间充质干细胞与p5加载,源自CDK5活化剂p35区域抑制Calcium-Induced CDK5激活内皮细胞

文摘

干细胞疗法在疾病的潜在使用势头大酒店在过去的几年里,最近的临床试验显示结果在优惠的一小批急性中风患者。同样,它们已经用于临床前模型为固体肿瘤的有效治疗药物。这里我们有特征吸收和释放的小说p5-cyclin-dependent激酶5 (CDK5)抑制肽由间充质干细胞和显示释放水平能够阻止异常的细胞周期蛋白依赖性激酶5 (CDK5)信号通路,通过细胞周期蛋白依赖性激酶的磷酸化5 (CDK5)和p53。这些路径代表了重大急性卒中后刺激细胞凋亡机制,因此其调制可能病人复苏中获益。这项工作表明潜在的药物使用干细胞作为中风治疗和运载工具除了抗癌容器特别是,如果一个目标和/或控股机制可以定义。

1。介绍

尽管最新进展在缺血性中风的研究中,病人的治疗和恢复率没有明显改善(1]。这样一个临床场景强调投资于新的治疗方法的重要性。的临床前和临床研究表明,干细胞疗法有巨大潜力治疗各种疾病(2]。成体干细胞被广泛的研究,已经成功的来源,fda批准的治疗方法的疾病包括青少年糖尿病和帕金森病。与疾病的治疗如糖尿病和帕金森病人口限制在哪里失去了,失去了多种细胞类型在中风和修复将是重要的血管(血管内皮细胞,平滑肌细胞和周)和神经元和神经胶质细胞3- - - - - -5]。另一个重要的区别是,中风是一种急性损伤时间有限,这可能会使大脑更好客的移植比其他疾病。间充质干细胞(msc),也称为间充质基质细胞)的优点是相对容易传播在体外和自体msc移植到患者有更少的道德问题和不受异源免疫,因此可能代表一个理想的候选细胞疗法(6]。

细胞周期蛋白依赖性激酶5 (CDK5),一个丝氨酸/苏氨酸激酶,在复杂的活化剂,p35区域(35 kDa的蛋白质)和p39 (39 kDa的蛋白质),对哺乳动物早期神经发育至关重要(1]。然而,各种毒害神经的条件下,如缺血性脑损伤、氧化应激、淀粉样蛋白β肽(β),会引起钙dyshomeostasis和炎症,引起细胞内钙离子的流入和上升^{2 +},从而促进激活calpain, Ca^{2 +}激活蛋白酶,反过来劈开p35区域p25, p10片段(7,8]。p25形成更稳定的CDK5-p25极度活跃的复杂,导致异常hyperphosphorylation各种基质的CDK5τ和神经丝,导致神经细胞凋亡,与神经病理学相关。因此,治疗方法专门针对CDK5-p25复杂可能成功。然而,激酶抑制剂(如roscovitine)并不像他们非常具体的抑制不仅CDK5-p25 CDK5-p35和其他CDKs,导致严重的副作用,从而降低治疗效果。为了克服这个问题,几个氨基酸残基组成的多肽p35区域如CDK5抑制肽(CIP 125氨基酸残基的多肽),p10, p5已经生成并被证明特别减少CDK5-p25增加活动而不影响正常的内生CDK5-p35或其他CDKs活动(9- - - - - -15]。特别是,p5也减少缺氧/缺血脑损伤引起的神经细胞凋亡,glucose-mediated毒性高,或β压力(12- - - - - -14]。基于这些令人鼓舞的结果,我们决定研究msc是否能够吸收和释放p5肽,然后抑制CDK5 calpain激活诱导的内皮细胞以及msc的潜力作为药物载体提供p5 peri-infarcted地区和保护内皮细胞和神经元CDK5-p25诱导毒性在这些地区。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

人类脂肪间充质干细胞(hADMSCs)请提供瓦伦提娜Cocce朱利奥Alessandri教授和教授。HAD-MSCs脐周脂肪组织中分离的特征描述(16]。细胞生长在干细胞培养基(SCM)由80% Iscove修改杜尔贝科的介质(IMDM;Sigma-Aldrich)含5%胎牛血清(的边后卫;Sigma-Aldrich), 10% NeuroCult中等(干细胞技术),和10%内皮基底介质(实证)(Lonza)湿润孵化器有限公司为5%₂在37°C。牛主动脉内皮细胞(BAECs)在杜尔贝科的修改鹰培养基培养(DMEM;Lonza)补充10%的边后卫。

