长期Oocyte-Like细胞发展文化来源于新生儿狨猴猴卵巢

文摘

我们使用普通狨猴猴(Callithrix jacchus)作为临床前非人灵长类动物模型来研究生殖与干细胞生物学。新生儿狨猴猴卵巢包含大量原始减数分裂前的生殖细胞(oogonia)表达多能干细胞标记包括OCT4A (POU5F1)。这是一个特点相比,新生儿人类和啮齿动物的卵巢。在这里,我们旨在培养狨猴oogonia从新生儿卵巢。我们建立了一个文化系统稳定20多个段落和5个月。重要的是,比较转录组分析新生儿卵巢的培养细胞,胚胎干细胞和成纤维细胞显示缺乏生殖细胞和多能性基因的完全丧失oogonia在文化的开始。从通道4起,然而,培养细胞产生大的球形,自由浮动的细胞类似oocyte-like(共同体)。共同体强烈表达了几个生殖细胞基因和可能来自卵巢表面上皮。总之,我们的小说灵长类动物卵巢细胞培养最初缺乏检测生殖细胞然后产生共同体在很长一段时间。这个文化系统允许一个更深的分析雌性灵长类动物生殖细胞发育的早期阶段之后,猴子卵母细胞的重要refinement-possibly也生产。

1。介绍

这是一个长期的意见在生殖生物学在多数物种的雌性动物,包括人类,产后生殖细胞池数量是有限的,不能补充,甚至扩大。oogonia鼠早期研究显示,女性生殖细胞系增殖祖细胞进入减数分裂产生卵母细胞,发现只有在胎儿发育(1]。人类女性也认为是与生俱来不可再生池的生殖细胞毛囊随年龄增长而下降(2]。在人类卵巢,产后oogonia仅有零星被发现和被察觉的年龄两年(3]。缺乏证据为产后人类卵巢生殖细胞增殖也报道了刘et al。4]。相反,迄今为止的大多数proliferation-competent oogonia在人类卵巢进入减数分裂年底怀孕中期妊娠(5,6]。最近的研究使用转基因小鼠和灵长类也报道缺乏证据在成年小鼠生殖细胞增殖(7,8和猴子9卵巢。然而,这些数据支持视图的一个固定的产后女性生殖细胞池正在深刻地受到报告十年前开始(10,11),这表明小鼠卵巢生殖细胞池的补充。mitotically活跃的种系干细胞的存在产后老鼠和人类卵巢被隔离,建议分子特性,移植的细胞群10,12]。可能到目前为止最有力的证据的种系干细胞池提供的卵巢是邹et al。13),生成鼠标女种系干细胞(音译)移植后卵子发生重组和生产后代的能力。其他作者报道oocyte-like细胞的生产在体外从文化的成人卵巢表面上皮(OSE) [14- - - - - -16]。总之,目前有几个明显矛盾的报告,提供数据支持或否定一代新产后啮齿动物和primate-including人类卵巢卵母细胞。增加这个复杂的情况下,Dyce et al。17)报道,甚至胎儿猪皮肤细胞可以形成oocyte-like细胞(共同体)在体外。

我们使用普通狨猴猴(Callithrix jacchus)作为非人类灵长类动物模型来研究生殖与干细胞生物学。与其他物种用于生殖生物学、绒猴猴还有许多oogonia新生儿卵巢,坚定地表达相关的多能性标记OCT4A LIN28, SALL4,生殖细胞标记瓦萨号,增殖标记ki - 67 (18]。因此,这些oogonia新生儿狨猴卵巢分享重要的多能性标记狨猴猴胚胎干细胞(ES)细胞(19]。我们未能发现这一岁的增殖和pluripotency-marker-positive细胞人口和成人卵巢(18]表明快速产后oogonial清算也在这个非人类灵长类动物物种。在这里,我们报告研究新生儿狨猴文化的卵巢细胞。我们最初旨在培养增殖狨猴猴oogonia表现出类似狨猴猴胚胎干细胞的多能性签名。因此,我们建立了小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)细胞培养系统,使卵巢细胞的长期培养。然而,生殖细胞和多能性标记表达失去了在第一章节说明oogonia的完全丧失。几个段落,然而,生殖细胞标记表达恢复,我们观察到在以后的段落的发展大型球面,自由浮动的细胞,我们称为oocyte-like细胞(共同体)由于其与细胞形态相似报道Dyce et al。17]。企业有一个直径~ 40μm和强烈表达了几个生殖细胞标记。这项研究表明oocyte-like细胞长期卵巢细胞培养的发展从转化和非人灵长类动物实验访问。

