文摘

人类诱导多能干细胞(hiPSC)中心肌细胞(CMs)持有高潜在使用药物评估和心肌再生。创建组织如构造CMs的细胞外监控,我们把对齐纤维(AFs)表面上的微电极阵列,然后播种hiPSC-CMs后续监测14天。正如所料,CMs组织到各向异性和成熟组织和细胞外记录显示减少过早打更高的信号振幅和更高的概率让检测相比,文化没有纤维。CMs的对齐纤维样品也表现出各向异性传播的潜力。因此这些结果表明hiPSC-CMs培养AFs可以更可靠地用于基于细胞的检测。

1。介绍

人类心肌细胞(CMs)目前可以由人类诱导多能干细胞的分化(hiPSCs)效率高、纯度高(1]。那么重要的是构造形式组织如厘米,而不是nonorganized细胞集群(2- - - - - -5),更可靠的药物评估和心肌再生(2- - - - - -6]。在心脏,心脏组织是由杆状心肌细胞排列紧凑的形式和并行肌纤维与协调缝隙连接。模仿这个组织,CMs一直在培养有图案的表面(7,8[],萎缩皱纹9),纳米纤维(10- - - - - -12],biowires [13]。这些技术促进了CMs的对齐在2 d或3 d环境,增强CMs的分化和成熟;然而,大多数这些研究利用光学钙成像和膜片箝技术功能特征,侵入性和药物评估比较方便与微电极细胞外记录数组。

在这项研究中,我们培养hiPSC-CMs对齐纤维(AFs)和心脏组织如后构造的形成。纤维是由polydimethylglutarimide (PMGI),生物相容性,可以很容易地实际上电纺(14]。对齐PMGI纤维是由电纺的,然后放置是热转移到商业微电极阵列(MEA)促进电生理监测组织如hiPSC-CMs。因此,相比之下,传统matrices-coated二维(平面)和随机纤维- (RF)涂层衬底,我们观察到CMs AF下面层的渗透和不同sarcomeric包的对齐。我们也观察到心脏的表达增加成熟标记在CMs的AFs比较控制。因此,细胞外记录的CMs AFs显示减少过早打(15],更高的信号幅度,和更高的概率让记录的控制没有纤维。各向异性传播的潜力也证实,表明组织如构造的形成成熟的CMs和未来的药物筛选方法的可靠性和心脏毒性研究。

2。方法

2.1。纤维制造和集成

PMGI PMGI不同的溶液浓度(11%,13%,16%,19%)(美国MicroChem,位于MA)溶解在四氢呋喃环戊酮和准备。电纺,直流高压发生器(TechDempaz、筑波、日本)是用于提供8千伏的电压。解决方案是加载到1毫升注射器,针头的尖端的0.6毫米内径。高压电源的正极连接针。接地旋转鼓作为收藏家和鼓的速度设置为11.4 m / s获取AFs。在随机的情况下纤维(RFs)鼓被设置为0 m / s。提示和收藏家之间的距离保持在12厘米。湿度测量范围从21%到35%,而温度维持在25°C。在纺纱之前,一层铝箔是附加到鼓。AFs首先收集的铝箔,与纤维被剥落,压到盖玻片(Kishiwada Matsunami玻璃。有限公司,日本)或热压机机器的MEA衬底(作为一个,大阪,日本)。 Following removal of the aluminum foil, the fibers were mostly transferred to the substrate.

2.2。分化和hiPSC-CMs文化

hiPSCs (imr - 90 - 1)维护和分化根据公布的方法(1)后,京都大学的指导方针。经过30 - 50天的分化,浮动殖民地CMs收集和分离成单个细胞的蛋白酶溶液中搅拌1 - 2 h(0.1%胶原酶I型,0.25%胰蛋白酶,1 U /毫升DNase我,116毫米氯化钠,20毫米消息灵通的,12.5毫米不₂阿宝₄氯化钾,葡萄糖5.6毫米,5.4毫米,0.8毫米MgSO₄[pH值7.35])。分散后,使用40分离细胞被过滤μm细胞过滤器(美国BD猎鹰,贝德福德,MA)和resuspended serum-supplemented心脏分化培养基(IMDM含有1% MEM不必要的氨基酸溶液,1%青霉素、链霉素、谷酰胺2毫米,0.5毫米左卡尼汀(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),0.001% 2-mercaptoethanol,和1 - 2% BSA (Wako,大阪,日本),或0.4%人类血清白蛋白(Sigma-Aldrich))和镀AFs和RFs或0.1% gelatin-coated平面基板(平)1×10的密度⁶细胞厘米⁻²。无血清培养系统中改为从第二天开始,每4天更换一次。