2.2。p5 hADMSCs的启动

p5、24-residue肽来源于p35区域CDK5活化剂,化学合成和单一生物素一半是共轭n端(1521世纪](生化药剂)。Biot-Ahx-KEAFWDRCLSVINLMSSKMLQINA-OH p5-biotin肽序列。的毒性p5 hADMSCs决心在24小时alamarBlue试验(细胞毒性测试;生命技术)在为期3天的alamarBlue试验(抗增殖测试)。基于这些结果,进行hADMSCs p5启动的三倍浓度,3、6和12μ克/毫升。简而言之,subconfluent文化(2×10⁵)hADMSCs暴露在不同剂量的p5。孵化24小时后,这些细胞被洗两次PBS和使胰蛋白酶化。细胞被播种在新瓶新鲜SCM。经过24小时的文化、细胞条件培养液(CM)收集和检测防护效果在体外BAECs。厘米从未经处理的hADMSCs培养在相同条件下被用作控制。

2.3。免疫荧光分析

2×10⁴hADMSCs镀在玻璃盖玻片24-well多井板块在供应链管理发展到subconfluence超过24小时。然后细胞治疗3μ克/毫升p5。在指定的潜伏期(1、2、4、8、24小时),这些细胞被固定在4%多聚甲醛。其他时间点,细胞包含p5被24小时孵化后,媒体和细胞被洗3次PBS和美联储新鲜SCM。在相应的时间点,在4%多聚甲醛固定细胞。

BAECs (1×10⁴)镀在玻璃盖玻片24-well多井盘子DMEM种植subconfluence超过24小时。不同浓度的细胞治疗p5或厘米p5-primed hADMSCs 24小时。细胞被固定在4%多聚甲醛。

p5检测使用anti-fluorescein(生物素)抗体(Abcam) 1: 200年的牛奶。盖玻片与DAPI然后使用Vectashield安装安装介质(向量实验室)和密封的指甲油。获得的图像在200 x放大使用成像仪Z1荧光显微镜(蔡司)和荧光强度量化了ImageJ 1.49软件(https://imagej.nih.gov/)。值是平均6个图片。

2.4。免疫印迹分析

7×10⁴BAECs镀在6-well多井盘子DMEM种植subconfluence超过24小时。细胞治疗5μ米钙离子载体A23187 CaCl (Sigma-Aldrich)和2.5毫米₂(Sigma-Aldrich)有或没有p5或厘米p5-primed hADMSCs。细胞细胞溶解在缓冲区里帕含有蛋白酶抑制剂的鸡尾酒和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(Sigma-Aldrich)。免疫印迹进行使用10% sds - page和40μg总蛋白质。蛋白质被转移到聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)。的膜被阻塞的解决方案(pH值7.4)由1% BSA (Sigma-Aldrich)溶解在TBS含有0.1% Tween-20 (TBS-Tween, pH值7.4)1小时孵化与主抗体包括anti-phospho-CDK5 (pTyr¹⁵)(Sigma-Aldrich, 1: 500), anti-CDK5(细胞信号技术,1:1000),anti-p35 (Abcam, 1: 100), anti-phospho-ERK1/2(细胞信号技术,1:2000),anti-ERK1/2(细胞信号技术,1:1000),anti-phospho-p53 (ps¹⁵)(细胞信号技术,1:500),anti-p53 (Sigma-Aldrich, 1: 500), anti-active caspase-3 (Sigma-Aldrich, 1: 200), anti-procaspase-3 (Abcam, 1: 250)和反α微管蛋白(Abcam 1: 5000)。辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体,山羊anti-rabbit免疫球蛋白或山羊anti-mouse免疫球蛋白(达可)。免疫反应性与化学发光检测可视化工具包(皮尔斯ECL免疫印迹基质;热科学)。免疫印迹图像捕获与Chemidoc触摸成像系统(Bio-Rad)。分子量蛋白质的估计与MagicMark XP相比西方蛋白质标准(表达载体)。墨迹图所示是一个执行的至少两个独立的实验。

