文摘

Chondrogenic区分间充质干细胞(msc)是模仿胚胎软骨内骨化,变得肥厚性。BMP(骨形态形成蛋白)和苯丙酸诺龙膜结合抑制剂(小鹿斑比)是一种调节pseudoreceptor转化生长因子的活性β(TGF -β)和BMP信号在软骨形成。两个TGF -β和BMP信号是chondrogenic细胞分化的监管机构。人类骨髓衍生msc chondrogenically predifferentiated总体文化为14天。之后,一组受到肥大加强媒体条件而控制在chondrogenic中等至28天。组织学评估,由PCR基因表达和免疫印迹分析进行了1天,3、7、14、17、21、28。文化的一个子集与BMP抑制剂治疗‘诺金’来测试BMP依赖小鹿斑比的表达式。肥厚性分化小球显示更大的细胞与胶原蛋白增加10和碱性磷酸酶染色。有小鹿斑比的显著增加表达基因表达和蛋白质水平肥厚性文化相比chondrogenic控制和BMP4基因表达增加。免疫组织化学显示强烈的小鹿斑比在肥厚性细胞染色。小鹿斑比的表达式是剂量依赖性‘诺金’的表达下调。的pseudoreceptor小鹿斑比调节在增强肥大的MSC chondrogenic分化的BMP相关机制。

1。介绍

软骨的修复能力是非常有限的,因此各种组织工程方法研究了创建把,遗传型的稳定的关节软骨。间充质干细胞(msc)是很有前途的候选人基于细胞的组织工程应用程序的使用。msc的chondrogenic潜力已被证明在不同matrix-free和基于矩阵的细胞培养系统(1- - - - - -5]。然而,chondrogenic区分msc表达标记X型胶原、碱性磷酸酶(ALP),和MMP-136- - - - - -11),表明肥厚性转换。这种行为的chondrogenic区分msc反映了在软骨内成骨生长板软骨细胞的发展途径。额外的终端分化血管侵犯和基质钙化的特点也被观察到体内移植后的人类chondrogenic MSC颗粒文化到老鼠(12,13]。这肥厚性转换chondrogenic区分msc却引起了组织工程应用msc的关节软骨修复。重要的是更好地了解的机制,调节分化后期步骤chondrogenic区分msc设法抑制肥大。MSC软骨形成和胚胎软骨内骨化的相似性表明类似的机制在生物过程(14]。软骨内骨的不同步骤发展是由许多信号分子包括骨形成蛋白(bmp)、转化生长因子-β(TGF -β),纤维母细胞生长因子(fgf)、甲状旁腺与荷尔蒙相关的肽(PTHrP),印度刺猬(本次),实际上wnt (Wingless-related集成网站)15,16]。

TGF -β总科由信号分子包括TGF -β最佳管理,激活素、抑制素和生长和分化的因素(gdf)。这些生长因子参与调节胚胎发育期间的各个过程包括细胞生长和分化,模式形成和组织规范(17,18]。

最佳管理形成一个小组内的TGF -β总科。我国蛋白质二聚的蛋白质和20多个BMP相关特征。在主信号通路,每个绑定到一个heterodimeric受体组成的复杂的I型和II型丝氨酸/苏氨酸激酶受体(19,20.]。配体结合后,II型受体磷酸化I型受体。

的pseudoreceptor小鹿斑比(BMP和苯丙酸诺龙膜结合抑制剂)是一种跨膜蛋白和结构相似性TGF - I型受体β总科,但更短的胞内域。缺乏这种细胞内的丝氨酸/苏氨酸激酶域排除了酶活性(21,22]。小鹿斑比抑制TGF -β和BMP信号通过阻断I型和II型受体之间的相互作用21]。进一步小鹿斑比与BMP4紧密coexpressed在胚胎发育,并可能作为一个负面反馈调节器的BMP信号(21,22]。BMP4感应已被证明是一个重要因素的增强,在MSC肥大软骨形成(23]。最后,小鹿斑比调和一个相当程度的BMP信号通路和TGF -之间的串扰β信号通路。