2。材料和方法

2.1。动物

绒猴猴(Callithrix jacchus),本研究从自立获得繁殖群德国灵长类中心(德意志Primatenzentrum;披萨。德国灵长类中心注册和授权的当地各级政府兽医机构(参考号122910.3311900,PK Landkreis哥廷根)。健康和幸福的动物控制每日由经验丰富的兽医和动物保健服务人员。使用动物的法律准则和制度准则的DPZ狨猴猴的护理和使用严格遵守。动物被pair-housed温度(°C)和湿度(%)。照明是由日光和提供额外的人工照明在12.00:12.00小时光:暗周期。动物喂养随意与颗粒状狨猴饮食(ssniff Spezialdiaten,所以,德国)。此外,20克每动物饲料在早上和30 g切水果或蔬菜面条或米饭拌在下午提供。此外,每周粉虱或蝗虫是为了提供足够的营养。饮用水总是可用的。

被囚禁,甚至狨猴有时生三胞胎或四胞胎。然而,母亲通常只能够养活和后方两个新生儿,这是正常的垃圾生活无拘束的狨猴的大小。因此,三个一组的新生儿出生被用来为本研究收集器官。绒猴猴卵巢得到从六个新生儿动物(产后天1 - 5)。所有的动物与戊巴比妥麻醉(Narcoren;0.05毫升肌内)和安乐死由一位有经验的兽医intracardial注入0.5毫升戊巴比妥之前缺乏营养造成痛苦的动物。在适当时,指导方针之后到达。

2.2。动物的数量

总之,卵巢从6新生儿狨猴被用于这项研究:5双文化和一对转录组分析提供了参考依据。

2.3。新生儿常见的绒猴猴卵巢细胞培养

新生儿卵巢(近似尺寸2毫米×1毫米×1毫米;参见[18)第一次收集和包含冷DPBS洗培养皿中。脂肪和血液细胞被移除和整个卵巢包括大阪证交所被转移到新的缓冲区和切碎的无菌剪刀。切碎的卵巢被转移到15毫升猎鹰管。温柔的离心后,DPBS摘除和卵巢组织碎片resuspended DMEM / F12培养基中含有胶原酶(σ# C2674)和DNase,保持45分钟37°C。每5到10分钟卵巢被轻轻地用移液器吸取瓦解组织。最后,添加10%的边后卫是为了灭活酶。为了消除较大的未消化的组织碎片,细胞通过70年μm过滤器(美国BD)和在200 g离心10分钟。然后上层清液被除去,细胞在培养基和转移resuspended准备支线层小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)馈线浓度3 - 5×10⁵细胞每5厘米。后一个星期大殖民地分别选探针(置、海德堡、德国,# 10032 - 13)和消化Accutase(生活技术,德国)4分钟。然后在300 g细胞离心10分钟和resuspended培养基进行进一步的段落。文化是维持在37°C下5%的股份有限公司₂在湿润孵化器和5%的氧气。

2.4。培养新生儿常见的绒猴的卵巢

不同的细胞培养条件进行测试。最后这个条件被选中:DMEM / F12补充的边后卫(10%)、笔/喉炎,两性霉素B,和人类生活(10μg / mL)在一个辐照小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)馈线细胞层。为进一步通道(通常是在7 - 10天)殖民地机械移除无菌探针,与Accutase消化,放在一个新准备MEF层。

2.5。培养狨猴猴胚胎干细胞

绒猴猴胚胎干细胞基本上是培养如前所述[20.]。只是为了使胚胎干细胞,StemPro Accutase(生命技术)是用来代替trypsin-EDTA后续机械分离。

2.6。免疫荧光染色

免疫荧光染色,介质被殖民地和细胞在PBS洗两次,然后固定在4% PFA 15分钟。细胞被permeabilized 0.1% Triton x - 100在PBS在室温下10分钟。主要抗体(瓦萨号、研发系统,AF2030)稀释3% BSA-PBS,和殖民地孵化1 h在37°C。在PBS细胞被洗两次。二级抗体,在BSA-PBS 3%,稀释了的细胞和孵化20分钟37°C的黑盒。细胞在PBS和5% DAPI-PBS又洗了两次了。细胞被洗再次与PBS和安装CitiFluor (AF1科学服务,甘油/ PBS溶液)。消极的控制,主要抗体是(我)省略或(ii)取而代之的是免疫球蛋白同位素。DAPI染色的共同体中执行5% DAPI-PBS 5分钟后跟两个洗在PBS。

2.7。组织学和免疫组织化学染色

组织学的殖民地进行机械分离后整个MEF层包括卵巢细胞细胞培养的殖民地。分离后,随机安排MEF层是固定在Bouin解决方案3小时,洗了几次EtOH至少24小时70%,然后嵌入石蜡。由此产生的细胞培养集团分段随机。由于大量的殖民地足够部分卵巢细胞的殖民地不同方向进行组织学分析。最近免疫组织化学进行描述(18)使用以下主要抗体:OCT4A(# 2890年代,细胞信号技术,德国;1:100),LIN28A(# 3978年代,细胞信号技术;1:100 - 1:200),SALL4 (# ab57577, Abcam,英国;1:200)和“瓦萨”号(DDX4;# AF2030、研发系统、德国;1:100)。