低温贮藏hiPSC-CMs (iCell)从细胞动力学购买国际(CDI)(美国麦迪逊,WI)。细胞被解冻的准备中(电镀媒体,CDI)和镀0.1%明胶(美国Sigma-Aldrich)涂层板密度为0.5×10⁶细胞厘米⁻²。媒介是改变培养基(维护媒体,CDI) 2天后。培养基是每两天更换一次。文化是维持7天然后山肩AF-coated或fibronectin-coated (50μg / mL,罗氏,罗斯威尔,美国GA)密度1×10平⁶细胞厘米⁻²。

2.3。疣状和成像

CMs源自IMR hiPSCs与4%多聚甲醛固定,在PBS permeabilized Triton x 0.5 - 100 h + 0.5%。阻塞后5%正常山羊血清,5%正常驴血清,3% BSA和0.1%渐变20在PBS 16 h 4°C,细胞被孵化的α辅肌动蛋白(鼠标单克隆免疫球蛋白g, 1: 1000;σ),肌钙蛋白T2 (TnT2鼠标单克隆免疫球蛋白g, 1: 200年,圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX,美国),MLC2v(兔多克隆免疫球蛋白g, 1: 200;美国Proteintech集团Rosemont, IL),或βmhc(鼠标MYH7单克隆IgM (1: 100;圣克鲁斯生物技术)抗体16 h在4°C。细胞被清洗和孵化与不同的二次抗体稀释在阻止缓冲区(1:1000):DyLight - 594 anti-mouse免疫球蛋白,DyLight 488 anti-mouse免疫球蛋白,DyLight - 594 anti-rabbit免疫球蛋白,或DyLight - 488 anti-mouse IgM(所有从生活技术)在25°C 1 h。原子核是由DAPI可视化和光)(kouichi。

2.4。是录音

从培养细胞外记录CMs进行通过使用一个基于pc的数据采集系统组成的MEA,前置放大器,滤波器放大器(多通道系统、Reutlingen、德国),数据采集板(ADInstruments,但尼丁,新西兰),和软件:实验室图表(ADInstruments)和MATLAB(美国马MathWorks,纳蒂克)。意味着是捏造的毫米玻璃衬底。60氮化钛电极直径30µ200 m和距离µm被组织在一个1.4×1.4毫米矩阵在衬底的中心。文化是使用一个电极的刺激。MEA的CMs被孵化器和放置在电炉由温度控制器控制保持在37°C。数据记录与16位精度和20 kHz被低通数字滤波算法过滤得到零相位失真的截止频率2千赫。过滤后的信号是有区别的数字来确定本地激活时间(LAT)在每个电极,并激活地图是由插值的纬度值是矩阵内的电极之间的网站。振幅,QT间隔,让录音比,和殴打率由CM波形的分析领域的潜力。校正QT间隔(cQT间隔)被正常化CM跳动率计算通过使用Fridericia修正公式:。

2.5。电子显微镜

扫描电子显微镜(SEM)、高分辨率图像获得使用扫描电子显微镜(SEM jcm - 5000;JEOL有限公司、日本东京)操作10 kV。5 nm厚铂层被溅射沉积在样品(MSP 30 t;日本昭和Shinku设备,Sagamihara)。角分布和纤维直径进行评估使用ImageJ软件(美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)。

透射电子显微镜(TEM)、样本与2%戊二醛固定(蒸馏EM年级,电子显微镜,哈特菲尔德,PA,美国)在NaHCa缓冲区(30毫米100毫米氯化钠,玫瑰,CaCl 2毫米₂与氢氧化钠,调整pH值7.4),然后用0.25%锇/ 0.25%后缀K₄铁(CN)₆,1%的丹宁酸和最后50毫米醋酸双氧铀。样本然后洗,脱水乙醇在一系列的解决方案,和嵌入式、塔巴的EPON 812树脂(TAAB实验室设备有限公司、阅读、英国)。在65°C聚合后,超薄部分(60 - 100 nm)将垂直PMGI纤维取向使用超微切片机(徕卡FC6,维也纳,奥地利)。部分被安装在电磁网格,用柠檬酸铅染色,透射电镜观察到(JEOL JEM1400)。