2.5。质分析

液相色谱-光谱法(质)分析使用安捷伦1290 LC系统耦合到一个安捷伦6530高清四极飞行时间质谱仪(q-TOF),配有安捷伦射流技术双电喷射源。五常肽在甲醇(最适条件质等级;费舍尔科学)和色谱分离进行水域对称C18柱(2.1×50毫米身份证。,3.5μm;安捷伦科技)。列是筛选了0.5毫升/分钟的流量使用水作为流动相乙腈作为流动相,均包含0.1%甲酸。0.1%的移动阶段B是保持不变,然后一个线性梯度开始达到100%移动阶段B在15分钟,直到20分钟;则设置梯度达到50% B在25分钟,然后到40分钟;最后的梯度将达到0.1% B在55分钟,然后保持在0.1%到60分钟。列温度维持在20°C和注入体积是10μl

列废水直接引入到电喷射q-TOF质谱仪的来源。分析在正离子模式下的扫描范围100 - 3200和扫描速度每秒1光谱。电喷雾源条件如下:毛细管2000 V,喷嘴500 V, 80 V, fragmentor漏杓45 V,干燥气体80°C L /分钟,8点nebulisation气体15 psig,鞘气体在10 L /分钟350°C。安捷伦质量猎人软件被用来获取和处理数据(收购版本B.05.00和定性数据分析版本B.05.00)。

2.6。在体外增殖试验

两个常任理事国的保护作用或厘米的p5影射hADMSCs BAECs扩散后的治疗^{2 +}离子载体结合CaCl₂是由alamarBlue分析(技术)。简单地说,1.2×10³BAECs镀在96孔多井在DMEM板块。然后细胞治疗5μ米钙离子载体A23187 CaCl (Sigma-Aldrich)和2.5毫米₂(Sigma-Aldrich)有或没有p5或厘米p5-primed hADMSCs。三个井是专门为3天,每天测定细胞增殖的时间进程监控。在实践中,10μL alamarBlue试剂(技术)被添加到每个好,盘子被孵化的37°C 4小时在湿润的气氛中公司为5%₂在记录荧光()使用协同HT multidetection标(BioTek仪器)。根据标准曲线BAECs产生荧光信号绘制对细胞的数量(在0和2.0×10之间⁴BAECs),细胞的荧光信号数据计算方法。

3所示。结果

3.1。吸收和释放的p5 hADMSCs

p5是24-residue肽来源于p35区域CDK5活化剂。由于p5基本肽和需要被完全溶解醋酸,我们测试的毒性hADMSCs和BAECs p5解决方案。最大剂量的p5,不会影响细胞的生存和增殖能力,12μ使用alamarBlue测定g / mL。基于这些结果,三倍的浓度,3、6和12μg / mL,在当前的研究中使用。

Subconfluent文化(2×10⁴)的附着hADMSCs被暴露在3μg / mL生物素化的p5。p5内化成hADMSCs研究通过荧光显微镜使用anti-fluorescein(生物素)抗体。1小时后启动,内化的p5 hADMSCs可观(数字1(一)和1 (d))。细胞质染色逐渐加强和丰富的启动(24小时)。24小时后,p5留在细胞质5天的分布而染色从10天下降,表明其可能的排泄,退化,或两者兼而有之。

评估如果p5-primed hADMSCs p5释放到媒体,subconfluent文化(2×10⁵)的附着hADMSCs被暴露在12μg / mL生物素化的p5 24小时。几个洗和胰蛋白酶化后,p5-primed hADMSCs进一步培养和他们的条件培养基(CM)在BAECs每24小时收集和测试。有明显的p5染色BAECs对待厘米p5-primed hADMSCs收集天1和2,染色降低了3天,没有染色观察从第四天开始,这表明p5-primed hADMSCs不断释放p5 3天到媒介,48小时内释放峰值(数字1 (c)和1 (f))。比较p5染色强度与纯p5和CM BAECs治疗,我们估计p5 CM收集天1和2是等价的ng / mL和ng / mL,分别收集和p5厘米相当于3天ng / mL(数字1 (b),1 (c),1 (e),1 (f))。

3.2。质分析p5

为了量化p5释放p5-primed hADMSCs,我们测试了p5质分析。质分析可以检测p5和测量离子1046.1700对应于[M]^{3 +}这是在良好的协议与期望值(图2)。的平均峰面积200 ng / mL p5从6测试5563.63项和2430.55 100 ng / mL p5(数据2 (b)和1 (c))。质谱显示没有50 ng / mL p5的高峰。结果表明,能够测定p5质分析,发现在100年和200年之间线性ng / mL的范围中p5发布p5-primed hADMSCs估计前3天内通过免疫荧光分析(数据1 (c)和1 (f)在50 ng / mL),但发现不了的。质分析将用于量化的p5释放p5-primed hADMSCs未来的工作。

