小鼠卵黄干细胞分离和鉴定的改善

摘要

女性生殖系干细胞(FGSCs)或卵母细胞干细胞(OSCs)具有产生新生卵母细胞的能力，从而为对抗卵巢衰老和女性不孕症打开了一扇新的大门。然而，OSCs的生产和鉴定对研究人员来说是困难的。卵巢中少量的这些细胞导致OSCs的获取失败。此外，在以往的研究中，OSCs在体内形成卵母细胞通常是通过免疫荧光或免疫组化的组织切片来证实的。STO或MEF喂食细胞来源于小鼠，而不是人类。在我们的研究中，我们修改了方案。细胞经卵巢消化培养2-3天，磁激活细胞分选(MACS)纯化。将注射egfp阳性OSCs的小鼠卵巢和胎儿置于玻片上，在显微镜下直接观察卵母细胞和子代形成情况。此外，还将人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)作为喂养细胞支持OSCs的增殖。结果表明，所有改进的方法均能显著改善OSCs的生成和表征，hUC-MSCs作为饲养体将有助于人类OSCs的分离和增殖，避免小鼠污染。

1.介绍

卵巢衰老是以卵泡库的进行性下降为特征的，女性遭受与衰老相关的健康问题和心理压力。2004年以来，女性生殖细胞承诺相关干细胞的研究出现，并逐渐增多，成为热点[1- - - - - -8］.吴集团首次报告的母种系干细胞（FGSCs）或oSCS干细胞（OSCS），随后由Tilly组报告[9，10，证明哺乳动物卵巢中存在生殖系干细胞群[11］.然而，在开始分离和鉴定FGSCs/OSCs之后，针对这些观察结果的争议仍然存在[12- - - - - -15］.也许这首先是因为没有足够的综合证据，特别是来自FGSC / OSC的体内再生卵母细胞或卵泡，以证明现有的观察和挑战传统范式，其次是因为FGSC / OSCS相关并发症的生成和表征阻碍了新的研究人员这个领域。例如，在从小鼠的两步酶促消化的过程中获得稀有细胞，导致磁性活性细胞分选（MACs）或荧光激活的细胞分选（FACS）之后的甚至最小细胞，这意味着它非常难以成功地建立食品干细胞系。此外，新人对新人进行了比较困难，以便在卵母细胞或后代观察分化的观察。因此，我们试图进行一些修改以促进这些实验[9，10，16，17］.因此，我们的研究目的是为了促进OSCs的衍生和识别，克服获取OSCs谱线的困难，吸引更多的研究人员进入这一领域。只有更多的研究人员在这一领域开展工作，并发表关于OSCs的更全面的研究，我们才能确定OSCs的真实性质，从而结束这场争论。首先，我们从消化后的卵巢中分离出的细胞总数培养2-3天后进行细胞悬液的MACS;因此，有更多的细胞和更多的活细胞可以根据抗体进行分类。另外，消化后培养2-3天，可以避免在MACS过程中进一步损伤，在一定程度上恢复细胞活力。其次，通过连续切片的免疫荧光或免疫组织学鉴定OSCs的分化能力，大大降低了从表达egfp的OSCs中找到阳性卵母细胞或卵泡的可能性，增加了难度。因此，我们开发了一种新的方法，在显微镜下直接可视化表达egfp的卵母细胞或卵泡的荧光。简单地说，切除卵巢注射表达egfp的OSCs;然后，这些卵巢被机械或酶分散，释放卵母细胞或卵泡，这些卵母细胞或卵泡与剩余组织一起收集，在荧光显微镜下用盖玻片显示。 Next, we found that the fetus at E12.0 can be visualized under fluorescence microscopy to verify if EGFP-positive mice are generated. This helps the investigators to obtain the outcomes of differentiation as fast as possible and does not need any expensive instruments like live imaging system. Finally, the human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) were employed to support the growth of OSCs, which aim to establish human OSC lines without any contamination from mouse. In brief, using these modifications, the isolation and identification can be easily finished, and the improvement will facilitate and prompt future researches on the oogonial stem cells.