有趣的是陈et al。24)没有发现发育缺陷小鼠缺乏小鹿斑比的等位基因。这些转基因小鼠可行的和肥沃的和没有显示明显的发育缺陷24]。相比之下第5期等。25)发现心肌细胞肿胀,小鹿斑比缺陷小鼠肾小球毛细血管。最重要的是对肢体发展和小鹿斑比的作用在终端生长板软骨细胞的分化,蒙特罗et al。26肢体形态发生过程中描述了小鹿斑比的作用。在镇压小鹿斑比表达式由苯丙酸诺龙、增加SMAD 1, 5和8可以观察到,紧随其后的是异位软骨的形成。

因此本研究设置为了调查小鹿斑比的表达式模式和可能的下游影响后期软骨形成。因此,我们使用一个既定肥大模型(14人类msc)使用三碘甲状腺氨酸以及精制肥大模型使用BMP4 [23为肥厚性转换chondrogenically有区别的msc。

2。材料和方法

2.1。msc的隔离

批准由当地伦理委员会和书面同意的捐助者人类msc隔绝髂骨骨髓吸入七男患者,21岁到42年,手术需要从髂嵴自体骨移植。msc被孤立聚蔗糖(Biochrom)梯度离心法聚苯乙烯粘合紧随其后。细胞扩大在杜尔贝科的修改鹰中(DMEM)低葡萄糖(英杰公司)与10%胎牛血清(PAN生物技术GmbH)和1%青霉素和链霉素(英杰公司)在37°C公司为5%₂。生长培养基是每周两次改变和细胞融合使胰蛋白酶化在80%,在液态氮冷冻供以后使用。解冻和单层扩张后,通道1细胞用于实验。

2.2。Chondrogenic分化和肥大的增强

分化实验msc使胰蛋白酶化和播种在v形底96 -聚丙烯板在200000细胞/为了形成3 d聚合。骨料被组装在250×g离心5分钟和chondrogenically分化在标准chondrogenic介质(分)包含DMEM高葡萄糖(表达载体),1%(西格玛奥德里奇),50μ40 g / mL ascorbate-2-phosphate(西格玛奥德里奇)μg / mL L-proline(西格玛奥德里奇),100 nM地塞米松(西格玛奥德里奇),1毫米丙酮酸钠(表达载体),和10 ng / mL TGF -β1(研发系统)。

骨料predifferentiated了14天。介质条件被改变,骨料分布在五个不同的组:(1)标准chondrogenic介质(分);(2)与BMP4 chondrogenic介质(分+ BMP);(3)标准肥大加强中等(分没有TGF -β没有地塞米松,包括1纳米三碘甲状腺氨酸(T3)(西格玛奥德里奇)(忧郁));(4)肥大加强媒介没有T3(忧郁−T3);(5)肥大加强与BMP4媒介而不是T3(忧郁−T3 + BMP;采用BMP4 100 ng / mL)(图1)。

为了测试BMP4小鹿斑比的相关规定,BMP抑制剂的大脑在10 ng / mL,从第一天100 ng / mL骨料被忧郁−T3 + BMP协议(图1)。

聚集在d1收获,d3, d7, d14, d17, d21, d28基因表达分析。

2.3。组织学

骨料的组织学分析收获d14 d28,固定在4%多聚甲醛。10μ米厚的冻结部分被削减cryomicrotome (HM 500 OM低温恒温器;Microm,柏林,德国)。部分是沾9-dimethylmethylene蓝色(DMMB)(西格玛奥德里奇)硫酸化葡糖氨基葡聚糖(笑话)。

2.4。组织化学和免疫组织化学

组织化学调查10μ米厚的部分也准备好了。组织化学的高山与碱性磷酸酶染色进行装备(西格玛奥德里奇)与中性红复染色。

免疫组织化学的鼠标anti-BAMBI (1: 10, eBioscience),兔子anti-BMP4(1: 250年,Abcam),鼠标anti-collagen类型X (1: 20, Quartett Immunodiagnostika和Biotechnologie GmbH),和鼠标anti-collagen II型(1:100年,Calbiochem)抗体、免疫组织化学进行了如下:在清洗样品洗涤缓冲5分钟阻断内源性肽酶(3%的H₂O₂在PBS / 10%甲醇)进行了30分钟。然后部分被孵化阻断缓冲区(10%胎牛血清/ 10%山羊血清在PBS) 60分钟RT其次是孵化anti-BAMBI主要抗体阻断缓冲区一夜之间在4°C。Immunolabeling被生物素化的二次抗体检测(1:100;Dianova),马红过氧化物酶共轭链霉亲和素(向量实验室,伯林盖姆)和金属增强diaminobenzidine作为衬底(西格玛奥德里奇)。