2.8。免疫印迹分析

西方墨点法是按照标准的程序执行。总之,20毫克的冰冻组织样本使用。蛋白质分离的机械破坏组织在50 HZ TissueLyser(试剂盒、希尔登,德国)。样本变性5分钟在95°C。样本然后运行10% sds - page凝胶三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液的pH值8.8,然后semi-dry-blotted到PVDF膜(1 h 150毫安)。屏蔽膜的非特定的绑定是通过孵化TBS 5%的脱脂奶粉稀释1 h。主要抗体瓦萨号(# AF2030、研发系统;1:2000)和β肌动蛋白(圣克鲁斯,sc - 1616 r;1:5000)被稀释在阻断缓冲区。膜被孵化主要抗体解决方案16个小时在4°C,然后洗了三次与屏蔽解决方案补充渐变20。在与辣根peroxidase-coupled孵化后二次抗体(1 h在20°C)膜又洗了。结合抗体的检测进行了使用Amersham ECL免疫印迹检测试剂工具包(RPN2106)。信号检测和记录使用ChemoCam成像仪(inta,哥廷根,德国)。

2.9。转录组分析

转录组分析,两个新生儿狨猴卵巢,殖民地从两个不同的动物个体P4每样殖民地(100 - 300),绒猴皮肤成纤维细胞和绒猴胚胎干细胞进行了分析。主要得到了成纤维细胞和培养描述最近[21]。使用试剂盒RNA分离试剂(生命技术)根据制造商的指示。RNA质量评估通过测量RIN (RNA数量完整性)使用安捷伦2100生物分析仪(安捷伦科技,帕洛阿尔托,CA)。图书馆准备RNA-Seq是由使用TruSeq RNA样品制备设备(Illumina公司,猫。rs - 122 - 2002)从500年开始总RNA的ng。准确定量的互补脱氧核糖核酸数据库是由使用QuantiFluor dsDNA系统(Promega)。最终确定互补脱氧核糖核酸数据库的大小范围应用DNA安捷伦1000芯片2100年生物分析仪(280个基点)。互补脱氧核糖核酸数据库也会被放大,测序用的芝加哥期货交易所和HiSeq2000 Illumina公司(SR;1×50个基点;5 - 6 GB ca。-百万读取/样本)。 Sequence images were transformed with Illumina software BaseCaller to bcl files, which were demultiplexed to fastq files with CASAVA v1.8.2. Quality check was done via fastqc (v. 0.10.0, Babraham Bioinformatics). The alignment was performed using Bowtie2 v2.1.0 to the cDNA forCallithrix jacchus。数据转换和按samtools 0.1.19和读取每个基因是通过计算0.5.4.p3 htseq版本。数据分析是由使用R / Bioconductor(3.0.2/2.12)加载DESeq gplots, goseq包。候选基因被过滤至少4 x褶皱变化和FDR-corrected值< 0.05。本文中讨论的数据生成符合MIAME指南和存入NCBI的基因表达加入混合和可通过地理系列号码GSE 64966。

2.10。定量逆转录酶聚合酶链反应(RT-qPCR)分析

RT-qPCR进行了如前所述[18]。总RNA提取不同段落的细胞克隆形成。大约50 - 100年殖民地每通道汇集和分析。三个独立的文化(来自三个不同的动物)进行了分析。每一个RNA样本一式三份分析。积极的控制、新生儿狨猴卵巢和狨猴胚胎干细胞。绒猴猴成纤维细胞作为生物-控制多能性和生殖细胞标记。引物补充表1列出了在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/2480298。oocyte-like细胞RNA提取,共28个细胞从不同的段落被收集并随机分为两组。RNA与RNeasy孤立微工具包(试剂盒)根据制造商的指示。分析相对基因表达水平变化的文化在一个通道,殖民地从P7被播种到8单独的井。细胞从两个井分析天收获2,4,6,8。引物序列,PCR产品的大小和引物浓度在表1。

2.11。激素测量

测量选择孕激素的细胞培养基样品经过至少3天的空调进行了使用酶免疫测定(EIA)使用抗血清在羊长大对progesterone-11-hemisuccinate-BSA Heistermann和他的同事所描述的(22]。新鲜培养基被用作控制。Estradiol-17β决定使用一个环境影响评价根据Heistermann et al。23除了,17岁β-estradiol-6-horse-radish-peroxidase作为标签。类固醇的测量都是在未稀释的样本和新鲜的培养基作为控制。