2。材料和方法

２.１.动物

本研究使用的6周龄C57BL/6小鼠购自湖北省医学实验动物中心(武汉)和中国医学科学院实验动物中心(北京)。所有涉及动物的程序均经同济医学院动物护理和使用委员会批准，并按照国家研究委员会《实验动物护理和使用指南》进行。

2．2.OSCs的分离和培养

采用上述方法从6周龄小鼠中分离出OSCs [9，10，16，17］.短暂,雌性老鼠的卵巢解剖和胶原酶/ Dnase我剁碎成浆溶液(美国沃辛顿),然后在37°C孵化20分钟重复一次或者是紧随其后的是胰蛋白酶治疗5 - 10分钟和最后胰蛋白酶中和10%胎牛血清的边后卫。悬浮液离心，上清液去除后，置于无STO给料层的6孔板上。2 ~ 3天后，用MACS酶解并纯化细胞，使用Fragilis抗体和山羊抗兔IgG微珠[18］.分选后的细胞用最低必需培养基培养到育细胞上α介质(MEM -α) (3261 -102, Invitrogen)， 10%胎牛血清(06902,Stemcell)， 1 mM丙酮酸钠(P2256-25, Sigma)， 1 mM非必需氨基酸(11140-050,Gibco)， 0.1 mMβ-巯基乙醇(ES-007-E, Millipore)， 1000单位/mL LIF (ESG1106, Millipore)， 1 ng/mL bFGF (13256-029, Gibco)， 10 ng/mL EGF (PHG0311L, Gibco)， 20 ng/mL人GDNF (212-GD-010, R&D)， 1×-concentrated N2-supplement (AR009, R&D)， 1×-concentrated青霉素链霉素。根据之前发表的报道进行卵母细胞干细胞(OSCs)的传代培养。

２.３.STO细胞系和hUC-MSCs的培养与制备

将OSC覆盖到从ATCC的显着灭活的STO细胞饲养剂上。STO cells were cultured in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) with high glucose (Life Technologies), supplemented with 1 mM nonessential amino acids (11140-050, Gibco), 2 mM glutamine, 30 mg/L penicillin, 75 mg/L streptomycin, and 10% FBS (Invitrogen), which was described in previous reports. To prepare STO cell feeder, the STO cells were first treated with mitomycin C (10 μg/mL, Sigma) 2-3小时，用PBS冲洗，24孔板上镀。

人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)由泰和医院胚胎干细胞研究湖北省重点实验室捐赠，培养基制备及细胞培养按其描述[19］.为了制备HUC-MSCs细胞饲养器，如STO电池，用丝霉素处理通道3-5的HUC-MSCs（10 μg / ml，sigma）3小时，洗涤，并在24孔板上镀。

2.4。免疫荧光

在室温下用4%多聚甲醛固定15分钟，然后在封闭液(10%正常山羊血清PBS)中室温孵育1小时。孵化后在37°C 1 h和初级抗体(兔多克隆anti-MVH(1: 200稀释,ab13840 Abcam),兔多克隆anti-Fragilis(1: 500稀释,ab15592 Abcam)), osc孵化了FITC共轭二次抗体(山羊anti-rabbit免疫球蛋白g, 1: 1000稀释),然后被DAPI染色,持续15分钟。

2．5．逆转录聚合酶链反应

根据制造商的指示，用Rnaiso试剂（Takara）提取总RNA。大约2 μg的RNA用Dnase I处理，去除微量的DNA污染;然后，按照制造商的说明书使用转录逆转录酶(transcriptor cDNA first strand synthesis kit, Roche)合成cDNA。最后对cDNA进行PCR扩增，引物列于表中1参考其他报告[9，10］.

2.6。OSCs的核型分析

细胞传代3 d后，用含有80 ng/mL秋水仙碱的OSC培养液处理3 h，然后用40 mM KCl低渗处理30 min。甲醇-醋酸(3:1)固定1 h后，吉氏缓冲液染色，显微镜下观察。

2.7。慢蛋白载体在OSCs中的自我失活

为观察转导的OSCs是否不能产生感染性慢病毒颗粒，将表达EGFP的感染OSCs接种在6孔板上，不改变培养基，培养至融合。收集上清液，0.45过滤μm孔大小的聚醚砜膜，1或2 mL与未表达EGFP的野生型OSCs孵育。然后观察野生型细胞EGFP的表达情况。