2.5。RNA隔离、互补脱氧核糖核酸合成和基因表达分析

的7个不同的独立的捐助者8到10骨料/实验条件和时间点集中,均质1毫升三试剂(西格玛奥德里奇)使用创1000年高速搅拌器(费舍尔科学)和RNA分离试剂盒的方法。执行反转录与Transcriptor第一链cDNA合成装备(罗氏)。实时PCR半定量的进行与辉煌SYBR绿色QPCR混合(Stratagene)和Mx3000P QPCR系统(Stratagene)。基因表达是规范化的次黄嘌呤鸟嘌呤phosphoribosyltransferase(产生HPRT)。

实时PCR引物在表1被使用。

2.6。免疫印迹分析

免疫印迹分析,以下使用抗体:鼠标anti-BAMBI(1: 1000年,eBioscience),兔抗β肌动蛋白(1:10000年,Abcam)。

5到8 MSC丸每时间点和条件每个病人集中,在冰冷的PBS洗,并在500年使类同μL 6 M尿素/ 2% SDS溶液中含有一种蛋白酶抑制剂鸡尾酒(σ)和磷酸酶抑制剂(σ)使用创1000年高速搅拌器(费舍尔科学)。溶菌产物离心5分钟在1000×g (4°C)和上层清液被转移到一个新管。上层清液的蛋白质浓度测定采用BCA蛋白质分析工具包(Biorad特区蛋白质化验)根据制造商的指示。

溶菌产物补充了4 x摩门教的样品缓冲(表达载体)和10毫米二硫苏糖醇(DTT)和蛋白质变性5分钟在95°C。凝胶电泳,等量的蛋白质(10μg)加载和分离4 - 12% Bis-Tris凝胶(Novex生命技术)在120 V。蛋白质凝胶电泳后从凝胶转移到polyvinylidenfluoride (PVDF)膜(微孔)。吸掉了2小时在100 V。转让后,1小时的膜被三羟甲基氨基甲烷缓冲液脱脂奶粉5%生理盐水与渐变20 (TBST)。膜在初级孵化抗体在5%的脱脂奶粉TBST一夜之间在4°C。第二天,膜在TBST洗了三次10分钟,然后在孵化HPR-coupled二级抗体(1:1000年,皮尔斯)5%的脱脂奶粉TBST室温1小时。膜被三次TBST 10分钟。化学发光检测与ECL的西方工具包(皮尔斯)和通过使用x射线敏感电影(ECL Hyperfilm Amersham)。照片中所开发的电影开发人员(Curix 60,爱克发)。

免疫印迹膜被使用ReBlot +(微孔)根据生产指令。

2.7。统计分析

基因表达分析通过计算的方法每个家政产生HPRT基因相对表达规范化。后检查双尾Kolmogorov-Smirnov测试学生的正态分布以及使用。维护一个整体层次的,事后Bonferroni测试进行。

3所示。结果

3.1。诱导的肥大

诱导的肥大是通过添加后T3和撤回地塞米松chondrogenic predifferentiation。肥大的增强是通过增加细胞大小、强X型胶原染色,和更高的高山活动prohypertrophic条件下相比,标准chondrogenic条件。细胞外基质分析发现贫穷粘多糖(数字内容2(一个)和2 (b))。免疫组织化学观察到等于2型胶原染色(数字2 (c)和2 (d)肥厚性)和分析标记显示增加胶原蛋白10染色(数据类型2 (e)和2 (f))以及强烈增加了preapoptotic标记碱性磷酸酶染色(数字2 (g)和2 (h))肥厚性转换后样品相比nonconverted样本。这些发现符合先前描述的特点肥厚性软骨细胞在生长板(5,14,27),允许使用这种肥大模型进行进一步分析。胶原蛋白类型2和10型表达随时间增加两组没有显著差异组(补充图1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/2685147)。这不是整合与免疫组织化学结果显示较高的胶原蛋白10肥厚性组的沉积类型。这是一个已知的现象还讨论了在这个模型中,在以前的论文(14]。造成这种差距的原因是,我们正在处理混合单元的数量,而不是所有细胞应对转向肥大提高介质在相同的程度上。虽然一些细胞接受肥厚性分化,TGF -β退出可能导致其他细胞去分化。这种异构反应可以解释失踪的基因表达水平的显著差异。