2.12。细胞移植实验

为了测试培养卵巢细胞的再生和组织neomorphogenesis潜力,我们皮下注射~ 10⁶细胞/鼠标。细胞从Accutase-treated卵巢细胞获得殖民地从第五段。四个成年女性RAG2^−−/γc^−−/老鼠缺乏B、T和NK细胞。技术过程一直在前面描述的新生儿睾丸组织(24]。

3所示。结果

3.1。一般观察和形态学的主要细胞培养

我们建立了一个长期的卵巢细胞的主要文化。这包括使膨胀的细胞。五个人的主要文化新生儿狨猴卵巢进行并运行6个月非常相似的形态和动力学。最大的数字是23。然后停止增殖的细胞。最初,相对较小的卵巢细胞殖民地(OCCs)形成可以从mef细胞的形态学和殖民地的边界(图1(一))。OCCs迅速增加的大小形成大菌落直径达到1000μm(图1 (b)几天之内。细胞形成OCCs展出一个epitheloid表型形态(图判断1 (d));即,他们显然是与顶端极核,没有可见的细胞之间形成胞内矩阵光学显微镜的殖民地。然而,缺乏典型的上皮细胞标记如钙粘蛋白(背景)。要想知道更多的细节,请见如下。更高的段落个人OCCs成为小(比较数据1 (b)和1 (c))。一些发达的OCCs中心第二个层细胞的原代细胞层(图1 (c))。殖民地的形态是依稀让人想起灵长类ES细胞殖民地(20.)(图1 (e))。菌落形态的OCCs从未观察到纯粹的老鼠胚胎支线细胞培养。

3.2。OCCs缺乏人口生殖细胞在早期的段落

为了最初比较新生儿ovary-derived细胞殖民地在转录组水平参考样品进行了全面的转录组分析的OCCs深的转录组测序和比较数据集和新生儿卵巢,作为起始物料和包含oogonia狨猴胚胎干细胞作为参考的多能细胞,以及皮肤成纤维细胞,后者代表被间充质细胞。每个样本的转录组是由至少12绪。读取(补充图1)。40.000不同记录中发现每个样本(补充图2)。我们使用低通道数量样品(4通道)为了获得数据从细胞没有广泛的细胞培养适应文物。由于非常有限的材料,只有两个独立的OCC样本和两个新生儿卵巢可以分析。然而,已经这个小组样本(图提供了宝贵的见解2)。OCC样本明显有别于本地卵巢和成纤维细胞(图2(一个))。相比之下,OCCs之间的差异和ES细胞的转录组小。重要的是,PCA区域(图2(一个))表明卵巢和OCCs转录组之间的根本差异。值得注意的是,前50名的本地卵巢之间的差异表达基因和OCCs透露两个主要事实(图2 (b))。(1)几乎所有的差异表达基因在本机卵巢过多。这表明,整个细胞的OCCs通常代表一个族群人口构成本机卵巢,小说没有完全不同的细胞类型开发的文化,至少在可检测数量。(2)在前50名的众多germ-cell-specific基因的差异表达基因MAEL,RNF17,TEX12,TDRD9,MOV10L1,NOBOX,ZP3,FIGLA,SOHLH2,DAZL,SYCP2。事实上,一些生殖细胞的基因,包括DAZL,MAEL, RNF17,TEX12,TEX101,TDRD是在转录组的OCCs完全察觉。等记录OCT4,LIN28,“瓦萨”号也极低或缺席。这强烈表示典型的新生儿的完全丧失卵巢生殖细胞的人口,包括postmigratory热解色谱,oogonia,卵母细胞培养。

OCCs和成纤维细胞之间的比较显示增加许多基因的表达在OCCs(图2 (c))。调节基因包括COL2A1,角蛋白基因KRT36,VCAM1。重要的是,然而,没有发现生殖细胞基因调节的OCCs与成纤维细胞相比,进一步充实生殖细胞来自OCC文化的缺失。排名前50的比较差异表达基因OCCs和ES细胞显示,大多数基因在胚胎干细胞调节,TDGF1,LIN28A,OCT4(POU5F1),NANOG。只有少数基因包括双特异性磷酸酶13 (DUSP13)和丝氨酸肽酶抑制剂,Kazal 1型(SPINK1)体内,调节在OCCs(图2 (d))。