2.8。碱性磷酸酶染色

碱性磷酸酶活性由AP检测试剂盒(1101-050，四大赛，中国上海)根据厂家说明书测定。简单地，将培养皿上培养的细胞用4%多聚甲醛固定1-2分钟，PBS洗涤2次，TBST溶液孵育。最后按说明用A、B、C三种溶液配制AP染色液，加入细胞中15分钟。将细胞置于显微镜下观察。

2.9。慢病毒载体感染OSCs并移植到受体小鼠

表达EGFP的慢病毒载体及其包装病毒颗粒购自中国上海Genechem公司。根据公司手册，已建立的OSCs被感染。感染后至少1周，胰酶切成细胞悬液，约1 × 10⁴根据先前描述的协议将细胞注射到受体小鼠的每个卵巢中（世界精密仪器，美国）[9，16］.

2.10。南部的印迹

通过使用特异性引物的模板从携带EGFP基因的质粒DNA的PCR扩增通过PCR扩增合成了Southern印迹的DNA探针：5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3'和5'-CGTCCTCGTGTGTGG-3'。电泳和纯化523bp扩增产物。通过使用挖掘高素DNA标记和检测启动试剂盒I（Roche）来完成Digoxigenin标记。从用PSTI消化的后代的尾部和消化的DNA样品中提取基因组DNA和25-30的消化DNA样品 μG在0.8%琼脂糖凝胶中电泳。质粒DNA作为阳性对照。分离的DNA片段转移到0.45μm尼龙膜与UV交联固定;然后进行杂交和严格清洗。最后，使用抗抗地高皂苷碱性磷酸酶(AP)及其底物进行检测，使用上述DIG检测试剂盒(罗氏)，按照制造商的说明书进行。

3.结果

3．1.OSCs的分离和长期培养

根据Zou等人改进的MACS方法，我们采用Fragilis作为OSCs选择的标记[18］.如果对切除的卵巢进行酶解处理，并迅速进行MACS，从消化后的卵巢中提取的细胞数量非常少，而且由于消化和MACS两步制备，细胞的活性会进一步受到损害，因此，纯化很可能会失败。因此，我们将6个卵巢消化后的细胞培养2-3天，培养期间细胞总数增加到0.5-1 × 10⁵;然后，通过Fragilis的抗体使用这些细胞用于Macs，最后2-5×10⁴从全部细胞中获得冲洗过的“阳性细胞”(包括污染的假阳性细胞)(约5%)。然后，这些罕见的细胞在24孔板的STO喂养器上培养约5-7天，直到细胞生长汇合，用胰蛋白酶制备细胞悬液，并传代到一个新的24孔板上与STO喂养器。通常在体外培养和增殖约1个月后，这些纯化的推定OSCs可以建立。我们所建立的OSCs的形态与之前的报道相同，表现为卵球形、聚簇细胞，细胞核浆比例较大(图)1（一种））。在体外建立OSC超过1个月后，在没有饲养细胞的情况下培养这些细胞，就像Tilly等人的报告一样。[10，16］.

３．２．OSCs的基因表达、免疫荧光、AP染色和核型鉴定

在OSCs建立后，这些细胞随后被鉴定为基因表达谱，显示细胞具有女性生殖细胞的特征，而不是卵母细胞(图)1（b））。卵母细胞的特定基因包括GDF9，Nobox和ZP3，表明GDF9和ZP3对OSC弱阳性，这表明在培养过程中一些OSC已经区分了。生殖细胞基因包括脆ilis，MVH，PRDM1和TERT为OSC阳性。为了延长MVH和Fragilis的MRNA分析，这是经典的原始种系标记，检测到两种基因编码的蛋白质，发现表现出膜或血浆亚细胞定位的图案（图1(c))，与以往的报告一致。与小鼠胚胎干细胞(mesc)的强染色相比，这些OSCs的碱性磷酸酶(AP)染色呈阳性(图)1(d))。最后，我们对OSCs进行核型分型，结果显示62%的OSCs核型正常(图)1（e）和1(f))。