3.2。基因表达的小鹿斑比增加肥厚性转换

小鹿斑比的实时PCR分析揭示了小鹿斑比明显增加,基因表达在肥厚性(忧郁)条件下相比chondrogenic(分)条件。小鹿斑比基因表达显著调节在17天,天21日和28天肥厚性刺激MSC丸而chondrogenic丸(图3(一个))。同样BMP4基因表达也调节在肥厚性条件和chondrogenic条件(图相比达到显著差异3 (b))。所有被规范化的管家基因产生HPRT基因表达式。

确认这个结果在蛋白质水平进行免疫印迹分析小鹿斑比在21天、28天的评分。在肥厚性刺激MSC小球强信号对小鹿斑比蛋白质可以被检测到,而在chondrogenic条件下没有发现信号。值得注意的是,小鹿斑比基因表达和小鹿斑比蛋白质含量变化显著chondrogenic条件下整个时间的实验。

3.3。免疫组织化学染色小鹿斑比的增加对肥厚性转换

为了进一步证明小鹿斑比的增加表达,小鹿斑比蛋白进行免疫组织化学。从而我们也寻找小鹿斑比蛋白的细胞内的分布。免疫组织化学染色显示增加小鹿斑比的肥厚性聚合物相比chondrogenic聚集在28天(图4)。在细胞内分布的小鹿斑比,我们观察到明显染色的细胞膜(黑色箭头,图4)。小鹿斑比是一种膜结合蛋白这一发现是预期,证实了小鹿斑比的存在在细胞的膜蛋白。

3.4。基因表达的小鹿斑比由BMP4诱导

进一步调查小鹿斑比的作用诱导的肥大,之后,我们分析了小鹿斑比的表达式BMP4和‘诺金’的治疗。之前显示诱导肥大的T3和地塞米松和TGF -撤军β是由BMP4 [23]。这也揭示了增加BMP4蛋白质染色hypertrophically转换组相比chondrogenic控制(图5)。因此,我们建议,小鹿斑比相似的表达模式实现根据BMP4肥厚性转换(忧郁−T3 + BMP)。

BMP4治疗显著增加小鹿斑比表情chondrogenic条件下28天(21天无意义的增加)。肥厚性条件下小鹿斑比表达显著增加的MSC丸治疗BMP4肥厚性媒介相比没有T3(忧郁−T3)(图6)。相比与T3肥厚性介质(忧郁),我们只能检测无意义的基因表达水平在增加BMP4治疗(忧郁−T3 + BMP) 21天但不是28天(图6)。两种情况下,忧郁,忧郁−T3 + BMP,表现出更高水平的小鹿斑比基因表达而BMP4 chondrogenic条件下治疗。

3.5。小鹿斑比是表达下调的基因表达BMP抑制

根据这些结果我们进一步调查是否这些小鹿斑比表达模式可以避免通过添加BMP抑制剂‘诺金’肥厚性(忧郁)条件。为了估计这是否抑制剂量依赖我们使用两种不同剂量的‘诺金’(10和100 ng / mL)。为控制我们添加了相同的剂量chondrogenic控制。

BMP抑制剂治疗大脑不会改变小鹿斑比表达式chondrogenic条件下21天,28天。在肥厚性条件下,添加100 ng / mL的大脑明显减少小鹿斑比表达式在21天,28天hyp-conditions相比(图7)。然而,小鹿斑比的降低表现在增加10 ng / mL的大脑仅仅是重要的21天,hyp-conditions相比。除了肥厚性条件下,小鹿斑比表达下调和并发添加BMP抑制剂‘诺金’我们也可以是差别表明,该对这些基因的剂量依赖性。