3.3。激活的CDK5 Calpain培养的内皮细胞

先前的研究已经表明,Ca^{2 +}离子载体,结合CaCl₂激活内源性calpain,从而激活的乳沟CDK5 p35区域p25的培养神经元(7]。我们调查是否Ca的综合治疗^{2 +}离子载体和CaCl₂能够激活,使磷酸化通过calpain CDK5培养内皮细胞。免疫印迹结果表明p35区域的水平下降而磷酸化水平的CDK5增加10到15分钟的治疗后的Ca^{2 +}离子载体和CaCl₂;之后立即p35区域水平增加,pCDK5水平下降,这表明Ca^{2 +}离子载体和CaCl₂治疗激活内源性calpain和暂时性的裂解p25 p35区域,进而激活和磷酸化CDK5在内皮细胞(图3)。

因为calpain据报道被激活在凋亡细胞死亡,我们怀疑CDK5的活化和细胞死亡之间的联系(1,17]。事实上,Ca^{2 +}离子载体和CaCl₂治疗诱导细胞死亡在内皮细胞早在10分钟的治疗;因此,我们检查了MAPK信号通路和基因参与细胞凋亡(1]。ERK1/2的磷酸化水平显示了类似的模式pCDK5而phospho-p53表达逐渐增加10分钟后的治疗^{2 +}离子载体和CaCl₂(图3)。为phospho-p53写就preabsorption需要进行以确保以来识别的有效性有两个乐队在一起。相比之下,caspase-3被激活在4小时的治疗,比p53(图之后3)。

3.4。p5-Primed hADMSCs p5和抑制CDK5激活发布Calpain培养的内皮细胞

我们调查是否p5可以通过calpain抑制CDK5诱导的激活。相比之下,Ca的10分钟的治疗^{2 +}离子载体和CaCl₂独自一人,所有三个浓度的p5(3、6和12μg / mL)抑制p35区域的乳沟和磷酸化CDK5诱导的Ca^{2 +}离子载体和CaCl₂。最高和最低抑制是由6μ克/毫升和12μ分别为g / mL(图4(一)道4 - 7)。更有趣的是,3μg / mL p5阻止激活p53的Ca^{2 +}离子载体和CaCl₂,这表明p5可能通过抑制p53保护细胞凋亡。越少的有效性更高剂量的p5,尤其是12μg / mL,可能是由于相对更高浓度的乙酸在这些p5解决方案。令人惊讶的是,pERK1/2水平不受p5治疗,表明ERK1/2在内皮细胞激活Ca^{2 +}离子载体和CaCl₂独立于CDK5信号处理。

然后,我们调查是否hADMSCs影射与p5释放足够的p5抑制p35区域乳沟,calpain CDK5激活诱导。p5 hADMSCs暴露在三个剂量(3、6和12μg / mL)为24小时。基于p5释放的时间进程免疫荧光试验(数字1 (c)和1 (f)),条件培养液(CM)从p5-primed hADMSCs BAECs收集1天测试。从12厘米μg / mL p5-primed hADMSCs抑制p35区域的乳沟和CDK5磷酸化,更重要的是抑制phospho-p53 Ca后表达^{2 +}离子载体和CaCl₂治疗(图4(一),莱茵10)。类似p5,厘米p5-primed hADMSCs并不影响ERK1/2由Ca的磷酸化^{2 +}离子载体和CaCl₂治疗。

