的百分比超过拟胚体在不同的实验条件。正如所料,在控制条件下击败从第八天的分化,增加达到一个极大值在12天(图5插入)。

在平行实验中,我们评估了效果施加任何捐助者不还,这NOS-inhibitor L-NMA,国网公司抑制剂ODQ,或包裹I-inhibitor KT5823,设置控制每天100%(图的值5)。的存在,不是打相比显著增加的比例来控制评估在第八天(与控制和其他疗法),9(略高,为天与其他疗法)和10天(对控制和其他疗法)。此后,价值观成为无特征的控制。ODQ减少mEBs击败天8和9 ();然后的差异就消失了。在第八天KT5823强烈跳动减少()和维护这种抑制作用常数。抑制NOS没有显著减少跳动在任何阶段的成熟(图5)。

3.6。乳酸氢化酶的活动

自收缩活动的减少在镜子NO-sGC-PKG-I抑制剂的存在可以观察到所选药物的潜在毒性,我们执行的用量LDH作为一种特定的细胞毒性。LDH活性3。.604μ/毫升在第四天控制条件。这个值保持相似,独立的成熟的一天。LDH活性增加的上层清液mEBs对待ODQ在第四天,但后来它回到控制价值,表明相对毒性引起的ODQ初的治疗,然而不久消失。所有其他的治疗没有显著影响LDH活性。结果如图3所示。

4所示。讨论

评估心脏分化在体外先决条件确定因素和药物能够增加的心原性的潜能干细胞不仅在器官形成过程中,而且在治疗和赔偿后心脏的退化过程。尤其是心脏缺血性侮辱之后,self-reparative程序是有限的,因此需要更多的研究来确定新的有效的治疗方法和/或小说机械的见解能够加强药物治疗的作用过程。其中,NO-donors治疗缺血和缺血后侮辱的首选。在心脏,内生和外生不行为通过激活产生cGMP的国网公司,进而增加了PKG-I磷酸化活动,最终效应酶负责复杂的监管功能的心脏收缩性(7]。的函数是否NO / NOS / cGMP / PKG-I通路也延伸到心原性的干细胞只是部分已知的过程。因此,在我们的研究中,我们调查了彻底的心脏分化途径的参与制,指导我们的努力没有的生理和药理作用(从内部由NOS3或体内管理不是)的主要下游效应器国网公司和PKG-I。

CGR8 ESC心原性的过程中,我们的数据显示,表达mNos3, mGuCy1b, mPkrg1相似的增加心脏特定基因模式和多能性基因的减少(Oct4和Nonog)。特别是mNos3基因最大表达8天,当心脏特定基因达到最大表达式(图1 (b))。此后,基因表达水平下降,在整个过程中保持稳定。有趣的是,我们的数据以挪士表达的时间进程区分CGR8制符合制中发现抗坏血酸治疗(24]。在方差以挪士,mGuCy mPkrg1表达式出现延迟和保持稳定高整个发育时期。这些数据证实结果已经报道的心脏分化不同的细胞系,EZ1鼠标ESC (18),类似的时间模式Nos3 / sGuCy表达检测。值得注意的是,我们的调查记录分析扩展到mPkrg1,下游途径的酶,负责目标蛋白质的磷酸化。更重要的是,我们的研究提供了证据,整个蛋白质没有通路中的面板组成(NOS3-sGC-PKG-I)是心原性的功能表达系统;将会呈现出一种非常相似的发育时间进程的相对主记录,因此提出一个完整的翻译机器在微分系统。事实上,NOS3蛋白质容易检测的分化,而其表达减少后期发展阶段。国网公司最大限度地表达了在16天的区别,晚于各自的基因,即使少量的蛋白质已经检测到第十天。PKG-I显然可以从第五天开始;增加后第8天保持这种水平,直到结束的分化过程。功能上,所有的酶具有典型活动,由直接或间接测量它们的代谢在第14天或功能性产品。因此,cGMP数量被刺激增强国网公司NO-donors和减少阻塞NOS活性。 Moreover, PKG-I mediated phosphorylation capacity was increased by NO-donors and cGMP stable analog, showing a full functional maturation of the enzymatic system attained during cardiac differentiation. A similar time-course of NOS3-sGC-PKG-I protein expression has been reported for EZ1 mouse ESCs [18),国网公司活动和增强NO-donors在第14天测量。与我们的研究中,方差国网公司在EZ1鼠标ESCs检测从第五天到第七天,差异可能依赖于特定细胞系。

心脏血统规范的指标之一是自发mEB击败地区的发展,必要的,CGR8 ESCs通常会出现分化开始后7 - 8天,然后12天左右达到顶峰。我们没有观察到管理外生或内生cGMP / PKG-I通道封锁是能够改变的数量和时机打在相反的方向。值得注意的是,增加的殴打后观察外源性没有治疗的开始分化(第八天,图5)表明,没有通路的刺激可以促进心脏的ESCs的分化。这个假设被观察到类似的发现证实了霍奇和合作者20.)在不同的转基因公司,接触S-nitrosocysteine,外生任何捐助者不,增加承包区域的数量在早期阶段发现的区别(10天)。在相同的设置,抑制内源性没有无效的生产通过NOS封锁在减少承包区域的百分比(20.]。因此,不同的研究报告,NOS抑制基底条件无法影响自发击败mEBs(百分比24]。我们的数据扩展上述结果提供的证据表明,没有下游效应器国网公司和PKG-I也重要的是参与了心原性的过程。的确,5823年存在ODQ或KT,国网公司,和PKG-I抑制剂,分别出现大幅收缩表型的延迟(图5),导致认为整个信号通路有必要完成心原性的过程。有趣的是,国网公司抑制能够减少的百分比超过mEBs只在开始分化(即。,until day 10), when, though sGC protein expression is low, its functional activity is sufficient to allow beating appearance, as revealed by ODQ effect. Since sGC inhibition was effective to delay beating appearance, whereas blockade of endogenous NO production did not produce any evident effect, we hypothesize that other endogenous activators of sGC, such as carbon monoxide (CO), might be involved in the differentiation process. CO is an endogenous activator of sGC with a 50 time lower efficacy than NO [25),由血红素加氧酶1和血红素加氧酶2。我们的初步数据表明,血红素加氧酶1和2基因表达与没有CGR8 ESCs的心脏分化途径的酶,因此确凿的公司可能代表一个潜在的候选人国网公司在此设置激活。考虑到血红素加氧酶1 upregulation在心脏干细胞细胞凋亡中起着保护作用[26],我们可以假设在我们的实验条件有限公司可以在国网公司增强或替代没有刺激,心脏成熟的关键酶。进一步的研究是必要的澄清CO和血红素加氧酶的作用在ESC生物学和心脏分化。