4所示。讨论

4.1。诱导的肥大

人类的msc可以分化成chondrogenic血统。然而有些肥厚性标记表示,然而,无论是在短期文化或长期文化(28]。根据这些研究结果已经表明,培养chondrogenic msc遵循生长板软骨细胞的内在途径(12),因此不可避免地变得肥厚性。这个肥厚性表型chondrogenic有区别的msc可以增强实验通过改变介质条件从chondrogenic肥大增强媒介如前所述12,14]。这种变化在介质条件下包括撤军TGF -β地塞米松和添加甲状腺激素T3。使用这种体外msc肥大模型我们可以显著增加chondrogenic的肥厚性表型分化人类msc。增强肥大明显增加细胞尺寸所示,强X型胶原染色,更强的高山在肥厚性MSC颗粒染色。肥厚性标记并不只表示prohypertrophic条件下还在标准chondrogenic条件下即使到一个较低的程度。有一些高山阳性细胞的中心chondrogenic MSC球但高山活动主要局限于颗粒的边缘。是前面描述的纤维母细胞周围MSC丸(7]。基于这一发现,我们表明,颗粒周围的高山积极环主要由纤维母细胞而不是肥厚性软骨细胞。肥厚性诱导后,地区肉瘤细胞肥大以及地区被发现。

4.2。基因表达的小鹿斑比增加肥厚性转换

小鹿斑比是一种跨膜蛋白与结构相似性TGF -β和骨形态发生蛋白受体I型但缺乏细胞内激酶结构域(21]。因此,小鹿斑比能够抑制TGF -β和BMP信号。小鹿斑比已被证明与BMP4 coexpressed在非洲爪蟾蜍和小鼠胚胎发生(21,22]。进一步BMP4诱发小鹿斑比的表达式通过进化保存子BMP响应增强剂7 (Bre7) [29日]。此外还TGF -β能够增强小鹿斑比的表达式通过SMAD 3/4信号(30.]。

我们发现小鹿斑比的一个重要upregulation肥厚性条件下使用T3和地塞米松和TGF -撤军β对于肥厚性转换(图3)。upregulation被证明对基因表达和蛋白免疫印迹蛋白质水平。不过这强大upregulation小鹿斑比的最终功能尚不清楚。优惠抑制TGF -β信号削弱了TGF -抗心肌肥厚效应β,导致肥厚性表型的进一步增强。另一方面,主要与骨形态发生蛋白受体可以改善BMP诱导终端分化(23在我们prohypertrophic文化条件。小鹿斑比可能作为负反馈循环抑制BMP信号以响应增加BMP4表达式。

4.3。免疫组织化学染色小鹿斑比的增加对肥厚性转换

同样的观察upregulation小鹿斑比的表达式进行了使用免疫组织化学(包含IHC)主要抗体小鹿斑比pseudoreceptor。特别是膜绑定pseudoreceptor性质,也被称为跨膜受体,更高的放大的包含IHC所示。前面描述的膜绑定角色是由几个工作组(21,31日]。

4.4。基因表达的小鹿斑比由BMP4诱导

进一步阐明小鹿斑比的诱导表达我们开展了一项实验,肥厚性转换T3(忧郁)与肥厚性转换BMP4(忧郁−T3 + BMP4)。就是明证PCR小鹿斑比增加,调节BMP4的刺激。小鹿斑比表达的诱导T3也最有可能由BMP。以前的作品中所示,‘诺金’和dorsomorphin BMP抑制剂能够抑制T3诱导肥大(23]。因此T3对小鹿斑比的影响表达式将最有可能通过增强BMP表达,因此增加了小鹿斑比的表达式。

4.5。小鹿斑比是表达下调的基因表达BMP抑制

这个假说是进一步发现小鹿斑比表达支持的T3诱导肥大是剂量依赖性下调添加BMP抑制剂的大脑。之间的串扰T3引发细胞分化和BMP4是人类msc(所示23和鸡胚32),而其他工作小组建议BMP2肥厚性转换的主要中介小鸡肢芽(33]。

它仍在讨论中,具体temporospatial分布小鹿斑比肢体发育期间,是否它的作用至关重要。看来,小鹿斑比,这是一个消极的调节器软骨形成,可能是一个目标,为了稳定chondrogenically chondrogenic表型分化msc。

5。结论

这些实验表明,表达pseudoreceptor小鹿斑比强烈调节肥大增强条件下人类msc。T3、BMP4和‘诺金’治疗能够调节小鹿斑比的表达式。小鹿斑比的作用还不清楚,需要进行功能实验击倒和小鹿斑比的超表达的未来。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢d . Drenkard女士和先生r . Kujat技术支持。这项工作是由DFG格兰特MU2318/3-1。

补充材料