详细的细胞的身份OCCs不能确定到目前为止。许多细胞的OCCs增殖标记ki - 67是积极的(补充图S3)。尽管细胞epitheloid形状,我们未能发现钙粘蛋白在转录组数据以及包含IHC(数据没有显示)。也细胞角蛋白特征蛋白质的上皮细胞只有在转录组仅代表。波形蛋白是典型的间充质来源的细胞蛋白表达在中等水平(~ 50%的新生儿卵巢水平和30%的纤维母细胞水平)。然而,其他钙粘着蛋白如CDH2(类似水平的培养卵巢细胞相比,卵巢,成纤维细胞,胚胎干细胞)和CDH22(新生儿卵巢,一样的范围10 - 20%的成纤维细胞,和50%的胚胎干细胞)OCCs所表达的。因此,表型和分子的细胞构成的状态指标OCCs并不一致。为了最初描述的特性OCCs我们进行了基因本体分析基于基因调节OCCs相比,本机卵巢(图2 (e))。这表明,尤其是细胞粘附、离子和神经递质运输、OCCs和信号通路的调节。

总之,转录组数据表明,生殖细胞是OCCs缺席。然而,详细的身份OCCs到目前为止尚不清楚。由于数量有限的样本(),我们可以通过深度测序分析只有一个时间点,我们进一步研究了由RT-qPCR特定基因在不同的段落也获得纵向数据的OCC文化。

我们最近发现,新生儿狨猴猴卵巢包含原始生殖细胞和生殖细胞表达盛传多能性标记OCT4A SALL4 LIN28,一般生殖细胞标记“瓦萨”号(DDX4) [18]。这些标记都只有非常差在早期的转录组通道OCCs或甚至缺席。我们也未能发现OCT4A、LIN28或“瓦萨”号在早期通过OCC样品中蛋白质含量的免疫组织化学协议(18(数据未显示)。为了量化选择关键标记基因的表达在OCCs胚胎干细胞、皮肤成纤维细胞,和新生儿卵巢由一个独立的方法以及在较高(> 4)的段落,我们执行RT-qPCR多能性和生殖细胞标记包括(减数分裂前的)OCT4A(25),NANOG(25),SALL4(26),LIN28(27),“瓦萨”号(28,参见图5),DAZL(29日),NOBOX(30.),DPPA3/斯特拉/ PGC7(31日,32),PRDM1(33),而PRDM14(34,35]。图3显示了一种文化的模范RT-qPCR数据从通道1到13。这些数据证实最象征多能性的因素OCT4A和NANOG没有表达所有OCC样品分析(图3)。相比之下,SALL4,LIN28,“瓦萨”号在段落≥P4除了SALL4和诱导LIN28票数。为了进一步证实这些发现,我们还测试了的表达PRDM1、PRDM14 DAZL、DPPA3 NOBOX,SCP3在不同段落的OCCs(图4)。DAZL、DPPA3 NOBOX,SCP3作为特定的生殖细胞基因缺失或非常低的低的段落,这是一致的数据显示在图3。然而,在后期,所有标记都可以在变量的水平。相比之下,PRDM1和PRDM14规范,早期生殖细胞基因而不是特定于生殖细胞,有强劲表现在所有细胞培养样本。这些数据表明,我们的文化支持细胞的生存和可能也选择有潜力(重新)表达一组减数分裂前的和女性生殖细胞标记基因。