3.5。从Calpain-Induced p5-Primed hADMSCs保护内皮细胞毒性

当Ca^{2 +}离子载体和CaCl₂治疗激活细胞凋亡相关基因、p53和caspase-3等,我们进一步研究了Ca的细胞毒性效应的综合治疗^{2 +}离子载体和CaCl₂向BAECs。未经处理的细胞相比,10分钟的治疗^{2 +}离子载体和CaCl₂显著抑制BAECs扩散60.9% (),而2小时的治疗抑制BAECs增长90.5% (24小时alamarBlue试验)。然后,我们调查是否p5 p5-primed hADMSCs将保护bac对细胞毒性引起的Ca^{2 +}离子载体和CaCl₂治疗。两种浓度的p5(3和6μg / mL)和条件培养液(CM)从12μg / mL p5-primed hADMSCs收集BAECs第一天进行了测试。扩散化验表明,p5和CM p5-primed hADMSCs并不影响BAECs数字Ca的10分钟的治疗^{2 +}离子载体和CaCl₂通过3天(图5(一个))。然而,相比之下,Ca的2小时的治疗^{2 +}离子载体和CaCl₂孤独,BAECs数字6μg / mL p5组增加了13%在2天,3天,20%和22%,第四天虽然这些增加并不显著(图5 (b))。更令人鼓舞的是,BAECs数字p5-primed hADMSCs CM组增加了35%在2天,3天43% (4(天),26%)与2小时的治疗^{2 +}离子载体和CaCl₂单(图5 (b))。的coculture p5-primed hADMSCs和BAECs权证的进一步评估p5-primed hADMSCs保护BAECs calpain激活引起的细胞毒性。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们的研究结果表明,通过孵化与p5 hADMSCs hADMSCs可以吸收p5和释放生物功能性p5时间动力学以及剂量足以抑制p35区域的乳沟CDK5的磷酸化,upregulation calpain的激活p53诱导的内皮细胞。因此,p5-loaded hADMSCs可能用来保护内皮细胞免受CDK5-p25 hyperactivity-induced毒性引起的细胞内钙^{2 +}崛起和calpain激活下接触压力,如缺氧/缺血损伤、氧化应激和炎症。

使用msc主动靶向治疗药物的工具尤其有吸引力,因为mcs小型复合掺入,已被证明是宽容immunoprotective pathotropic。考虑到限制数量的msc可以交付在活的有机体内,重要的是要有足够的药品纳入msc为了达到治疗目标组织中的药物浓度(18]。大量研究纳米颗粒的吸收内化的hADMSCs表明纳米粒子的改性可以提高纳米颗粒,大小控制,适当的培养时间,纳米颗粒浓度(19]。在目前的研究中,我们旨在负载msc CDK5抑制肽,分子比纳米颗粒,抑制CDK5-p25活动。大肽可能有问题关于肽进入细胞的结合,由内吞作用进入和控制胞外分泌细胞。因此我们选择了最小的可用截短肽p35区域。p5 24-residue模拟肽的p35区域c端和更容易扩散肽,抑制CDK5-p25活动但不影响内源性CDK5-p35活动(12- - - - - -15]。我们的研究首次证明,通过一个简单的在体外启动过程中,hADMSCs包含足够多的p5。

治疗是有效的,代理人必须首先加载稳定细胞内载波,然后被释放到细胞外空间缓慢和稳定的,而不是一个快速释放到体循环的细胞达到目标站点之前,从而使细胞载体时间迁移对中风地区后,达到尽可能多的目标细胞系统交付。我们的研究结果表明,吸收的p5 hADMSCs增加时间的方式,从小时开始孵化,逐步丰富在细胞质的24小时启动。内化后,p5-primed hADMSCs不断释放p5 3天到媒介,48小时内释放峰值,而大量的p5留在细胞质超过5天。纳米粒子的结合和释放动力学msc治疗恶性神经胶质瘤的表明,纳米颗粒显示初始破裂释放细胞内的第一个4小时后跟一个稳定版本9天(20.]。这个动力学是特别有利,因为启动msc与p5最大装载至少需要8个小时,在此期间破裂释放p5完成,因此p5加载在细胞持续释放阶段。因此,p5保留在细胞作为细胞内药物仓库,逐渐释放封装肽。定时的药物释放可以进一步修改设计的“内部”和“外部”触发器。pH-sensitive链接器释放药物在纳米颗粒沿着pH梯度(21]。考虑到缺氧地区通常导致低pH值微环境,pH-dependent释放药物控制释放只有在目标可以让中风网站。综上所述,尽管非常广阔,更好地了解药物释放的msc可以提供更具体的新手段,选择性,定时和控制药物的释放在活的有机体内。

也是至关重要的,以确保药物加载并不影响msc的可行性或本国属性,尤其是他们pathotropic属性。几项研究证明了装载抗癌药物纳米颗粒甚至化疗药物不影响msc(短期或长期生存能力的19,22]。我们的工作也证实化疗药物紫杉醇和p5加载影响msc(未发表的数据)的可行性。关键属性的使用msc作为药物载体是他们迁徙的潜力。在体外transwell实验表明,纳米粒子加载msc仍然具有迁移能力对化学引诱物和肿瘤细胞(如U87MG和神经胶质瘤U251细胞)(20.,23]。同样,我们未发表的数据显示,细胞毒性药物阿霉素的吸收没有影响骨髓间充质肺癌细胞的迁移特性。