2.6。细胞连接试验

IMR hiPSC-CMs被播种在纤维或其他基质密度为10⁶细胞厘米⁻²5 h,在样本与PBS冲洗两次,贴壁细胞收获和统计。细胞附着率评估使用以下方程:细胞附着率(%)=粘附细胞的数量×100 /数量的种子细胞。

2.7。统计分析

定量数据都表示为手段±标准错误的意思。分析了两组学生之间的差异以及和被认为是静态意义重大。

3所示。结果与讨论

3.1。制备对齐PMGI纤维

实际上电纺纤维已经被经常用于指导方向的各种类型的细胞(16]。在这里,对齐PMGI纤维通过电纺的转筒(图1(a))。校准和纤维直径可以控制通过改变PMGI(数字的浓度1(b)和1(c))。19%和16% PMGI纤维展示最好的从低浓度PMGI对齐相比。然而,在最高浓度(19%)PMGI解决方案展示更高的粘度,导致纤维直径大于5μ米,转移到表面是困难的。相比之下,16%的PMGI纤维可以很容易地转移到表面由于相对较小的纤维直径。纤维的密度表可以被不同的纺丝时间(图1(d))。通常,我们获得的纤维从稀疏分布10旋转后形成了一层纤维300年代旋转,这可能禁止CMs的渗透和阻碍接触电极下面纤维。因此,90年代实际上电纺纤维为厘米选择文化。纤维的纺制PMGI被转移到MEA的表面,使细胞外记录配置管理活动。

3.2。CMs PMGI纤维基质培养的

IMR hiPSC-CMs播种在PMGI纤维和gelatin-coated持平附件测试。5 h后播种,样本与PBS冲洗,把独立的细胞。CM附件的一个重要区别是观察之间的三种类型的基质,它提出的可靠性使用PMGI纤维(补充图1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/2634013)。接下来,采用免疫分析后进行播种CMs在不同基质在第14天(数字2(一个)- - - - - -2 (d))。如图2(一个)CMs在房颤显示,细长的形状和优先定位的方向AFs。的对齐PMGI纤维明显影响了sarcomeric的取向α辅肌动蛋白在CMs。当细胞培养在射频和持平,α辅肌动蛋白细丝出现无序和分散在各个方向(图2 (b)和补充图(a))。这也可以观察到另一个心肌细胞特定标记表达式,TnT2(数字2 (c)和2 (d))。

以前,支架由电纺的倾向于生成孔隙大小小于10μm,这样细胞不易渗入纤维和3 d形式组织细胞外基质等在活的有机体内条件(17]。相比之下,在这项研究中,文化14天后,AFs的CMs与透射电镜检查。值得注意的是,AFs似乎已经接受了CMs,表明CMs可以有效地渗透到纤维和下面的区域组织组织如结构和多层(图2 (e))。此外,面向纤维导致巨大的对齐sarcomeric包AF样本;这些都是垂直观察飞机(图2 (f))。相比之下,随机安排sarcomeric包、垂直或平行于观察平面上,可以观察到在RF和平板样品(补充数据(b)和(g))。

3.3。AFs促进hiPSC-CMs的成熟

我们未来的影响相比IMR hiPSC-CMs意味着设备上有或没有AFs(图3(一个))。此外,CMs被用于细胞外记录。如图3(一个),CMs AF-coated MEA表现出细长的形状和更均匀的形态比RF和平板样品。值得注意的是,对心脏组织免疫染色标记表明,房颤更多细胞阳性样本MLC2v(图3 (b)和补充图(c)),标记与心室结构和βmhc(图3 (c)和补充图(d)),心脏成熟标志与收缩速度(18]。这些结果表明在组织调解厘米AFs的效率比RF平面控制和成熟。

3.4。电生理概要PMGI纤维基质上的CMs

CMs是电活性细胞。细胞外记录的自发收缩CMs /刺激电活动已被证明使CMs的电生理特性的评估(补充图)[19]。现在,研究hiPSC-CMs-based药物评估都是利用与fibronectin-coated MEA, Matrigel-coated或gelatin-coated表面(5,15,20.,21],CMs RF-coated衬底上没有显示出更好的组织或成熟比平面样品尽管RFs增强的附件;我们因此选择平面控制在以下电生理学评估。