3.3。OCCs生成Oocyte-Like细胞

OCCs生成大,自由浮动的球形细胞,我们称为oocyte-like细胞(共同体;(17])。共同体形态类似于未成熟的卵母细胞。他们的直径范围从20 ~ 40μm(图5(一个))。我们有时也观察到小结构有点类似极体(图5(一个),对图片)。然而,我们从来没有观察到透明带也不是follicle-like结构描述的Dyce et al。17]。比较的共同体与真正的绒猴猴卵母细胞,见图5 (b)。重要的是,企业发展甚至在20通道和5个多月的文化但并未在段落中观察到< 4。我们还观察到共同体在MEF-only细胞培养和基于mef ESC文化中也是。这确实强烈表明,共同体从OCCs推导。最初描述共同体,我们测试了关键的多能性和生殖细胞的表达由RT-qPCR标记。我们收集了28共同体和随机分配细胞两种组(称为OLCs1和OLCs2),然后分析。OCT4A, NANOG,LIN28较低与胚胎干细胞相比,共同体和新生儿卵巢(数据吗5 (c)- - - - - -5 (e))。SALL4是强劲表示(图5 (f)在控制的范围。相比之下,PRDM14、DPPA3 DAZL,“瓦萨”号在新生儿在共同体远高于卵巢的指示非常健壮的表达这些生殖细胞标记在共同体(数据吗5 (g)- - - - - -5 (j))。NOBOX是在一个类似的范围作为新生儿卵巢。重要的是,DAZL,瓦萨号,NOBOX特定生殖细胞系表达的标记,都不会ES细胞和成纤维细胞(数据吗5(我)- - - - - -5 (k))。减数分裂的标志,我们还测试了SCP3。这信使rna也在共同体中发现,尽管在较低水平相比,新生儿卵巢(图5(左))。SCP3无法在ES细胞和成纤维细胞。减数分裂的一个好的指标是染色质缩合制备的减数分裂(图5(米)(左)。然而,我们并没有看到类似的染色质凝结在共同体。相比之下,共同体显示同质DAPI整个核(图信号5(米),对吧)。虽然没有证据表明减数分裂,标记的表达强烈表明生殖细胞的身份共同体。为了进一步证实了共同体的生殖细胞系的身份我们也旨在检测瓦萨号共同体中的蛋白质。首先我们为特征的“瓦萨”号抗体,防止误导基于抗体的结果我们36)和其他(37)最近所描述。免疫印迹分析中一个非常强烈和突出乐队~ 85 kDa的预期大小的睾丸中发现表明高特异性的瓦萨号抗体(图6(一))。卵巢缺乏瓦萨号信号是由于卵巢从老猴子几乎耗尽卵巢生殖细胞储备。因此,瓦萨号低于检出限的匀浆蛋白在卵巢。我们也测试了瓦萨号抗体在免疫组织化学组织部分从成人狨猴睾丸和卵巢(数字6 (b)和6 (c))。在两种性别中,抗体非常强劲,特别是发现生殖细胞的抗原决定基导致明显的细胞质生殖细胞标记。nongerm细胞被染色或显示只有微弱的背景染色。这些发现证明的特异性抗体对狨猴瓦萨号蛋白质。然后,我们使用该抗体来检测潜在的OCCs共同体。当我们固定的OCCs第五段原位强烈的大型细胞染色质凝集,强大的DAPI荧光图所示6 (d),被“瓦萨”号标记抗体(图6 (e))。周围细胞的信号是否仅仅是背景染色还是强调小生殖细胞祖细胞目前无法决定。大量标记细胞的直径大约是35μ米的直径在图所示的共同体5(一个)。我们也分离培养皿的细胞培养和处理比如睾丸和卵巢如图6 (b)和6 (c)——免疫组织化学。我们发现大的孤立的细胞强烈彩色瓦萨号(数字6 (f)和6 (g))。瓦萨号的控制取代了相应的免疫球蛋白(图显示只有非常微弱的背景信号6 (h))。这些数据表明有孤立的瓦萨号蛋白阳性细胞oocyte-like文化来源于新生儿狨猴猴卵巢。

3.4。在一个段落标记相对丰度减少

获得初始信息的转录丰度随时间标记在OCC开发在一个通道,我们孤立的RNA复制样本OCCs后2,4,6,8天。OCT4A,NANOG,LIN28很低或没有(数据吗7(一)- - - - - -7 (c))。相比之下,SALL4和“瓦萨”号强劲检测所有样品(数据吗7 (d)和7 (e))。这两个标记表现出在第二天丰度高。之后的时间点(4 - 8)显示转录丰度相对减少GAPDH可能反映了更高的增殖率的marker-negative(但GAPDH表达)细胞marker-positive相比细胞导致的稀释效应“瓦萨”号- - -SALL4阳性细胞。

3.5。没有性类固醇的OCCs的生产

我们怀疑OCCs有能力生产女性性类固醇卵巢的特定细胞在活的有机体内。因此,我们测试了文化中样本低和高通道数天后没有媒介的变化。雌二醇的样本进行分析,主要是由卵巢颗粒细胞,孕激素,形成的细胞黄体。雌二醇和孕酮中检测出介质样品。此外,FSHR记录被深度测序和OCC样品中检测不到LH / CGR丰度低于在新生儿卵巢,成纤维细胞,胚胎干细胞(数据没有显示)。因此,殖民地不包括功能性卵巢的内分泌细胞。

3.6。畸胎瘤和卵巢组织形成皮下移植试验

皮下细胞移植到老鼠免疫缺损是一个有用的方法来测定细胞分化能力,例如,畸胎瘤形成试验。此外,我们最近表明单细胞悬浮体来源于新生儿猴睾丸分离后可以重新构建复杂的睾丸组织移植到老鼠免疫缺损(24]。为了测试OCCs是否有能力形成卵巢组织在“在活的有机体内“移植后的条件,我们注射~ 10⁶每只老鼠从第五段细胞皮下注射成4成年女性NOD-SCID老鼠。注射部位的组织收集了15周后进行组织学分析。无论是ovary-like组织还是畸胎瘤或任何其他明显的组织被发现(数据未显示)。