封锁我们的数据表明,PKG-I强烈延迟自发击败领域的发展在整个分化过程方差sGMP抑制的影响有限,这一发现表明一个主要角色的PKG-I sGMP心原性的过程。这个主要函数的PKG-I心原性的分化同意认为基底活动也出席cGMP水平很低,仅足以提供一个最小的酶活性(27]。此外,PKG-I活动的核心作用心原性的过程中也证明了他达拉非治疗,一个cGMP-specific磷酸二酯酶5 (PDE5A)抑制剂,这证明了促进生存和间充质干细胞在大鼠模型中扩散梗塞[28]。即使在一个不同的模型中,获得这些数据显示PKG-I活动共享的一个重要的角色不同的干细胞前体,提高心原性的潜力。

我们的研究结果表明,封锁NOS-cGMP-PKG-I通路在发展中mEBs与LDH的释放没有联系上层清液;这表明封锁一个特定的程序,而不是一个未指明的毒性可能抑制心脏分化的机制。

在我们的研究中我们没有评估分子机制连接PKG-I活动心原性的过程。这个问题需要进一步的研究的目的除了调查;然而一些有趣的线索可能考虑PKG-I在细胞内钙的作用^{2 +}体内平衡。在早期分化阶段,区分ESCs的自发收缩依赖于自发的胞质免费的Ca^{2 +}振荡。这些后者主要取决于SR放电和随后的再摄取。的确,mrna /描述成熟的蛋白质功能SR在成人心脏细胞(2型阿诺定受体、junctophilin-2、隐钙素拉钮,和SERCA2a)已经表示在区分ESCs的早期阶段和之前的出现自发收缩(29日]。此外,在相同的设置功能inositol-1, 4, 5-trisphosphate受体(IP3R)通道被证明有助于Ca^{2 +}有节奏的放电从老30.),也就是说,Ca的复杂网络^{2 +}ESCs调节蛋白质已经表达的功能区分。值得注意的是,在成人心脏细胞的蛋白质被PKG-I活动的目标(9),从而产生胞内Ca的基本管理功能^{2 +}体内平衡。特别是,PKG-I磷酸化拉钮和提高Ca^{2 +}再摄取到SR加速SERCA2a活动(10,11];这种机制增加SR Ca^{2 +}内容可能加速/ Ca^{2 +}骑自行车在SR和细胞溶质之间。PKG-I也目标/钠钙交换器(NCX),进而导致其胞质Ca的反模式^{2 +}振荡。据报道,最后,国网公司/ PKG-I通路激活胞质Ca^{2 +}通过反向流入模式NCX活动(31日]。在我们的设置中,我们假设在分化PKG-I日益增长的函数表达式,通过调制的胞质Ca^{2 +}骑自行车,可能有利于Ca的感应^{2 +}出院SR和心脏发生的的发展过程。

总之,我们的研究支持这个想法,PKG-I通路是一个关键的启动子驱动ES细胞分化的心肌细胞。虽然进一步的研究是必要的,这些发现表明,治疗能够增加PKG-I活动在活的有机体内(即。,NO/CO-donors, direct activator of sGC, and PDE5 inhibitors) could be effective in stimulating resident cardiac stem cells to differentiate in mature cardiac cells, favoring cardiac healing and ameliorating the ischemic insult. A thorough preclinical assessment of survival, proliferation, and cardiac differentiation of stem cells will clarify the plausibility of this hypothesis and will shed novel light into the benefits of NO-donors in cardiac ischemia and other degenerative pathologies.

信息披露

现在的地址Matteo Zanardelli opi开发。,加以,蒙扎e Brianza,意大利。

相互竞争的利益

所有作者宣称他们没有财务利益冲突。

作者的贡献

瓦伦蒂娜卢卡雷利,Alessia Vona弗朗西斯卡螺旋器,洛伦佐Diolaiuti,马特奥Zanardelli执行所有实验。劳拉Sartiani和瓦伦蒂娜卢卡雷利参与的设计研究和帮助起草。Paola Failli构思研究计划的设计和起草。所有的作者,包括承认的人,阅读和批准最终的手稿。瓦伦蒂娜卢卡雷利和Alessia Vona同样执行实验。

确认

作者感谢教授伊丽莎白Cerbai阅读手稿及其建议。这项研究是由PRIN2010 (Progetti Ricerca感重回2010 - 2011,2010 bwy8e9,意大利的指令,大学和研究)和佛罗伦萨大学的。弗朗西斯卡螺旋器和Matteo Zanardelli收到的资助烤鸭Cassa di Risparmio di佛罗伦萨。

补充材料