CDK5是一种丝氨酸/苏氨酸激酶和扮演着关键的角色主要是在神经系统发育和生存1]。在神经元的选择性激活noncyclin活化剂p35区域和p39。越来越多的证据表明,CDK5成为细胞死亡中介当其激活p35区域裂解p25 calpain [7,8]。CDK5已经报道的不适当的激活神经元死亡参与一些神经退行性疾病的病理生理学,包括阿尔茨海默氏症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症,帕金森病,prion-related脑病。此外,最近的研究表明,overactivation CDK5是至关重要的是在中风prodeath信号(1]。的积累p25瞬态前脑缺血后激活CDK5和诱发CA1细胞死亡(24]。在新生儿缺氧/缺血损伤大鼠还导致CDK5激活和神经细胞凋亡增加12]。到目前为止超过20的特定底物CDK5已确定,包括许多基质与细胞凋亡有关,如τ,p53、bcl - 2 caspase-3,伯灵顿,(1,25]。p5据报道,特别是抑制CDK5-p25信号通路(12- - - - - -14]。此外,p5减少一个β全身的τhyperphosphorylation和皮质神经元细胞凋亡和减少裂解caspase-3水平和神经细胞凋亡在阿尔茨海默病小鼠模型和大鼠缺氧/缺血损伤模型(12- - - - - -15]。

在目前的研究中,我们检验p5和p5-primed MSC抑制CDK5活动和减少calpain细胞凋亡诱导的内皮细胞的标记。免疫印迹结果表明,Ca^{2 +}离子载体结合CaCl₂治疗增加了p35区域的乳沟的磷酸化水平CDK5 ERK1/2瞬变,和p53表达逐渐在10分钟的治疗而caspase-3被激活在4小时的治疗,比p53之后。更重要的是,仅p5和p5-primed hADMSCs镇压的乳沟p35区域CDK5的磷酸化和p53诱导的upregulation calpain,表明p5-loaded hADMSCs通过抑制p53可保护细胞免受细胞凋亡。p53是一个关键的调制器的细胞应激反应,通过不同的机制被激活。据报道,CDK5与p53和增加其稳定性,防止HMD2-induced p53 ubiquitylation,差别,对这些基因的积累导致p53在神经元25]。CDK5也可能促进p53的功能和p73转录复合体(26]。是否CDK5调节p53转录、平移或转译后的内皮细胞需要进一步调查。此外,先前的研究表明,CDK5保护神经元免受直接交互和激活细胞死亡的凋亡蛋白bcl - 2,通过抑制PC12神经元细胞的持续激活ERK1/2 [1]。然而,pERK1/2水平没有影响p5抑制CDK5在这项研究中,这表明ERK1/2在内皮细胞激活Ca^{2 +}离子载体和CaCl₂独立于CDK5信号处理。自在活的有机体内p5抑制研究活跃caspase-3水平降低缺氧/缺血损伤后24小时内,在阿尔茨海默病小鼠10天,未来的工作将进行评估的长期保护作用p5-primed hADMSCs [12,14]。

5。结论

据我们所知,这是第一个证明,没有任何遗传操纵,间充质干细胞可以被加载在体外小生物活性肽阻塞CDK5多动症。潜在的用于p5-loaded hADMSCs中风和调节细胞生长在癌症等疾病模型需要探索和他们的治疗效果可能进一步研究动物和人类的临床试验。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢教授Alessandri和诉Cocce请提供人类脂肪间充质干细胞(hADMSCs)。这项工作是支持国家教育部的资助,加工中心,UEFISCDI,项目没有。pn - ii - id - pce - 2012 - 4 - 0133。这项研究受到了谢赫阿卜杜拉·本·阿卜杜勒·莫森Al-Tuwaijri中风椅子(SATSC)应用研究中风,Majmaah大学,沙特阿拉伯。作者想表达自己的感激之情哈立德谢赫阿卜杜拉博士Abdul Mohsen Al-Tuwaijri和校长Saad Al兴趣提供必要的支持和帮助在完成这一块的工作。

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