4所示。讨论

一个有争议的辩论mitotically的存在活跃的种系干细胞产后卵巢特点的最后十年在哺乳动物卵巢生殖细胞研究。几个报告提供数据支持的存在卵巢干细胞在产后小鼠卵巢生殖细胞系,例如,(10,13,38),而其他的研究未能确定女性生殖系干细胞,例如,(7,8),从而支持卵巢生物学的经典视图(1]。在灵长类包括人类,公布的数据也同样有争议,仍然没有完全确凿。Byskov et al。3未能发现oogonia,可能的候选细胞卵巢干细胞,在产后人类卵巢超过两年,甚至在年轻产后卵巢干细胞标记OCT4检测只有很少。我们最近也未能发现多能性干细胞marker-positive狨猴的卵巢细胞在1岁18]。另一方面,白色等。12]孤立mitotically积极从成人卵巢皮质细胞,有可能形成oocyte-like细胞在体外和形成卵泡alloxenografting相结合的方法。然而,最近人民币et al。9)未能提供证据mitotically活跃在恒河猴种系干细胞(解剖)和老鼠认为成人卵巢不经过生殖细胞更新。此外,近十年前,Dyce et al。17)报道,不仅卵巢细胞有潜力开发女性生殖细胞,而且胎儿猪皮肤细胞。他们成立了oocyte-like细胞在体外这是从hormone-responsive挤压follicle-like总量。

我们已经建立了一个长期为新生儿狨猴猴卵巢细胞细胞培养系统。播种的绒猴猴卵巢细胞悬液在MEF细胞导致细胞殖民地的发展形态类似殖民地以前曾被观察到的不同的其他团体对人类39)和鼠标(38,40卵巢细胞培养。然而,尽管这些研究报道的强劲表现多能性标记,如OCT4和NANOG因此声称一个ES细胞样的字符的细胞(40),我们未能发现这些核心多能性标记狨猴卵巢细胞培养在转录和蛋白质水平(后者没有显示),虽然我们的原始材料,也就是说,新生儿卵巢,对这些因素是积极的。事实上,绒猴猴原始生殖细胞(19]和oogonia [18]强劲表达OCT4。本机减数分裂前的生殖细胞之间的差异和培养卵巢癌细胞显示,绒猴OCCs没有剩余的(“污染”)原始生殖细胞或oogonia。我们所有的数据指出,减数分裂前的生殖细胞缺席的早期培养卵巢癌细胞的通道。这也是在出版物相比猪卵巢干细胞。Bui和他的同事们(41]假定的干细胞来自成人猪卵巢产生生殖细胞样的细胞对应于原始生殖细胞。然而,这些细胞,与描述的细胞在我们目前的研究中,也有力表达多能性等因素OCT4和NANOG。此外,猪细胞的表型在文化不同于殖民地观察到在这个研究和其他研究中,例如,(40]。然而,有趣的是,尽管显然不同的起始条件,我们和中方的细胞培养系统的发展导致大型oocyte-like细胞。

除了缺乏多能性因素的情况下,我们甚至没有检测到一个DAZL、MAEL RNF17、TEX12 TEX101,或TDRD1成绩单的OCCs 4日通过深度测序,而所有这些新生儿卵巢生殖细胞记录丰富的样本进一步支持的缺失从绒猴卵巢生殖细胞细胞培养在低通道。因此,我们得出这样的结论:狨猴OCCs是生殖细胞和多能干细胞。的确切身份OCCs将在未来的研究进行分析。然而,尽管表现形态类似上皮,上皮细胞的OCCs缺乏蛋白质特征如钙粘蛋白和细胞角蛋白。然而,从OCC通道4起,我们观察到单个oocyte-like细胞的发展强烈表达生殖细胞基因瓦萨号,DAZL NOBOX DPPA3,SALL4。此外,减数分裂的标志SCP3在共同体表示即使在中等水平。相比之下,OCT4A, NANOG,LIN28较低的共同体。除了标记表达数据在mRNA水平我们想确认瓦萨号也在蛋白质水平上。我们发现强有力的瓦萨号蛋白表达在共同体。,这个标记资料表明,企业可能对应于减数分裂前的后期阶段。这些特征在一定程度上类似于描述的共同体Dyce et al。17]。然而,Dyce和他的同事们研究发现,共同体由细胞聚集脱离细胞培养表面,形成hormone-responsive follicle-like结构。然后,共同体从毛囊和挤压释放到媒介。从500000年~皮肤细胞大约6 - 70大细胞被挤压。我们的发现在相同的范围通常5 - 10大共同体每通道。但是我们从来没有观察到follicle-like结构。此外,我们没有得到任何证据的内分泌调节共同体发展的绒猴猴卵巢细胞培养。