３．３．OSCs向卵母细胞、卵泡和子代形成的分化

为了确认这些假定的OSCs的卵母细胞生成能力，我们用慢病毒egfp表达载体稳定转染它们(图)2(一个)）.由于对卵形中含有卵形卵母细胞或卵泡种群的OSC中剩余的慢病毒颗粒的担忧，我们培养了这些EGFP-OSC并将其传代至少1周，以避免成功转染后污染的风险（最多细胞表达EGFP（图2 (b))，以下简称EGFP-OSCs)。同时，我们对EGFP-OSCs进行了自灭活，验证这些细胞是否还能产生慢病毒颗粒，结果显示野生型OSCs中没有检测到EGFP信号，说明EGFP-OSCs不产生病毒颗粒。此外，虽然转染后大部分OSCs表达了EGFP，但仍有少量OSCs不表达EGFP。随后，大约是1 × 10⁴被感染的EGFP-OSC被注射到受体雌性小鼠的卵巢中，以环磷酰胺和伯砜或血晶小鼠的卵巢进入卵巢。我们在注射后至少12天收集卵巢以检测卵母细胞和卵泡，以检测EGFP阳性卵母细胞或卵泡的存在。这些卵巢略微剖析并被针分散，然后用盖玻片放入载玻片上，并在荧光显微镜下直接可视化。我们在卵巢中成功发现了一些EGFP表达卵母细胞（图2（c））.令人惊讶的是，这些表达egfp的卵母细胞与原始未成熟卵母细胞相似，而成熟卵母细胞或卵泡几乎无法被荧光检测到。这可能是因为尽管EGFP基因已经整合到OSCs卵母细胞的基因组中，但在卵母细胞发育过程中EGFP的表达是沉默的，也可能是因为pUbi启动子在成熟卵母细胞中信号非常微弱。随后，雌性受体小鼠与野生型雄性小鼠交配，收集E12.0胚胎置于玻片上，显微镜下观察荧光。我们很容易发现egfp阳性和阴性的样本，这主要是因为这个阶段的胎儿是完全透明的(图)2（d）和2（e））;所以我们只需要一般的显微镜就可以对整合了EGFP的胎儿进行区分。最后，从每只怀孕老鼠有6-9个后代的受者那里获得后代。提取胎儿及后代的基因组DNA，并以野生型小鼠为阴性对照，进行PCR，筛选外源EGFP基因是否整合到基因组中。结果显示，胎儿和后代标本均为egfp阳性;然而，对照组都是阴性的3（a）- - - - - -3 (c)）.随后，提取来自阳性样品的PCR产物并测序，确认成功的EGFP积分（数据未显示）。进行Southern印迹分析以进一步证实EGFP的整合，并显示五个阳性和一个负样品（图3 (d)）.southern blot结果显示，第2和第5车道的整合位点比第1、3和4车道的整合位点少，说明F1代存在两种类型的转基因结构。综上所述，我们所建立的OSCs具有向卵母细胞分化并最终产生后代的能力。

3．4．STO与hUC-MSCs作为馈电细胞的比较

为了评估HUC-MSCs是否可以用作进纸细胞，将建立的OSC置于相应的STO和HUC-MSC上。在第2通道2的汇合下激化，它们被收获，并提取RNA用于反转转录PCR（RT-PCR）以检查它们的表达谱。在HUC-MSC上培养的OSC显示出与STO培养的巢状菌落形态（图4(一)）.然而，hUC-MSCs上的OSCs仍然保持与STO上OSCs相似的种系表达模式(图)4 (b)），显示HUC-MSCs可用作OSC的饲养层，特别是对于人类OSC，因此我们可以在未来没有任何小鼠蜂窝污染的人类OSC。

4.讨论

FGSCs或OSCs的存在和验证对生殖生物学具有重要意义;因此，一些研究者关注这些干细胞在成年哺乳动物卵巢中是否发生体内的卵子发生[12- - - - - -15］.对此，支持OSCs的人士也批评说:“成人器官中存在活跃和休眠两种干细胞。”16，20.- - - - - -23]，这可能提示在体内OSCs也可以代表休眠状态，导致没有卵子发生。此外，也有报道称成人卵巢中存在其他类型的生殖干细胞，提示生殖干细胞在卵巢中存在生态位[24- - - - - -29］.实际上，鉴别和分离FGSCs / OSCs清楚地证明了它们的存在，尽管OSC的体内对应物没有直接证据出生后的新生儿卵泡的直接证据。几乎，我们可以称之为体内OSC“沉默”或“显微积极状态”的状态，而不是否认这些细胞的存在[11］.此外，体外培养的OSCs已经成为研究人员的一个重要工具;例如，OSCs被用于尝试在体外分化成卵母细胞[30.]，以产生转基因动物[31，32，以及细胞疗法[33］.因此，应该提示oscs的隔离和相关研究，最终将解决此问题的争议。