除了观察自发击败天6(数字4(一)和4 (b)),我们在一些平面样品记录过早搏动(数字4 (c)和4 (d))表明低同步IMR hiPSC-CMs中平面样本。相比之下,没有过早搏动与房颤样本,记录表明可靠的细胞间连接和耦合组织如CMs的结构,可显著更高的振幅也证实的记录信号(图6天4 (e))。的差异之间的连通性和耦合两种类型的样本可以看到更清楚的激活地图绘制基于自发收缩性(数据5(一个)和5 (b))。这里,CMs在平坦的样本显示区域传导延迟,但没有这样的效果观察AF样本。此外,我们观察到更高的领域潜在的振幅(FP)镀CMs对AFs相比平在14天,这表明一个更好的细胞附件AF-coated意味着表面(数字5 (c)和5 (d))。相同的结果证实了使用培养商业CMs (iCell)两种类型的基质(补充数据(一)和(b))。

此外,我们评估的百分比的渠道让记录,发现了一个更高的记录比与房颤的样品相比,平面样品(图5 (e)和补充图(c))。自让记录确定QT间隔变化是重要的药物评估期间,我们的结果表明不仅更好的细胞附着,也更健壮的信号读出的CMs培养AF-coated MEA的表面。另一方面,我们指出IMR hiPSC-CMs让振幅高于iCell(图5 (c)和补充图(a))。IMR hiPSC-CMs cQT间隔显示没有明显的区别在房颤和平板样品(图5 (f))。然而,IMR hiPSC-CMs显示显著短QT间隔比iCell(图5 (c)和补充图(一)),应用Fridericia校正后,cQT间隔显示轻微区别两种类型的细胞(图5 (f)和补充图(d))。iCell跳动更快在平坦样品比AF样品6天,第十天没有这种差异IMR hiPSC-CMs(补充数据(e)和(g))。此外,我们的数据可能表明最好的时机进行基于CMs的药物测试可能在6天左右,类似于推荐的时间(22]。这些数据表明内在差异IMR hiPSC-CMs和商业iCell由于不同的分化方法。自发收缩的传导速度没有显著区别房颤和平板样品(图5 (h),补充图(f))。

电刺激已被用于速度hiPSC-CMs [23];这里我们应用刺激(±700 mV, 5女士持续时间)(图6(一))定量比较不同方向的传播速度;对于这个实验,刺激和记录电极排列如图6(一)。场的时间进程可能刺激后显示均匀传播和领域潜在的传播沿路径从一个电极转移到另一个来自位置接近刺激电极(数字6 (b)和6 (c))。沿着纤维方向的传播速度是超过两倍大于垂直于纤维方向(图6 (d)),类似于观察与其他类型的各向异性基质(24,25]。此外,激活获得的地图(图4×4电极阵列安排6 (e)与房颤)显示椭圆等时线覆盖样本,而是一个各向同性传播在平面样品(图6 (f))。总之,AF-coated意味着促进细胞组织各向异性和各向异性传播的潜力,提高培养细胞外记录的CMs。这样一个集成的平台从而拥有高潜在未来的研究。

4所示。结论

实际上电纺AFs被放置在一个商业的表面意思。hiPSC-CMs可以培养,导致组织如厘米结构。CMs在这样一个组织如构造是细长的,紧凑,和成熟,显示减少过早跳动,更高的信号幅度,和更高的概率让记录与培养在平面基板没有纤维。因此我们确认的健壮性AF-coated意味着创造的组织如hiPSC-CMs结构及其细胞外记录的可靠性。

相互竞争的利益

日本京都大学申请了一个临时专利的基础上,提出了研究(李刘,军军,Itsunari南城,Norio Nakatsuji,和陈勇)。

作者的贡献

李,李军军,Norio Nakatsuji勇陈构思项目;李刘和军军李设计实验;军军,Itsunari南城,Leqian Yu Kiyotaka教授,Minako,只是静俏Masato铃木Ken Shimono Hitetoshi Kotera,和李刘进行实验;军军,Itsunari南城,Leqian Yu Kiyotaka教授,Hitetoshi Kotera,和李刘分析数据;陈和军军李,李刘,勇写的论文。

确认

日本提供的资金是促进社会科学(jsp):科学研究补助金(B) (15 h03948, 26289065),科研补助金(C) (15 k08270),具有挑战性的探索性研究(26630096),和补助金jsp研究员(26.04046)。创新中心提供的资金也从下边了,JST (COI)计划,欧盟委员会通过合同编号。604263 (Neuroscaffolds)和法国国家研究机构通过合同编号(ANR)。anr - 12 - rpib - 0015(心脏补丁)。支持WPI-iCeMS世界总理国际研究中心计划(WPI),下边了,日本。

补充材料