因为我们原本打算oogonia文化,我们将细胞下降主要在200 g。这可能不足以定量收集这些细胞在培养的颗粒在先前的研究中,卵巢的种系干细胞沉淀在300克(13)或1000克(14),分别。在此基础上,假设我们在本研究收集oogonia(和其他较大的体细胞)使用200克的力量只有边际的共同体的祖细胞,这可能是一个族群的大阪证交所(14]。oogonia显然没能活下来在我们的文化系统。因此,我们无法探测到多能性标记在我们的文化和早期生殖细胞标记的段落。然而,我们进一步假设,尽管低力应用在我们的研究中一些该细胞干细胞能力仍出现在文化。他们假设能够发展成共同体后超过三个段落。

我们还测试了磁激活细胞分选(mac)丰富的干细胞。然而,mac电脑使用,例如,交易- 1 - 81抗体并不成功。必须指出,然而,新生儿狨猴卵巢是极其微小的,其可用性是非常有限的。事实上,新生儿卵巢的大小只有2毫米×1毫米×1毫米。因此,实验改进和细胞浓缩方法非常具有挑战性。因此,我们决定在本研究文化组织消化后获得的无序的细胞群。

总之,我们建立了一个长期的新生儿狨猴猴卵巢细胞培养系统。然而,我们未能发现多能干细胞和减数分裂前的生殖细胞在低OCC段落标记。从通道4起,然而,企业开发和仍在发展中在高通道(> 20)经过5个多月的文化。考虑到标记表达数据,视图的生殖细胞的身份共同体似乎有道理的。配子形成的一个重要前提是减数分裂(42]。除了SCP3的表达,这是一个基本的蛋白质减数分裂synaptonemal复杂的形成,我们没有证据表明获得减数分裂的共同体的形成除了一些结构形态像极地的身体。我们也从来没有观察到透明带。,企业似乎在这个文化系统产生生殖细胞系细胞,但他们既不是功能雌性配子也不代表减数分裂生殖细胞阶段。

目前还有待证明的祖细胞共同体发展在我们的文化系统。到目前为止,我们无法确定这些细胞在绒猴。然而,组织候选人与种系卵巢干细胞的存在潜在的可能是卵巢表面上皮,讨论是一个多功能的组织可能窝藏干细胞或祖细胞类型(43]。在这方面,还很小的类似胚胎干细胞的概念(VSELs)应该考虑16]。

5。结论和展望

总之,我们已经建立了一个非人类灵长类动物细胞培养系统,允许长期文化和发展共同体的非人灵长类动物物种。绝大多数的培养细胞在这项研究中,然而,既不多能干细胞或生殖细胞(干细胞)行,被建议或先前的报道所示(38- - - - - -40]。未来的实验应该旨在解决这种差异和测试是否这是一种特异的现象。

未来实验还将瞄准的鉴定和功能描述干细胞/祖细胞群在绒猴文化系统。此外,协议还需要支持共同体进入减数分裂可能导致将来成熟的卵母细胞。除了这些细胞的功能测试,正确的表观遗传状态需要确认。在将来,一个精致的文化系统基于一个这里描述可能允许更详细在体外研究灵长类动物的生殖细胞发展早期阶段,共同体的分子和细胞的身份和他们的祖细胞实验额定马力系统访问。从长远来看,这也可能造成未来的发展小说女性不孕的治疗方法。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突,可以视为损害公正性的研究报道。

作者的贡献

Bentolhoda Fereydouni概念和设计,进行收集和汇编的数据,数据分析和解释,论文写作和最终批准纸。加芙Salinas-Riester收集和汇编的数据,进行数据分析和解释,论文写作和最终批准纸。迈克尔Heistermann收集和汇编的数据,进行数据分析和解释,最后批准纸。拉尔夫Dressel进行金融支持,收集数据和/或装配和最终批准纸。露西娅Lewerich进行收集和/或装配的数据,数据分析和解释,并最终批准。恩典鼓手执行提供学习材料和纸的最终批准。Rudiger原意进行构思和设计,金融支持,收集和/或装配的数据,数据分析和解释,论文写作和最终批准纸。

确认

作者欣赏优秀的援助和妮可Umland的支持,安吉丽娜贝伦森,Gesche Spehlbrink。他们也很感谢Erika佐佐木提供ES细胞,凯瑟琳娜Debowski ES细胞培养,动物设施的成员出色的畜牧业。他们感谢艾伦·威斯的行政支持。的奖学金的支持Bentolhoda Fereydouni德国Akademischer Austauschdienst(德意志)。Bentolhoda Fereydouni在奖学金的德国Akademischer Austauschdienst(德意志)。机构资源和支持的工作主要是轻微的格兰特德意志Forschungsgemeinschaft脱硫;Be2296-6)题为“多能细胞狨猴睾丸“Rudiger原意。细胞注入小鼠化验由拉尔夫Dressel支持由德意志Forschungsgemeinschaft合作研究中心(SFB1002 TP C05)。

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