之所以选择分散卵巢组织培养后2-3天，是因为这段时间可以使细胞从先前治疗的损伤中恢复活力，并达到MACS的最佳细胞数量。此外，在2-3天内，细胞也能像在体内一样最大程度地保持初始状态。另外,选择性粘附的方法可以选择删除大量的颗粒细胞和基质细胞,和这个方法可以使分散的细胞增殖甚至更长时间,因为段选择性粘附通常7天左右,并最终可以获得更多的假定的osc mac后排序。

分化为卵母细胞和后代的能力与OSC最相关。然而，先前的研究观察并评估了卵母细胞和卵泡的形成全部通过连续部分和随后的免疫荧光等染色。虽然这些方法有效帮助调查人员达到目标，但与我们研究中所采用的方法相比，它并不是一个独特的选择。如果EGFP荧光信号可以在一般荧光显微镜下直接可视化，则更为良好。在我们的实验中，我们确实发现了一些EGFP表达卵母细胞;但是，只有很少的卵母细胞显示荧光信号。众所周知，Pubi启动子驱动下游基因的弱表达，并且随着基因组中的综合位置，外源基因如EGFP的表达是复杂的。如果在该研究中使用CMV或其他最佳启动子，则可以容易地检测到EGFP表达，并且在卵巢中的大多数卵泡中可能观察到。由于该方法的结果有一些限制，因此我们应该优化方法以容易地检测EGFP阳性卵母细胞或卵泡。此外，由于对从转导OSC产生的病毒颗粒可能污染的疑虑，我们进行了测试以验证这些细胞是否产生颗粒[34[结果表明，检测到的EGFP阳性卵母细胞不能是假阳性的，因为野生型细胞没有观察到荧光作为对照。最后，考虑到我们没有用FACS净化转导的OSC，EGFP-OSC不变地包括一些未经过度的OSC，其卵母细胞无法表达EGFP。

同样，选择E12.0的胎儿来检查是否产生了表达egfp的后代，因为它们是透明的，在一般荧光显微镜下很容易看到。确实，在某种程度上，EGFP在荧光显微镜下的可视化比活体成像系统更容易、更敏感。此外，该方法更方便，可以为调查人员进行鉴定试验提供更大的信心。但弱启动子的限制影响了观察结果;因此，根据我们的经验，进行荧光筛查的胎儿应该早于E12.0，因为超过E12.0的胎儿通常会变大，不易透明。此外，EGFP在转基因动物中的表达非常复杂，导致后代某些器官中不表达EGFP;然而，胎儿的所有器官都可以很容易地筛查出来，因此不会受到限制。此外，胎儿随后被用于PCR筛查。结果与荧光显微镜下观察结果一致。在另一项研究中，我们也使用从阳性胎儿中提取的基因组DNA进行southern blot分析，发现它与后代的尾DNA一样可行。 In contrast to the PCR, southern blot analysis can supply detailed information about the genetic structure of the transgenic alteration, for example, transgene copy number and the number of integration sites within the genome. As shown in Figure3 (d)，我们发现在后代中出现了多次插入，提示EGFP基因的成功整合。

总之，我们证明了对MACS选择和小鼠OSC的鉴定的修饰，包括产量培养2-3天，以及EGFP阳性卵母细胞和胎儿的直接可视化。此外，HUC-MSCs作为饲养层的临床应用也可用于人类OSCs。虽然我们的研究有限制，但本研究的结果可以促进对OSC的研究，并吸引更多的研究人员进入这一领域，以便进行新的调查，以解决关于OSC的剩余辩论。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

基金资助:国家自然科学基金项目(no. 81300453, no. 81370469);2013DFA31400)、湖北省教育厅(B2013111)。

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